用于跨膜药物递送系统的鞘脂激活蛋白c以及相关蛋白和肽促融合性质的制作方法

专利名称：用于跨膜药物递送系统的鞘脂激活蛋白c以及相关蛋白和肽促融合性质的制作方法
技术领域：
本申请涉及将显像剂和/或治疗剂靶向递送至目的细胞或组织的组合物和方法， 其中将所述试剂包含或否则整合在蛋白质/脂质纳囊泡(nanovesicle)中。更具体地，本发明涉及将显像剂和/或治疗剂靶向递送至目的细胞或组织的组合物和方法，其中将所述试剂包含在蛋白质/脂质纳囊泡中或否则与之整合，所述蛋白质/脂质纳囊泡包含能够靶向细胞膜和递送此类试剂的鞘脂激活蛋白Ckaposin C)蛋白片段。
背景技术：
药物试剂或治疗剂的治疗功效依赖于足够剂量的药物试剂至作用部位的递送。已开发了许多递送模式，包括例如经肠(口服)、胃肠外(肌内、静脉内、皮下)和局部施用。 在大多数情况下，选择施用系统以进行可靠且方便的剂量递送。与药物制剂的经皮肤递送所固有的问题相似，血脑屏障是CNS药物递送的障碍。事实上，血脑屏障被认为是脑药物开发的“瓶颈”，并且可能是对神经病疗法的将来发展的唯一最重要的限制。(Pardridge, W. Μ. , The Blood-Brain Barrier =Bottleneck in Brain Drug Development, The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics,第 2 卷，3—14，Jan, 2005 ；Pardridge, W. Μ. Brain drug targeting the future of brain drug development. Cambridge, UK Cambridge University Press, 2001)。BBB由脑毛细血管内皮形成，其阻止将近100%的大分子(例如单克隆抗体、重组蛋白质、反义或基因治疗剂)和98%以上的所有小分子药物至脑内的运输。虽然CNS活性药物的平均分子量为357道尔顿，甚至更小，但100道尔顿分子例如组胺，当输注入小鼠并且使其散布超过30分钟时，不能通过BBB。事实上，对综合药物化学数据库的评估显示在 7000多种小分子药物中，只有5%治疗CNS，并且该5%只治疗抑郁症、精神分裂症和失眠。因此，大多数药物不能穿过BBB。不幸地，中枢神经系统(CNS)的许多障碍可受益于指向CNS的改良的药物疗法。虽然对已知穿过BBB的试剂进行了相对少的研究，但存在能够预测至CNS内的成功递送的可能性的特征。此类特征是1)400-500道尔顿阈值以下的分子量，和幻高脂溶性。目前，只有4类CNS障碍响应此类分子，包括情感障碍、慢性疼痛和癫痫。偏头痛可以被认为是CNS障碍，也可包括在该范畴内。相反地，患有疾病例如阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿病、A. L. S.、多发性硬化、neuro-AIDS、脑癌、中风、脑或脊髓创伤、自闭症、溶酶体贮积病、脆性X综合征、遗传性共济失调和失明的患者在药物治疗方面选择余地极其有限。(L-D0PA治疗在帕金森患者中已获得一些成功，并且多发性硬化可用作用于外周免疫系统的细胞因子来治疗)(通常参见，Partridge,同上)。在许多上文所列的障碍中，穿过BBB的递送是基因疗法或酶替代疗法的限速问题。许多此类障碍可用已发现的药物、酶或基因治疗。然而，这些药物不能穿过BBB，并且由于该原因而未能被考虑用于治疗用途。由于BBB的不通透性，必须使用将药物递送入CNS 的其他方法。此类方法包括小分子、经颅脑(trans-cranial brain)药物递送和BBB破坏的使用。然而，此类方法无一提供可在大量患者中实际实现的针对BBB问题的解决方案。 (Pardridge, W. M. , ‘ The Blood-Brain Barrier")。鞘脂激活蛋白(小的(约80个氨基酸)热稳定糖蛋白的家族)是鞘糖脂的分解代谢途径中几种溶酶体酶的体内水解活性所必需的(参见Grabowski，G. Α.，Gatt, S.和 Horowitz, Μ. (1990)Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 25，385—414 ；Furst, W.禾口 Sandhoff， K.，(1992)Biochim. Biophys. Acta 1126，1-16 ；Kishimoto, Y.，Kiraiwa, Μ.和 0' Brien, J S. (1992) J. Lipid. Res. 33,1255-1267)。鞘脂激活蛋白家族的4个成员A、B、C和D从单个前体蛋白-鞘脂激活蛋白原(prosaposin)蛋白水解而来(参见Fujikiyashi，S.，Kao, F. T.，Hones, C, Morse, H.，Law, Μ.禾口 Wenger，D. Α. (1985) AmJ. Hum. Genet. 37，741-748 ； 0' Brien, J. S. ，Kretz，K. Α. ，Dewji, N. ，Wenger, D. Α. ，Esch, F.禾口 Fluharty，AL. (1988) Science 241，1098—1101 ；Rorman, E.G.禾口 Grabowski，GA. (1989)Genomics 5,486-492 ； Nakano, Τ. , Sandhoff, K. , Stumper, J. , Christomanou, H 禾口 Suzuki, K. (1989) J. Biochem. (Tokyo)105，152-154 ；Reiner, 0. ，Dagan, 0.禾口 Horowitz，Μ. (1989)J. Mol. Neurosci. 1， 225-233)。已报导了鞘脂激活蛋白A、B、C和D的完整氨基酸序列以及鞘脂激活蛋白原的基因组组织和 cDNA 序列(参见 Fujibayashi，S.，Kao, F. T.，Jones, C, Morse, H, Law, Μ.和 Wenger, D. Α. (1985) Am. J. Hum. Genet. 37,741-748 ；0' Brien, J. S. ， Kretz, K Α. ， Dewji, N.，Wenger, D. A, Esch, F.禾口 Fluharty，A. L. (1988) Science 241，1098—1101 ；Rorman, Ε. G 和Grabowski，G Α. (1989)Genomics 5,486-492) 因起始密码子的突变而导致的鞘脂激活蛋白原的完全缺乏引起与组合溶酶体水解酶缺乏相似的多种鞘糖脂底物的贮积(参见 Schnabel,D. , Schroder,Μ. ,Furst,W. ,Klien,A. ,Hurwitz,R. ,Zenk,Τ. ,Weber, J. ,Harzer, K，Paton，B. C.，Poulos，A.，Suzuki，K和Sandhoff，K (1992)J. Biol. Chem. 267,3312-3315)。鞘脂激活蛋白(Saposin)被定义为鞘脂激活蛋白(sphingolipid activator proteins)或辅酶。在结构上，鞘脂激活蛋白A、B、C和D具有约50-60%的相似性，包括6 个严格保守的半胱氨酸残基(参见Furst，W.和 Sandhoff，K，(1992) Biochim. Biophys. Acta 11 ，1-16)，所述半胱氨酸残基形成其位置(placement)相同的3个结构域内二硫桥(参 JAL Vaccaro, Α. Μ. , Salvioli, R. , Barca, Α. , Tatti, Μ. , Ciaffoni, F. , Maras, B. , Siciliano, R. ，Zappacosta, F. ，Amoresano, Α.禾口 Pucci，P. (1995) J. Biol. Chem. 270，9953—9960)。全部鞘脂激活蛋白包含一个具有保守位置(在N端序列半部分)的糖基化位点，但糖基化不是其活性所必需的(参见 Qi.X.和 Grabowski，G. A. (1998) Biochemistry 37,11544-11554 ； Vaccaro, Α. Μ. , Ciaffoni, F. , Tatti, Μ. , Salvioli, R, Barca, Α. , Tognozzi, D.禾口 Scerch, C. (1995) J. Biol. Chem. 270，30576-30580)。此外，鞘脂激活蛋白A在C端半部分具有第二糖基化位点。当在溶液中时，全部鞘脂激活蛋白和鞘脂激活蛋白样蛋白和结构域包含“鞘脂激活蛋白折叠(saposin fold)”。该折叠是特征在于3个保守二硫化物结构和数个两亲性多肽的多α螺旋束基序。尽管在溶液中存在该共有的鞘脂激活蛋白折叠结构，但鞘脂激活蛋白和鞘脂激活蛋白样蛋白质在增强特异性水解酶降解溶酶体鞘脂(SL)和鞘糖脂(GSL) 方面具有不同的体内生物学功能。由于此类作用，鞘脂激活蛋白在溶酶体鞘脂和鞘糖脂代谢的控制中占据中心位置(参见 Kishimoto, Y.，Kiraiwa, Μ.，和 O' Brien, J. S. (1992) J. Lipid. Res. 33,1255-1267 ；Fujibayashi, S. , Kao, F. Τ. , Hones, C, Morse, H. , Law, M.禾口 Wenger, D. A. (1985)Am. J. Hum. Genet. 37,741-748 ；O' Brien, J. S. ， Kretz, K. Α. ， Dewji, N. , ffenger, D. A. ,Esch, F.和 Fluharty，A. L. (1988)Science 241,1098-1101)。此类鞘脂激活蛋白的结构特征对于不同的活化机制是极其重要的。由于所有此类蛋白具有高序列相似性，但对脂质膜具有不同的作用机制，因此可推测鞘脂激活蛋白和鞘脂激活蛋白样蛋白的特异性生物学功能是与生物膜环境的差异相互作用的结果。在体外，鞘脂激活蛋白A在μΜ浓度上增强酸性β-葡糖苷酶活性，但鞘脂激活蛋白C缺陷导致葡糖神经酰胺贮积和"戈谢病样"表型(参见Schnable, D.，Schroder, Μ.和Sandhoff， K. (1991) FEBS Lett. 284，57-59 ；Rafi. M. A, deGala, G, Zhang, X. L.和 ffenger, D. A. (1993) Somat. Cell Mol. Genet. 19,1"7) 0鞘脂激活蛋白B的激活通过增溶鞘糖脂底物并且将其呈递至溶酶体酶而发生(参见 Furst, W.和 Sandhoff，K.，(1992) Biochim. Biophys. Acta 1126，1-16)。鞘脂激活蛋白C通过在酸性pH下诱导酶构象变化来促进酸性β-葡糖苷酶活性(参见 Berent，S. L.和 Radin，N. S. (1981) Biochim. Biophys. Acta 664,572-582 ； Greenberg, P. , Merrill, Α. H. , Liotta, D. C.禾口 Grabowski, G Α. (1990)Biochim. Biophys. Actal039，12-20 ;Qi. X.和 Grabowski，GA. (1998) Biochemistry 37，11544-11554)。鞘脂激活蛋白C与酶的该相互作用在带负电荷的磷脂表面上发生。体外和离体鞘脂激活蛋白A和 D分别发挥增强半乳糖神经酰胺和神经酰胺/鞘磷脂(sphingomyelin)的降解的功能(参见 Harzer, K. , Paton, B. C. , Christomanou, H. , Chatelut, Μ. , Levade, Τ. , Hiraiwa, M.禾口 O' Brien,JS. (1997)FEBS Let t. 417，270-274 ;Klien，A.，Henseler，M.，Klein，C，Suzuki, K. ，Harzer，K.禾口 Sandhoff，K. (1994)Biochem. Biophys. Res. Commun,200,1440—1448)。 缺乏单独的鞘脂激活蛋白B和C的患者分别显示变异形式的异染性脑白质营养不良 (metachromatic leukodystrophy)禾口戈谢病(参见 Wenger, D. A, DeGala, G, Williams, C, Taylor, H. Α. , Stevenson, R. Ε. , Pruitt, J. R. , Miller, J. , Garen, P. D.禾口 Balentine, J. D. (1989) Am. J. Med. Genet. 33，255-265)(参见 Christomanou，H.，Aignesberger，Α.和 Linke, R.P. (1986)Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367,879—890)。本发明还涉及使用包含鞘脂激活蛋白C的脂质体将显像剂施用穿过细胞膜包括血脑屏障的方法。非侵入性成像技术可用于监控脂质体递送系统的分布和功效，从而促进使用脂质体的基因疗法或治疗性治疗的评估和临床应用。显像剂可使用磁共振、荧光或CT/ PET作为检测手段。然而，成功地使用显像剂监控脂质体递送的主要障碍是检测的容易性、 相关技术的可用性以及递送的容易性和效率。关于使用脂质体递送显像剂，亲脂性分子通常是适当的，虽然本发明不限定于使用此类分子。不希望受理论限制，包含亲脂性部分的亲脂性染料可嵌入脂质体膜或重建入脂质体结构的脂质核心内。本领域内已知的此类染料的实例是吲哚菁(indocarbocyanine)染料Dil。DiI是常规用于标记脂质膜的荧光羰花青染料。其他相似的染料是如Honig， Μ. G.等人，DiI and DiO-versatile fluorescent dyes for neuronal labeling and pathway tracing. Trends Neurosci. 12 :333-335, 340-331，1989 中描述的 DiA 或 DiaO。 可用于本发明的其他亲脂性染料包括PKH2、NeuroVue GreeruPKH 26、NeuroVue Red和 NeuroVue Maroon,如由 Fritzsch,等人Diffusion and Imaging proerties of Three New Lipophilic Tracers, NeuroVue Maroon, NeuroVue and Neurovue Green and their use for Double and Triple Labeling of Neuronal Profile，手稿中所描述的。此类染料中的任意染料可单独地或组合地用于本文中描述的本发明。也用于本领域的并且适合于本发明的是具有两个或更多个成像性质的显像剂。此类试剂使得研究者或临床医生能够使用多种成像方法来检测施用的显像剂。此类试剂的实例是如由 Li, H.,等人，MR and Fluorescent Imaging of Low-Density Lipoprotein Receptors, Acad Radiol. 2004 ；11 :1251-1259 (通过引用并入本文)描述的所谓的 PTIR 染料。此类染料包含允许通过磁共振成像(MRI)或共聚焦荧光显微镜检测的荧光团和 Gd(III)部分。亲脂性侧链促进染料至磷脂单分子层内的嵌入。因此，此类染料适合用于脂质体递送系统例如本文中描述的脂质体递送系统。质子MR成像提供了下述优点非侵入性、断层照相(tomographic)和高分辨率。近年来，磁共振成像(MRI)已显露为临床环境中的强大工具，因为其为非侵入性的并且产生受试者的精确的体绘制(volume rendering)。通常参见，美国专利No. 6，962，686，Kayyem， 等人，标题为Cell-specific gene delivery vehicles。此类有利方面使得MRI在医学成像和作为用于生物学实验的成像工具中成为选择的技术。与基于染料或荧光染剂的使用的光学显微镜成像技术不同，MRI不产生有毒的光漂白副产物。此外，与光学显微镜检查不同， MRI不受对约只有100微米的表面内的细胞的光散射或其他光学像差的限制。具有MRI性质的试剂例如上述的那些可用于本发明。因此，存在对可促进药物或显像剂穿过或通过生物膜包括血脑屏障的递送或运输的无毒试剂的显著需要。本发明满足这些需要。发明_既述本发明涉及将试剂例如药物或治疗剂递送穿过生物膜的组合物和方法，其中所述试剂包含在磷脂膜内或嵌入其中，并且通过膜融合蛋白促进递送。更具体地，本发明涉及用于增强试剂穿过皮肤和粘膜的膜或血脑屏障和/或在皮肤和粘膜的膜或血脑屏障中的运输和递送的组合物和方法，其中所述试剂包含在脂质体中，并且使用与脂质体缔合的鞘脂激活蛋白C促进递送。如本文中所描述的，本发明包括用于递送药物试剂通过生物膜包括血脑屏障和细胞膜的组合物和方法，其中所述方法包括对膜施用组合物，所述组合物在药学上可接受的载体中包含阴离子磷脂(具有或不具有中性磷脂)、包含在磷脂中的安全和有效量的药物试剂以及源自鞘脂激活蛋白原的促融合蛋白或多肽。在一个实施方案中，阴离子磷脂膜是囊泡。在另一个实施方案中，囊泡是脂质体。 脂质体是一种形式的纳米容器，例如纳米颗粒或脂质体，通常用于封装药物。也可使用阳离子磷脂，只要所得的脂质体的总电荷是负的。在本发明的另一个实施方案中，蛋白质-脂质组合物的PH是酸性的。在本发明的另一个实施方案中，组合物的PH在约6. 8至2之间。在本发明的另一个实施方案中，组合物的PH在约5. 5至2之间。在另一个实施方案中，pH在约5. 5至约3. 5之间。在另一个实施方案中，以干燥形式例如粉剂提供蛋白质和脂质组合物。在另一个实施方案中，用酸处理蛋白质和脂质组合物的干燥形式。在一个实施方案中，所述酸是酸性缓冲液或有机酸。在另一个实施方案中，以足以质子化至少一部分蛋白质的水平加入酸，其中组合物具有约5. 5至约2的pH。在另一个实施方案中，以足以大体上质子化蛋白质的水平加入酸，其中组合物具有约5. 5至约2的pH。在另外的实施方案中，然后大体上中和已用足以质子化至少一部分蛋白质的酸处理的蛋白质和脂质组合物的干粉的pH。在一个实施方案中，用中性pH缓冲液中和pH。在一个实施方案中，用足以控制所得的脂质体的大小的中性PH缓冲液中和pH。在另一个实施方案中，用足以控制所得的脂质体的大小(以提供具有约200纳米的平均直径的脂质体)的中性PH缓冲液中和pH。在另一个实施方案中，脂质体具有50至350纳米的平均直径。在另一个实施方案中，脂质体具有150至250纳米的平均直径。在另一个实施方案中，向组合物中加入缓冲液以提供约5至约14，优选约7至14，更优选约7至约12，更优选约7至约 10和更优选约8至约10的终组合物pH。在本发明的一个实施方案中，使用短链脂质。通常，促融合蛋白或多肽的浓度是足以将药物试剂递送入膜和/或递送穿过膜的量。在另一个实施方案中，体外膜中磷脂的浓度按摩尔比计算相对于促融合蛋白或多肽的浓度至少5倍过量。在另一个实施方案中，体外膜中磷脂的浓度按摩尔比计算相对于促融合蛋白或多肽的浓度至少10倍过量。在另一个实施方案中，体外膜中磷脂的浓度按摩尔比计算相对于促融合蛋白或多肽的浓度至少15 倍过量。在一个实施方案中，体外膜中磷脂的浓度按摩尔比计算相对于促融合蛋白或多肽的浓度至少20倍过量。在另一个实施方案中，体外膜中磷脂的浓度按摩尔比计算相对于促融合蛋白或多肽的浓度约10倍至约50倍过量或约20至约30倍过量。在一个实施方案中，体内或细胞膜系统中磷脂的浓度按摩尔比计算相对于促融合肽的浓度至少1倍过量。在一个实施方案中，体内或细胞膜系统中磷脂的浓度按摩尔比计算相对于促融合肽的浓度至少2倍过量。在另一个实施方案中，体内或细胞膜系统中磷脂的浓度按摩尔比计算相对于促融合肽的浓度至少3倍过量。在另一个实施方案中，体内或细胞膜系统中磷脂的浓度按摩尔比计算相对于促融合肽的浓度约1至约10倍过量或约3 至7倍过量。不希望以任何方式受理论束缚，据认为膜融合蛋白与磷脂膜通过静电及疏水性与疏水性相互作用而缔合，并且脂质组合物总电荷为负。根据本发明，被靶向的生物膜包括但不限于皮肤的膜(dermal membrane)、粘膜的膜、血脑屏障和细胞膜。优选的膜融合蛋白包括鞘脂激活蛋白C以及源自任一鞘脂激活蛋白C(SEQ. ID. NO. 1至13)的其他蛋白质、多肽类似物或多肽，以及其混合物。在一个实施方案中，膜融合蛋白包含选自鞘脂激活蛋白C(SEQ. ID. NO. 1和SEQ. ID. NO. 2)的序列的至少8、10、12、14、16、18、20、22、对或更多个连续氨基酸。在一个实施方案中，膜融合蛋白包含下式的肽h-u-Cys-Glu-h-Cys-Glu-h-h-h-Lys-Glu-h-u-Lys-h-h-Asp-Asn-Asn-Lys-u-Glu-Lys-Glu-h-h-Asp-h-h-Asp-Lys-h-Cys-u-Lys-h-h其中h =疏水性氨基酸，包括Val、Leu、lie、Met、Pro、Phe和Ala ；并且其中u = 不带电荷的极性氨基酸，包括Hir、Ser, Tyr、Gly、Gln和Asn，和其混合物。在另一个实施方案中，膜融合蛋白包括选自源自任一鞘脂激活蛋白C(SEQ. ID. NO. 1或SEQ. ID. NO. 2)的其他蛋白质、多肽类似物或多肽的一种或多种蛋白质，可使用下式的多肽h-u-Cys-Glu-h-Cys-Glu-h-h-h-Lys-Glu-h-u-Lys-h-h-Asp-Asn-Asn-Lys-u-Glu -Lys-Glu-h-h-Asp-h-h-Asp-Lys-h-Cys-u-Lys-h-h,其中h =疏水性氨基酸，包括Val、Leu、lie、Met、Pro、Phe和Ala ；并且其中u = 不带电荷的极性氨基酸，包括Hir、Ser, Tyr、Gly、Gln和Asn，和其混合物。在一个实施方案中，膜融合蛋白包含如下序列的至少8、10、12、14、16、18、20、22、 24、30或更多个连续氨基酸Ser Asp Val TyrCys Glu Val Cys Glu Phe Leu Val Lys Glu Val Thr Lys Leu lie AspAsn Asn Lys Thr Glu Lys Glu lie Leu Asp Ala Phe Asp Lys Met CysSer Lys Leu Pro。膜融合蛋白包含如下序列的至少 8、10、12、14、16、18、20、22、M、 30 或更多个连续氨基酸Val Tyr Cys Glu ValCys Glu Phe Leu Val Lys Glu Val Thr Lys Leu lie Asp Asn Asn LysThr Glu Lys Glu lie Leu Asp Ala Phe Asp Lys Met Cys Ser Lys LeuPro0在另一个实施方案中，膜融合蛋白包含序列Ser Asp Val Tyr CysGlu Val Cys Glu Phe Leu Val Lys Glu Val Thr Lys Leu lie Asp AsnAsn Lys Thr Glu Lys Glu Ile Leu Asp Ala Phe Asp Lys Met Cys SerLys Leu Pro。在另一个实施方案中，膜融合蛋白包含序列Val Tyr CysGlu Val Cys Glu Phe Leu Val Lys Glu Val Thr Lys Leu lie Asp AsnAsn Lys Thr Glu Lys Glu lie Leu Asp Ala Phe Asp Lys Met Cys SerLys Leu Pro。 在另一个实施方案中，膜融合蛋白为22聚体，包含序列CEFLVKEVTKLIDNNKTEKEIL。在另一个实施方案中，膜融合蛋白包括鞘脂激活蛋白C。在另一个实施方案中，膜融合蛋白包括根据已知的方法(具体参见，J. M. Shaw,op. cit ；Basu等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 73,3178-3182(1976) ;J. Steinbrechert, Biol. Chem. 262,3703(1987))修饰产生的氧化、乙酰化(例如，甲酰化和乙酰化)、乙酰乙酰化或乳糖化(lactosylated)形式的鞘脂激活蛋白C。 在一个实施方案中，磷脂纳囊泡是包含药物试剂的阴离子脂质体。在另一个实施方案中，脂质体由包含阴离子长链脂质的任意脂质混合物制成。在另一个实施方案中，脂质体由包含阴离子长链脂质、中性长链脂质和中性短链脂质的混合物制成，其中所得的脂质体的总电荷是负的。在选择用于制备本发明中使用的纳囊泡的脂质时，发现众多的脂质适合于构建它们。特别有用的是本领域技术人员已知适合于脂质体制备的任何材料或其组合。使用的脂质可以是天然、合成或半合成来源的脂质。在另一个实施方案中，纳囊泡由一种或多种生物相容性脂质制成。在另一个实施方案中，生物相容性脂质选自脂肪酸、溶血脂质(Iysolipid)、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、 磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、鞘脂、糖脂(glycolipid)、糖脂(glucolipid)、硫苷脂(sulfatides)、鞘糖脂、磷脂酸、棕榈酸、硬脂酸、花生四烯酸、油酸、具有聚合物的脂质、具有磺化单糖的脂质、具有磺化二糖的脂质、具有磺化寡糖的脂质、具有磺化多糖的脂质、胆固醇、生育酚、具有醚连接的脂肪酸的脂质、具有酯连接的脂肪酸的脂质、聚合的脂质、二乙酰磷酸酯、磷酸双十六烷酯、硬脂酰胺、心磷脂、具有长度为6至8个碳的脂肪酸的磷脂、具有不对称酰基链的合成的磷脂、神经酰胺、非离子脂质、固醇脂肪族酸酯(sterol aliphatic acid esters)、糖酸的固醇酯、糖酸的酯、糖醇的酯、糖的酯、脂肪族酸的酯、皂苷、二月桂酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、二棕榈酸甘油酯、甘油、甘油酯、长度为10至30个碳的醇、6-(5-胆留烯-3 β-基氧)-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷、二半乳糖甘油二酯、 6- (5-胆甾烯-3 β -基氧)己基-6-氨基-6-脱氧-1-硫代-β -D-吡喃半乳糖苷、6- (5-胆甾烯-3β-基氧)己基-6-氨基-6-脱氧-1-硫代-a-D-卩比喃甘露糖苷、12-( ((7' -二乙氨香豆素-3-基)羰基)甲氨基)_十八烷酸、N-[12-(((7' - 二乙氨香豆素-3-基)羰基) 甲基氨基)十八酰基]-2-氨基棕榈酸、胆留醇基-三甲基-铵基)丁酸酯、N-琥珀酰二油酰磷脂酰乙醇胺、1，2- 二油酰基-sn-甘油、1，2- 二棕榈酰-sn-3-琥珀酰甘油、1，3- 二棕榈酰-2-琥珀酰甘油、1-十六烷基-2-棕榈酰甘油磷酸乙醇胺、棕榈酰高半胱氨酸、阳离子脂质、N- [1- (2，3- 二油酰基氧)丙基]-N, N, N-三甲基氯化铵、1，2- 二油酰基氧_3_ (三甲基铵基)丙烷、1，2-二油酰基氧-3-(4'-三甲基-铵基)丁酰基-sn-甘油、溶血磷脂、 溶血磷脂酸(lysobisphosphatidic acid，LBPA)、半-溶血磷脂酸(semi-LBPA)、心磷脂、具有阳离子聚合物的脂质、膦酸烷基酯、次磷酸烷基酯(alkyl phosphinate)和亚磷酸烷基酯 (alkyl phosphite)0在一个实施方案中，磷脂酰胆碱选自二油酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、 双十五酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱; 其中磷脂酰乙醇胺选自二棕榈酰磷脂酰乙醇胺和二油酰磷脂酰乙醇胺；其中鞘脂是鞘磷脂；其中糖脂选自神经节苷脂GMl和神经节苷脂GM2 ；其中在携有聚合物的脂质中，所述聚合物选自聚乙二醇、壳多糖、透明质酸和聚乙烯吡咯烷酮；其中固醇脂肪族酸酯选自胆固醇硫酸酯、胆固醇丁酸酯、胆固醇异丁酸酯、胆固醇棕榈酸酯、胆固醇硬脂酸酯、羊毛固醇乙酸酯、麦角固醇棕榈酸酯和植物留醇正丁酸酯；其中糖酸的固醇酯选自胆固醇葡糖苷酸酯、羊毛固醇葡糖苷酸酯、7-脱氢胆固醇葡糖苷酸酯、麦角固醇葡糖苷酸酯、胆固醇葡糖酸酯、羊毛固醇葡糖酸酯和麦角固醇葡糖酸酯；其中糖酸的酯和糖醇的酯选自月桂酰葡糖苷酸酯、 硬脂酰葡糖苷酸酯、肉豆蔻酰葡糖苷酸酯、月桂酰葡糖酸酯、肉豆蔻酰葡糖酸酯和硬脂酰葡糖酸酯；其中糖的酯和脂肪族酸的酯选自蔗糖月桂酸酯、果糖月桂酸酯、蔗糖棕榈酸酯、蔗糖硬脂酸酯、葡糖醛酸、葡糖酸、accharic acid和聚糖醛酸；其中皂苷选自萨尔萨皂苷元 (sarsasapogenin)、异菝葜阜试元(smilagenin)、常春藤阜试元(hederagenin)、齐墩果酸 (oleanolic acid)和洋地黄毒甙配基(digitoxigenin)；其中甘油酯选自三棕榈酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、二肉豆蔻酸甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯；其中醇是长为10至30个碳的醇并且选自正-癸醇、月桂醇、肉豆蔻醇、鲸蜡醇和正-十八醇；其中在携有阳离子聚合物的脂质中，阳离子聚合物选自多聚赖氨酸和多聚精氨酸。在另一个实施方案中，脂质选自二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺和二棕榈酰磷脂酸。在另一个实施方案中，脂质体内包含的药物制剂包括生物分子和/或有机分子。 该技术可用于美容和医学应用，其中目的是将活性剂递送穿过膜例如皮肤的膜、粘膜的膜、血脑屏障或细胞膜。本发明还涉及通过将大分子例如基因、蛋白质和其他生物分子或有机分子运输穿过血脑屏障来治疗疾病的方法，其中所述方法包括施用组合物，所述组合物包含阴离子脂质体(具有或不具有短链脂质)、包含在脂质体中的安全且有效量的大分子治疗剂和鞘脂激活蛋白C。在其他实施方案中，本发明描述了组合物，所述组合物包含与鞘脂激活蛋白促融合膜或脂质体混合或复合的或缀合至其的小核酸分子例如短干扰核酸(siNA)、短干扰 RNA (siRNA)、双链 RNA (dsRNA)、micro-RNA (mRNA)或短发夹 RNA (shRNA)。本发明还涉及可治疗如下疾病的方法成神经细胞瘤、大脑炎症(cerebral inflammation)、异染性脑白质营养不良(MLD) jiemarm-Pick、中风、帕金森病、阿尔茨海默氏病、脱髓鞘障碍(demyelination disorder)、视网膜神经病(retinal neuropathy)、亨廷顿病、A. L. S.、多发性硬化、neuro-AIDS、脑癌、脑或脊髓创伤、自闭症、溶酶体贮积病、脆性 X综合征、遗传性共济失调和失明，其中所述方法包括产生脂质体递送系统的步骤，在所述脂质体递送系统中，脂质体包含酸性长链脂质(加入或不加入中性长链脂质和中性短链脂质)以及鞘脂激活蛋白C、鞘脂激活蛋白原和源自鞘脂激活蛋白C或鞘脂激活蛋白原的其他蛋白质、多肽类似物或多肽。脂质体可包含治疗剂例如抗炎剂、抗细胞凋亡剂和神经保护药、或酶、蛋白质、或相应的基因、鉴定为在此类疾病中缺乏的基因的DNA或RNA序列。在一个实施方案中，提供了组合物和方法，其包含与促融合阴离子磷脂膜或脂质体、源自鞘脂激活蛋白原的促融合蛋白或多肽以及药学上可接受的载体组合的多核苷酸或其前体。在一个实施方案中，提供了包含与促融合阴离子磷脂膜或脂质体、源自鞘脂激活蛋白原的促融合蛋白或多肽以及药学上可接受的载体组合的短干扰核酸(siNA)或其前体的组合物和方法。在本发明的新型组合物内，可将siNA与促融合阴离子磷脂膜或脂质体(具有源自鞘脂激活蛋白原的促融合蛋白或多肽)组合或复合或缀合至其，以形成增强 siNA的细胞内递送的组合物。本发明还包括用于治疗戈谢病的组合物和方法，其中所述方法包括施用组合物， 所述组合物包含全都包含在药学上可接受的载体中的阴离子脂质体、包含在脂质体内的安全且有效量的酸性β -葡糖苷酶以及鞘脂激活蛋白C，其中组合物的ρΗ为约7、6. 8、6. 5、6、 5. 9,5. 8,5. 7,5. 6,5. 5,5. 4,5. 3,5. 2,5. 1,5. 0或更低并且鞘脂激活蛋白C通过静电和疏水相互作用与脂质体的表面缔合。通常，脂质体的浓度相对于鞘脂激活蛋白C的浓度约1至 10倍过量。在一个实施方案中，组合物的PH低于约6. 8。在另一个实施方案中，组合物的 PH低于约6.0。在另一个实施方案中，组合物的ρΗ低于约5.5。在另一个实施方案中，组合物的PH低于约5.0。本发明还涉及用于治疗派尔集合淋巴结(Peyer' s patches)、肠系膜淋巴结、支气管淋巴结的组合物和方法，其中所述方法包括组合物的施用，所述组合物包含阴离子长链脂质、长链中性脂质和/或中性短链脂质、安全且有效量的脂质、DNA或蛋白质抗原、鞘脂激活蛋白C、鞘脂激活蛋白原以及源自鞘脂激活蛋白C或鞘脂激活蛋白原的其他蛋白质、多肽类似物或多肽。本发明还涉及对组织和细胞成像的组合物和方法，其中所述组合物包含含有鞘脂激活蛋白C的脂质体和可检测的显像剂，所述可检测的显像剂选自MRI可检测的试剂、荧光试剂、CT/PET可检测的试剂、具有多个检测性质的试剂或其组合。可将试剂嵌入脂质膜或封装入脂质体内。在本发明的另一个实施方案中，鞘脂激活蛋白C脂质体复合物可掺入1、2 或3种具有不同成像性质的不同的试剂，以便可将多种不同的检测方法用于鞘脂激活蛋白 C脂质体的单次施用。其他辅助试剂包括荧光团(例如荧光素、丹磺酰基、量子点等)和红外染料 (infrared dye)或金属，其可用于光学或光成像(例如，共聚焦显微术和荧光成像)。在另一个实施方案中，组合物还包含放射性核素、螯合剂、生物素、荧光团、抗体、 辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、纳米颗粒、量子点、抗癌剂的纳米滴(nanodroplet)、抗癌剂或化学治疗剂、脂质体药物、细胞因子或连接至其的小分子毒素。在另一个实施方案中，显像部分选自放射性核素、生物素、荧光团、抗体、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、纳米颗粒、量子点、可检测的抗癌剂的纳米滴、脂质体药物和细胞因子。本领域技术人员熟悉将放射性核素、螯合剂和螯合剂-接头缀合物连接至本发明的配体的组合物和方法。具体地，放射性核素、螯合剂和螯合剂-接头缀合物至本发明的配体的连接可使用例如商购可得的双功能连接基团(通常异双功能连接基团)来方便地实现，所述双功能连接基团可连接至存在于化合物上的非干扰位置上的官能团，然后可进一步连接至例如放射性核素、化学治疗剂、抗癌剂、纳米颗粒、量子点、抗癌剂的纳米滴或小分子毒素。利用这种方式，本发明的化合物可用于将适当的试剂运送至靶位点，通常肿瘤或具有癌细胞的器官或组织。在另一个实施方案中，通过将生物素化的配体与链霉抗生物素蛋白 Qdot605 (Quantum Dot Corp. ；Hayward, Calif) 一起温育来制备配体 Qdot 复合物。在本发明的一个实施方案中，包含可追踪的显像剂的脂质体可用于靶向肿瘤例如成神经细胞瘤，从而允许测定肿瘤大小、生长、位置或转移。本发明的上述概述不意欲描述本发明的每一个实施方案或每一个实现。通过参考下列详细描述和权利要求以及附图，本发明的有利方面和成就以及更全面的理解将变得显然和易于理解。在整个说明书中，除非另外指出，否则所有温度以摄氏度给出，并且所有百分比是重量百分比。本文中提及的全部出版物为了描述和公开可与当前公开的发明结合使用的组合物和方法(所述组合物和方法描述于出版物中)的目的，通过引用合并入本文。本文中论述的出版物仅是为了揭示在本申请的申请日之前的背景技术，这些背景技术不应解释为承认在先发明揭示了本发明。附图概述权利要求中所定义的本发明可通过参考下列附图得到更好的理解。附图不必按按比例绘制，而是将重点放在清楚地举例说明本发明的原理。

图1 鞘脂激活蛋白C诱导的融合的Clip-on模型脂质体结合的鞘脂激活蛋白C 通过疏水相互作用彼此夹住(clip)，并诱导脂质体融合。图2 鞘脂激活蛋白C与脂质体囊泡的缔合脂质体结合的鞘脂激活蛋白C中发现的鞘脂激活蛋白折叠的构象改变。鞘脂激活蛋白C的膜拓扑相互作用表明，氨基和羧基端上的两亲性螺旋包埋在脂双分子层中并且鞘脂激活蛋白C的中间区域暴露于水相。鞘脂激活蛋白C的中间区域暴露于水相。图3 鞘脂激活蛋白C的神经轴突生长性(neuritogenic)、酸性β葡糖苷酶激活和脂质结合性质的功能组织的示意图。除了标示预测的转角和二硫键的框外，图不意味着代表已知的物理结构。残基22至32对于神经营养性作用是极其重要的。横跨残基42至 61的区域对于鞘脂激活蛋白C的酸性β -葡糖苷酶激活效应是至关重要的，全部3个二硫键的存在对于该功能也是非常重要的。此外，高级结构是具有鞘脂激活蛋白C的完全活性所必需的。脂质/脂质膜相互作用区域位于NH2-和COOH-端区域。图4:由Ca2+(a)或鞘脂激活蛋白C (b)在pH 4. 7或7. 4诱导的BPS (脑磷脂酰丝氨酸)脂质体的大小变化。中等自相关函数(Fair autocorrelation function), dust = 0.0%，基线误差< 1%，室温。图5. NBD-DOPS和鞘脂激活蛋白C至小鼠脑的小脑的转运。通过FBV/N成年小鼠的尾静脉施用NBD-DOPS-鞘脂激活蛋白C蛋白脂质体(A、C、D)和PBS(B、E、F)。在注射后 48小时制备冷冻小脑切片。使用显微镜(Zeiss Axioskop,100X)显现用于检测(A)和(B) 中的DOPS的NBD绿色荧光。在共聚焦显微镜(LSM510，Zeiss)下使用于检测浦肯野细胞 (Purkinje cell)中的鞘脂激活蛋白C (D和F)的NBD绿色荧光(C和E)和抗His抗体(罗丹明缀合的二抗，红色荧光)成像。条棒(Bar) 20 μ m(C-F)。术语p =浦肯野细胞；g = 颗粒细胞。图6. 85中的？111 -271 (201^)/鞘脂激活蛋白(-00 5蛋白脂质体(图7A)和PBS 中的PTIR-316 (20 μ M)/SapC-DOPS蛋白脂质体(图7Β)的荧光光谱。图7.包含PTIR-271和PTIR-316的鞘脂激活蛋白-C-D0PS至人成神经细胞瘤细胞(CHLA-20)内的摄取。图8Α和8Β显示当由SapC-DOPS脂质体递送时PTIR-271的摄取。图8C和8D显示当由SapC-DOPS脂质体递送时PTIR-316的摄取。对照脂质体(用无 PTIR-271或PTIR-316的SapC-DOPS脂质体处理)示于图8E和8F中。红色图像代表染料的摄取。使用Zeiss Axiovert-ApoTome显微镜(63X和40X油镜)进行可视化:入EX/入EM ; 分束器(Beam splitter) :660 ；细胞形态学的 B/W 相衬(phase contrast)。Axiovision 软件用于成像。图 8.使用 Sap-C-DOPS 脂质体将 GFP22siRNA 递送至 EGFP 4T1 细胞内。GFP22siRNA 为特异性抑制绿色荧光蛋白基因表达的22个核苷酸的双链RNA。(NJ Caplen等人，PNAS， 2001,98 =9742-9747)。温育时间为72小时。20x，800毫秒的暴光；Photoshop 输入水平 27，1. 19，164 ；输出水平255。大小3X2.四英寸。图9A和9C代表含有GFP22siRNA的脂质体；图9B和9D代表其中使用不影响GFP表达的非沉默siRNA(由22个核苷酸的双链RNA 片段组成)的阴性对照。全部RNA购自QIAGEN。图9. GFP 22siRNA至成神经细胞瘤(CHLA-20)癌细胞内的递送的显微照片，其显示(a)罗丹明-GFP22siRNA ； (b)相衬和(c)合并的(merged)照片。在示例性实施方案的下列描述中，参考附图，所述附图形成本申请的一部分，并且其中通过举例说明可实践本发明的各种实施方案来显示。应理解，可使用其他实施方案，并且可进行结构和功能改变而不背离本发明的范围。发明详述在描述本组合物和方法之前，应理解本发明不限定于特定的方法、装置和制剂，因为这些，当然，可以进行变化。也应理解，本文中使用的术语只是为了描述特定实施方案，而不是意欲限定本发明的范围，本发明的范围只受所附权利要求的限定。必须指出，如本文中和所附权利要求中所使用的，除非上下文明确地指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“这个”、“这种”包括复数所指物。除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的技术人员通常理解的意义相同的意义。虽然与本文中描述的那些相似或等同的任何方法、装置和材料可用于实践或测试本发明，但现在描述优选方法、装置和材料。定义术语“施用的”和“施用，，通常是指对患者施用生物相容性材料，包括，例如，脂质和/或囊泡组合物和清洗剂(flush agent) 0因此，“施用的”和“施用”是指，例如向血管内注射脂质和/或囊泡组合物和/或清洗剂。术语“施用的”和“施用”还可指递送脂质和 /或囊泡组合物和/或清洗剂至目的区域。如本文中所使用的，术语“氨基酸”或“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列或任何这些序列的片段，和指天然存在的或合成的分子。当“氨基酸序列”在本文中用于指天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列时，“氨基酸序列”和类似的术语并不表示将氨基酸序列限定于与所述蛋白质分子相关的完全天然的氨基酸序列。术语"两亲性脂质"意指具有亲水性“头部”基团和疏水性“尾部”基团并且具有形成膜的能力的分子。如本文中所使用的，术语"阴离子磷脂膜"和"阴离子脂质体"是指包含脂质成分并且在生理PH下具有总体负电荷的磷脂膜或脂质体。“阴离子磷脂"意指具有负电荷的磷脂，包括磷酸酯、硫酸酯和基于甘油的脂质。“生物活性剂”是指这样的物质，所述物质可用于性质上为诊断或治疗的应用，例如用于用来诊断疾病在患者中的存在或不存在的方法和/或用来治疗患者的疾病的方法。 如本文中所使用的，“生物活性剂”还指能够在体外和/或体内发挥生物学效应的物质。生物活性剂可以是中性的或带正电荷或带负电荷的。合适的生物活性剂的实例包括诊断剂、 药物制剂、药物、合成的有机分子、蛋白质、肽、维生素、类固醇和遗传物质，包括核苷、核苷酸和多核苷酸。术语"包含在......中(内)"是指药物试剂被包封在磷脂膜中，以便保护药物
试剂免受外部环境损害。该术语可与“封装”互换使用。“缺失”，如该术语在本文中所使用的，是指导致一个或多个氨基酸残基或核苷酸的不存在的氨基酸或核苷酸序列的变化。术语“衍生物”，如本文中所使用的，是指多肽序列或多核苷酸序列的化学修饰。多核苷酸序列的化学修饰可包括，例如，用烷基、酰基或氨基取代氢。衍生的多核苷酸编码保持天然分子的至少一个生物学功能的多肽。衍生的多肽是例如通过糖基化或任何其他方法修饰的多肽，所述衍生的多肽保留其所源自的多肽的至少一个生物学功能。术语“促融合蛋白或多肽”，如本文中所使用的，是指当加入至两个分开的双分子层膜时可使它们融合成单个膜的蛋白质或肽。促融合蛋白迫使细胞或模型膜紧密接触并且使它们融合。如本文中所使用的，术语“插入”或“添加”是指氨基酸或核苷酸序列中分别导致一个或多个氨基酸残基或核苷酸至天然存在的分子中发现的序列的添加的变化。术语“脂质”和“磷脂”可互换使用并且是指包含脂质、磷脂或其衍生物的结构，包括已知的脂质在水性悬浮液中采用的多种不同结构排列。此类结构包括但不限于脂双分子层囊泡、微团、脂质体、乳液、囊泡、脂质带(lipid ribbon)或脂质片(lipid sheet) 0在优选实施方案中，脂质是阴离子脂质体。脂质可单独使用或以本领域技术人员用于提供特定应用所期望的特征的任何组合使用。此外，脂质构建和脂质体形成的技术方面在本领域内是熟知的并且本领域内常用的任何方法可用于本发明。“脂质组合物”是指通常在水性介质中包含脂质化合物的组合物。示例性脂质组合物包括悬浮液、乳液和囊泡组合物。“脂质制剂”是指还包含生物活性剂的脂质组合物。“脂质体”是指两亲性化合物(包括脂质化合物)的通常球形的群集体(cluster) 或聚集体，其通常以一层或多层同心层例如双分子层的形式存在。它们在本文中还可称为月旨囊泡(lipid vesicle) ο术语“长链脂质”是指碳链长度为大约13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或M
的脂质。在一个实施方案中，链长度选自18、19或20的链长度。可用于本发明的脂质的实例可在网址www. avantilipids. com上获得。可用于本发明的长链脂质的代表性实例包括但不限于下列脂质14 OPS 1，2- 二肉豆蔻酰—sn—甘油 _3_ [磷酸-L-丝氨酸](钠盐)(DMPS) ； 16 OPS 1，2_ 二棕榈酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)(DPPQ ；17:0PS 1，2_双十七酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)；18:0PS 1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)(DSPS) ； 18: IPS 1，2- 二油酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)(DOPS) ； 18:2PS 1，2-二亚油酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)；20:4PS1, 2- 二花生四烯酰-sn-甘油_3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)；22:6PS1，2-双二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)；16:0-18: IPS 1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)(P0PQ ； 16:0-18:2PS 1_棕榈酰_2_亚油酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)；16:0-22:6PS 1-棕榈酰-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)；18:0-18: IPS 1_硬脂酰_2_油酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)；18 0-18 2PS 1-硬脂酰-2-亚油酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)；18:0-20:4PS 1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)；18:0-22:6PS 1-硬脂酰-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)；16: OPC 1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC) ； 17: OPC 1，2-双十七酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；18:OPC 1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC) ；16: IPC(顺)1， 2- 二棕榈油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；16 1 反 PC 1，2-Dipalmitelaidoyl-sn-甘油-3-磷酸胆碱；18 IPC Δ 6 (顺)1，2-Dipetroselinoyl-sn-甘油-3-磷酸胆碱；18 2PC (顺)1， 2- 二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；18 3PC (顺)1，2- 二亚麻酰-sn-甘油_3_磷酸胆碱； 20 IPC (顺)1，2-Dieicosenoyl-sn-甘油-3-磷酸胆碱；22 IPC (顺)1，2-Dierucoyl-sn-甘油-3-磷酸胆碱；22:0PC 1，2-二山嵛酰-sn-甘油_3_磷酸胆碱；24: IPC(顺)1，2-二神经酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；16:0-18: OPC 1-棕榈酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；16 0-18 IPC 1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；16 0-18 2PC 1-棕榈酰-2-亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；18 0-18 IPC 1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；18:0-18:2PC1-硬脂酰-2-亚油酰-sn-甘油_3_磷酸胆碱；18:1-18:OPC 1-油酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；18:1-16: OPC 1-油酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；18:0-20:4PC 1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油_3_磷酸胆碱；16:0-18: IPG
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(l-甘油)](钠盐)(POPG)； 18: IPG 1，2_ 二油酰-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(l-甘油)](钠盐)(DOPG) ； 18: IPA 1，2_ 二油酰-sn-甘油-3-磷酸盐(一钠盐)(DOPA) ；18: IPI 1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸肌醇(铵盐)； 16:0(D31)-18:1PI 1_ 棕榈酰(D31)-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸肌醇(铵盐)；18: IPE 1，
2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)； 18:2PE 1，2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺。如本文中所使用的，术语“核酸”或“核酸序列”是指核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸或其任何片段。“核酸”是指至少两个碱基-糖-磷酸组合的串。(多核苷酸与寡核苷酸区别在于其包含120个以上的单体单位)。核苷酸是核酸聚合物的单体单位。该术语包括脱氧核糖核酸(DNA)和以寡核苷酸信使RNA形式存在的核糖核酸(RNA)、反义核酸、质粒DNA、 质粒DNA的部分或来源于病毒的遗传物质。反义核酸是干扰DNA和/或RNA功能的多核苷酸。术语核酸是指至少两个碱基-糖-磷酸组合的串。天然核酸具有磷酸主链，人工核酸可包含其他类型的主链，但包含相同的碱基。核苷酸是核酸聚合物的单体单位。该术语包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。RNA可以以tRNA(转运RNA)、siRNA(短干扰核糖核酸)、snRNA (核内小RNA)、rRNA (核糖体RNA)、mRNA (信使RNA)、反义RNA和核酶的形式存在。DNA可以以质粒DNA、病毒DNA、线性DNA或染色体DNA或这些种类的衍生物的形式存在。此外，此类形式的DNA和RNA可以是单链的、双链的、三链的或四链的。该术语还包括PNA (肽核酸)、SiNA (短干扰核酸)、硫代磷酸酯和天然核酸的磷酸酯主链的其他变体。如本文中所使用的，术语“基于核苷酸的药物试剂”或“基于核苷酸的药物”是指包含核苷酸、寡核苷酸或核酸的药物试剂或药物。“患者"或"受试者"是指动物，包括哺乳动物，优选人。如本文中所使用的，“药物试剂或药物”是指当对患者适当施用时能够诱导期望的治疗效果的任何化学或生物学材料、化合物或组合物。一些药物以无活性形式销售，其在体内转化成具有药物活性的代谢产物。为了本发明的目的，术语“药物试剂，，和“药物，，包括无活性的药物和活性代谢产物。术语“药学或治疗有效剂量或量”是指足以诱导期望的生物学结果的剂量水平。该结果可以是药物试剂的递送、疾病的体征、症状或病因的减轻或生物系统的任何其他期望的改变，活性剂的精确量取决于患者的身体状况、正在治疗的疾病的进展等。如本文中所使用的，术语"鞘脂激活蛋白"是指鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质和多肽的家族，包括但不限于天然存在的鞘脂激活蛋白A、B、C和D以及显示促融合活性的合成的鞘脂激活蛋白衍生的蛋白质和肽及肽类似物。鞘脂激活蛋白C和从其衍生的多肽可用于本发明的一个实施方案。术语“短链脂质”是指碳链长度为4、5、6、7、8、9、10、11或12的脂质。在一个实施方案中，碳链长度是6、7、8、9或10。在一个实施方案中，碳链长度是6、7或8。带负电荷的短链脂质的实例可在网站www. avantilipids. com上获得。可用于本发明的短链脂质的实例包括但不限于下列06: OPS (DHPS) 1,2- 二己酰-sn-甘油_3_[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)；08:0PS 1，2-二辛酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)；03:0PC 1，2_ 二丙酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；04: OPCl，2-二丁酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；05: OPC 1，2_ 二戊酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；06 OPC (DHPC) 1，2_ 二己酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；07: OPC 1， 2- 二庚酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；08: OPC 1,2- 二辛酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；09: OPC 1，2- 二壬酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；06 OPGl，2- 二己酰-sn-甘油-3-[磷酸-rac- (1-甘油)](钠盐)；08:OPG 1，2_ 二辛酰-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(l-甘油)](钠盐)；06:OPA 1，2-二己酰-sn-甘油-3-磷酸盐(一钠盐)；08:0PA 1，2-二辛酰-sn-甘油-3-磷酸盐 (一钠盐)；06:0PE 1，2-二己酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；08:0PE 1，2_ 二辛酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺。如本文中所使用的，术语“短干扰核酸”、“siNA”、“短干扰RNA”、“siRNA”、“短干扰核酸分子”、“短干扰寡核苷酸分子”或“化学修饰的短干扰核酸分子”是指能够例如通过以序列特异性的方式介导RNA干扰“RNAi”或基因沉默来抑制或下调基因表达或病毒复制的任何核酸分子。在示例性实施方案中，siNA是包含自我互补的有义和反义区域的双链多核苷酸分子，其中反义区域包含与要下调表达的靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，有义区域包含相应于(即，在序列上大体上相同于)所述靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。“siNA”是指其为短长度双链核酸(或任选其更长的前体)并且在靶细胞中没有不可接受的毒性的小干扰核酸，例如siRNA。本发明内有用的siNA的长度在某些实施方案中最优化为大约21至23bp长的长度。然而，有用的siNA包括siRNA的长度不存在特定的限制。例如，最初可以以前体形式将siNA呈递至细胞，所述前体形式显著不同于当递送至靶细胞时或之后存在并发挥基因沉默活性的siNA的最终或加工形式。siNA的前体形式可以例如包括前体序列元件，所述前体序列元件在递送时或递送后被加工、降解、改变或切割，从而产生在细胞内具有介导基因沉默的活性的siNA。因此，在某些实施方案中，本发明内的有用的siNA将具有例如大约100-200个碱基对，50-100个碱基对或少于大约50个碱基对的前体长度，其将在靶细胞中产生具有活性的经加工的siNA。在其他实施方案中，有用的siNA或siNA前体长度为大约10至49bp、15至35bp或大约21至30bp。“囊泡”是指球状实体，其特征通常在于存在形成一个或多个内空间的一层或多层壁或膜。可以例如从脂质(包括本文中描述的各种脂质)、蛋白质性质的材料、聚合材料(包括天然、合成和半合成的聚合物)或表面活性剂配制囊泡。优选的囊泡是包含从脂质配制的壁或膜的囊泡。在这些优选囊泡中，脂质可以以单分子层或双分子层的形式存在，并且单分子层或双分子层脂质可用于形成一层或多层单分子层或双分子层。在超过一层单分子层或双分子层的情况下，单分子层或双分子层可以是同心的。脂质可用于形成单层囊泡(包含一层单分子层或双分子层)、寡层囊泡(包含大约2或大约3层单分子层或双分子层)或多层囊泡(包含超过大约3层单分子层或双分子层)。类似地，从蛋白质或聚合物制备的囊泡可包含一层或多层同心壁或膜。从蛋白质或聚合物制备的囊泡的壁或膜可以大体上是均质的(均勻的)或它们可以是多孔的或半多孔的(semi-porous)。本文中描述的囊泡包括通常称为例如脂质体、微团、泡囊(biAble)、微泡囊、微球体、由脂质、聚合物、蛋白和/或表面活性剂包被的泡囊、微泡囊和/或微球体、微球、气凝胶(aerogel)、包合物(clathrate) 结合的囊泡等的此类实体。囊泡的内空间可填充有液体(包括，例如，水性液体)、气体、气态前体和/或固体或溶质材料，包括，例如，靶向性配体和/或生物活性剂(如所期望的)。
促融合蛋白或多肽在一个实施方案中，本发明提供了包含一种或多种溶酶体促融合蛋白或多肽的磷脂膜。在另一个实施方案中，一种或多种溶酶体促融合蛋白或多肽包含在阴离子脂质体中。 在另一个实施方案中，阴离子脂质体还包含药物试剂。用于本发明的合适的溶酶体促融合蛋白和多肽包括但不限于鞘脂激活蛋白家族的蛋白，例如鞘脂激活蛋白C。还包括的是鞘脂激活蛋白C的同源物，其中所述同源物因编码鞘脂激活蛋白C以及具有与鞘脂激活蛋白C相似的生物学活性的多肽和肽类似物的遗传密码的简并性而具有至少80%的序列同源性。肽或肽类似物的实例包括Ser-Asp-Val-Tyr-Cys-Glu-Val-Cys-Glu-Phe-Leu-Val-Lys-Glu-Val-Thr-Lys-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu-Asp-Ala-Phe-Asp-Lys-Met-Cys-Ser-Lys-Leu-Pro (SEQ. ID. No. 1)；Val-Tyr-Cys-Glu-Val-Cys-Glu-Phe-Leu-Val-Lys-Glu-Val-Thr-Lys-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu-Asp-Ala-Phe-Asp-Lys-Met-Cys-Ser-Lys-Leu-Pro (SEQ. ID. No. 2)，和其衍生物、类似物、同源物、片段和混合物。还包括的是下式的多肽h-u-Cys-Glu-h-Cys-Glu-h-h-h-Lys-Glu-h-u-Lys-h-h-Asp-Asn-Asn-Lys-u-Glu -Lys-Glu-h-h-Asp-h-h-Asp-Lys-h-Cys-u-Lys-h-h,其中h =疏水性氨基酸，包括Val、Leu、lie、Met、Pro、Phe和Ala ；以及u =不带电荷的极性氨基酸，包括Thr、Ser, Tyr、Gly、Gln和Asn。用于本发明的合适的溶酶体促融合蛋白和多肽包括但不限于鞘脂激活蛋白家族的蛋白质，优选鞘脂激活蛋白C。还包括的是鞘脂激活蛋白C的同源物，其中所述同源物因编码鞘脂激活蛋白C以及具有与鞘脂激活蛋白C相似的生物学活性的多肽和肽类似物的遗传密码的简并性而具有至少80%的序列同源性。如本文中所使用的，术语“肽类似物”是指这样的肽，其在氨基酸序列上与天然的肽相异仅在于保守氨基酸置换，例如Leu对Val的置换或Arg对Lys的置换等，或在于位于不破坏肽的生物学活性(在该情况下，肽的促融合性质)的位置上的一个或多个非保守氨基酸置换、缺失或插入。如本文中所使用的，肽类似物还可包括一个或多个氨基酸类似物 (模拟氨基酸的结构的分子)和/或在除了肽或肽类似物以外的分子中发现的天然氨基酸， 作为其序列的部分或全部。“类似物"意指本发明的肽的氨基酸序列中的置换或改变，所述置换或改变不会不利地影响肽的促融合性质。因此，类似物可包含这样的肽，所述肽具有与本文中提供为 SEQ ID NO :1和2的肽大体上同一的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸残基已用化学上相似的氨基酸保守置换。保守置换的实例包括非极性(疏水性)残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸对另一个氨基酸的置换。同样地，本发明涉及极性(亲水性)残基例如精氨酸与赖氨酸之间、谷氨酰胺与天冬酰胺之间以及甘氨酸与丝氨酸之间的置换。此外， 还涉及碱性残基例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸对另一个氨基酸的置换或酸性残基例如天冬氨酸或谷氨酸对另一个氨基酸的置换。
磷脂膜和脂质体的形成本发明利用阴离子磷脂膜来实现鞘脂激活蛋白介导的膜融合，从而将特定的药物制剂或显像剂递送穿过皮肤的或粘膜的膜或穿过血脑屏障或其他细胞膜。此类阴离子磷脂膜通常用于制备脂质体。脂质体是由同心脂质双分子层组成的微小囊泡并且，如本文中所使用的，是指由排列在球状双分子层中的两亲性脂质组成的小囊泡。结构上，脂质体的大小和形状可在长管至球体的范围内变动，尺寸在数百埃至毫米的范围内变动。无论总体形状如何，双分子层通常组织为密闭的同心薄层，水性层将各薄层与其相邻层分开。囊泡大小通常在直径大约20至大约30，OOOnm的范围内。薄层之间的液膜通常为约3至lOnm。用于制备不同脂质体形式的多种方法已描述于期刊和专利文献中。关于脂质体形成的专门综述和信息，可参见由Pagano和Weinstein 撰写的综述(参见 Ann. Rev. Biophysic. Bioeng.，7，435-68 (1978)和 Ann. Rev. Biophysic. Bioeng. ，9，467-508(1980))。在一个实施方案中，阴离子磷脂膜是囊泡。在另一个实施方案中，囊泡是脂质体。 脂质体是纳米容器(nanocontainer)例如纳米颗粒或脂质体的形式，通常用于药物的封装。脂质体优选具有约200纳米的平均直径。在另一个实施方案中，脂质体具有50至350 纳米的平均直径。在另一个实施方案中，脂质体具有150至250纳米的平均直径。脂质体至靶组织例如增殖细胞团、瘤组织、炎性组织、发炎组织和受感染的组织的特异性递送可通过选择适合于将治疗剂递送至所述靶组织的脂质体大小来实现。例如，具有ISOnm的平均直径的脂质体可能不在实体瘤中积累；具有140nm的平均直径的脂质体在相同实体瘤的外周积累，并且具有IlOnm的平均直径的脂质体在该实体瘤的外周和中心部分积累。关于涉及囊泡组合物的实施方案，可就具体的期望的最终用途(包括例如诊断和 /或治疗用途)调整囊泡的大小。囊泡的大小在直径上可优选为约30纳米(nm)至约300 微米(μ m)，以及在该范围内的所有组合和亚组合(subcombination)。更优选，囊泡具有约 IOOnm至约10 μ m的直径，且约200nm至约7 μ m的平均直径是更优选的。关于具体的用途例如血管内用途，包括血管系统的磁共振成像，囊泡可以优选地直径不大于约30 μ m，并且更小的囊泡是优选的，例如，直径不大于约12μπι的囊泡。在某些优选实施方案中，囊泡的直径可以为约7 μ m或更小，具有约5 μ m或更小的平均直径的囊泡是更优选的，具有约3 μ m 或更小的平均直径的囊泡是更优选的。必要时，可通过多种方法(包括例如摇动、微乳化、涡旋、挤出、过滤、超声处理、勻化(homogenization)、反复冻融循环、在压力下通过确定大小的孔的挤出和相似的方法) 调整脂质体的大小。除了上述脂质、蛋白质性质和/或多聚化合物外或取而代之，本文中描述的组合物可包括一种或多种稳定材料(stabilizing material)。此类稳定材料的实例是例如生物相容性聚合物。稳定材料可用于帮助囊泡的形成和/或确保气体或气态前体的充分封装。 即使对于相对不容的、非扩散性气体例如全氟丙烷或硫六氟化物，当将一种或多种稳定材料用于充有气体和气态前体的囊泡的形成时，可获得改良的囊泡组合物。此类化合物可在囊泡的大小、形状和/或其他属性方面帮助改善囊泡的稳定性和完整性。术语“稳定的”或“经稳定的”，如本文中所使用的，表示囊泡可基本上抵抗降解，包括例如，囊泡结构或封装的气体或气态前体的丧失，持续有用的一段时间。通常，用于本发明的囊泡具有期望的贮存期限，通常在正常环境条件下保持其原始结构体积的至少约90% 至少大约2至3周的时间。在优选形式中，囊泡的期望的稳定时间是至少大约1个月，更优选至少大约2个月，更优选至少大约6个月，更优选大约18个月和更优选达到大约3年。本文中描述的囊泡，包括填充有气体和气态前体的囊泡，甚至在不利的条件例如高于或低于在正常环境条件下经历的温度和压力下也可以是稳定的。本文中描述的囊泡的稳定性可以至少部分地归因于制造囊泡的材料，包括例如上述脂质、聚合物和/或蛋白质，并且通常不必使用另外的稳定材料，虽然任选地可这样做和可优选地这样做。在下文中更详尽地描述此类另外的稳定材料和其特征。构建囊泡的材料优选地是生物相容性脂质、蛋白质或聚合物材料，并且在此类材料中，生物相容性脂质是优选的。此外，由于配制的容易性(包括，能够在即将施用之前制备囊泡)，可方便地现场制备此类囊泡。用作制备填充有气体和气态前体的囊泡的稳定材料的生物相容性聚合物可以是天然、半合成(经修饰的天然)或合成来源的聚合物。如本文中所使用的，术语聚合物是指包含两个或更多个重复单体单位，优选10或更多个重复单体单位的化合物。如本文中所使用的，短语半合成的聚合物(或经修饰的天然聚合物)是指，已以某些方式化学修饰的天然聚合物。适合用于本发明的示例性天然聚合物包括天然存在的多糖。此类多糖包括例如阿拉伯聚糖、果聚糖、岩藻聚糖、半乳聚糖、聚半乳糖醛酸、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖(例如， 例如菊粉)、左聚糖、墨角藻聚糖、卡拉胶、galatocarolose、果胶酸、果胶，包括直链淀粉、普鲁兰多糖、糖原、支链淀粉、纤维素、右旋糖苷、糊精、右旋糖、聚右旋糖、石耳素、壳多糖、琼脂糖、角质素、软骨素(chondroitan)、皮肤素、透明质酸、海藻酸、黄原胶、淀粉和各种其他天然同聚物或杂聚物，例如包含下列醛糖、酮糖、酸或胺的一种或多种的同聚物或杂聚物 赤藓糖、苏糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、lucose、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、赤藓酮糖(erytirulose)、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、纤维二糖、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、葡糖醛酸、 葡萄糖酸、葡糖二酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡萄糖胺、半乳糖胺和神经氨酸，和其天然存在的衍生物。因此，合适的聚合物包括例如蛋白质，例如白蛋白。示例性半合成聚合物包括羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素和甲氧基纤维素。适合用于本发明的示例性合成的聚合物包括聚乙烯(例如，聚乙二醇、聚氧乙烯和聚对苯二甲酸乙二酯(polyethylene ter印hthlate))、聚丙烯(例如，聚丙二醇)、聚氨酯(例如，聚乙烯醇(PVA)、聚氯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮)、聚酰胺包括尼龙、聚苯乙烯、聚乳酸、氟化碳氢化合物、氟化碳(例如，聚四氟乙烯)，和聚甲基丙烯酸甲酯，和其衍生物。当本公开内容与本领域内已知信息例如美国专利5，205，290 (其公开内容以其全文通过引用合并入本文)中描述的和提及的信息结合时，一旦使用本公开内容，用于制备囊泡的、使用聚合物作为稳定化合物的方法对于本领域技术人员来说将是很显然的。通常，可基于它们的总体大小和薄层结构的性质将用于本发明的脂质体分成3类 (参见 1977 年 12 月的纽约学术科学会议，“Liposomes and Their Use in Biology and Medicine " )。4个分类包括多层囊泡(MLV)、小型单层囊泡(SUV)、大型单层囊泡(LUV)和巨大单层囊泡(GUV)。SUV和LUV，按定义，只具有一个双分子层，而MLV包含许多同心双分子层。具有低多分散性的球状单层囊泡(ULV)可在带电荷的磷脂混合物中自发形成。 此类低多分散性ULV的形成通常需要温度的急剧升高或突然稀释的过程。在一些情况下， 自发低多分散性ULV经检查在一段时间内和当稀释时是高度稳定的，这表明其具有成为用于药物递送或基因疗法的封装载体的巨大潜力。参见Nieh，等人Low-Polydispersity Phospholipid Unilamellar Ellipsoidal Vesicles and Their Interaction with Helical Domains of Sapos in C,手禾高。取决于它们的大小、组成和电荷，脂质体展示广泛多样的特征。例如，具有小百分比的不饱和脂质的脂质体倾向于略微更可透过，然而掺入胆固醇或其他固醇的脂质体倾向于更坚硬和较不可透过。取决于亲水性基团，脂质体在电荷上可以是正的、负的或中性的。 例如，基于胆碱的脂质赋予总体中性的电荷，基于磷酸和硫酸的脂质贡献负电荷，基于甘油的脂质通常带负电荷，并且固醇在溶液中通常是中性的但具有带电荷的基团。用于本发明的脂质是阴离子和中性脂质。与脂质体组合物的制备相关的许多方法是可获得的。因此，可使用许多常规脂质体制备技术的任一种制备脂质体，所述技术对于本领域技术人员来说是显而易见的。此类技术包括例如溶剂透析、弗压碎器(French press)、挤出法(利用或不利用冻融)、反相蒸发法、简单冻融法、超声处理、螯合透析(chelate dialysis)、勻化、溶剂输注、微乳化、 自发形成、溶剂蒸发、溶剂透析、弗氏压碎器(French pressure cell)技术、受控去垢剂透析(controlled detergent dialysis)等，各自涉及以不同的方式制备囊泡。参见例如，Madden 等人，Chemistry and Physics of Lipids, 1990 53，37-46，其公开内容通过引用完整并入本文。适当的冻融技术描述于例如1989年11月8日提交的国际申请系列 NO.PCT/US89/05040，其公开内容通过引用完整并入本文。关于脂质体的制备，涉及冻融技术的方法是优选的。可在溶液例如盐水溶液、磷酸盐缓冲水溶液或无菌水中进行脂质体的制备。还可通过涉及摇动或涡旋的不同方法制备脂质体。这可以例如通过使用机械摇动装置例如 Wig-L-Bug(Crescent Dental，Lyons, 111.)、由 Degussa AG，Frankfurt，Germany 出售的 Mixomat，由 Espe Fabrik Pharmazeutischer Praeparate GMBH & Co. , Seefeld， Oberay Germany 出售的 CapmiχΛ 由 Vivadent, Lechtenstein 出售的 Silamat Plus 或由 Quayle Dental，Sussex，Englmd出售的Vibros来实现。还可使用常规微乳化设备例如 Microfluidizer(Microfluidics, Woburn, Mass.)。还可使用喷雾干燥法制备囊泡。通过利用该方法，可在水性环境中预混合脂质，然后将其喷雾干燥以产生填充有气体的囊泡。可在期望的气体的顶部空间下贮存在囊泡。经改造适用于制备囊泡组合物的许多脂质体制备技术论述于例如美国专利No. 4，728，578 ；英国专利申请GB 2193095A ；美国专利4，728，575 ；美国专利 No. 4，737，323 ；国际申请系列No. PCT/US85/01161 ；Mayer等人，Biochimica et Biophysica Acta，第 858 卷，pp. 161-168(1986) ；Hope 等人，Biochimica et BiophysicaActa，第 812 卷，pp. 55-65 (1985)；美国专利 No. 4，533，254 ；Mayhew 等人，Methods in Enzymology, 第 149 卷，pp. 64-77(1987) ；Mayhew 等人，Biochimica et Biophysica Acta，第 755 卷， pp. 169-74(1984) ；Cheng等人，Investigative Radiology，第 22 卷，pp. 47-55 (1987)；国际申请系列No. PCT/US 89/05040 ；美国专利No. 4，162，282 ；美国专利No. 4，310, 505 ；美国专利 No.4,921,706 ；禾口 Liposome Technology, Gregoriadis,G,ed.,第 I 卷，pp. 29-31,51-67 和79-108(CRC Press Inc. ,Boca Raton，Fla. 1984)，其各自的公开内容通过引用完整并入本文。可选地，可在组合物的制剂中包含一种或多种抗菌试剂和/或防腐剂，例如苯甲酸钠、季铵盐、叠氮化纳、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、山梨酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(butylated hydroxyanisole)、丁羟甲苯、氯丁醇、脱氢醋酸、乙二胺、 硫代甘油、苯甲酸钾、焦亚硫酸钾、山梨酸钾、亚硫酸氢钠、二氧化硫和有机汞盐。当稳定的囊泡用于在侵入环境下例如血管内或腹膜内成像时，这样的灭菌(其还可通过其他常规方法例如通过辐射来完成)将是必需的。基于本公开内容，灭菌的合适的方法对于技术人员来说将是显然的。与脂质和/或囊泡组合物的制备一样，可获得众多技术来制备脂质制剂。例如，可从脂质化合物、蛋白质和生物活性剂的混合物制备脂质和/或囊泡制剂。在该情况下，如上所述制备脂质组合物，其中组合物还包括生物活性剂。因此，例如，可在生物活性剂存在的情况下制备微团。如本领域技术人员所认识到的，可将任何脂质和/或囊泡组合物和/或脂质和/ 或囊泡制剂冻干以便贮存，以及例如利用水性介质(例如无菌水、磷酸盐缓冲溶液或盐水溶液)借助剧烈搅拌来重建。为了防止由于冻干而产生的脂质和/或囊泡的凝集或融合，可有用地包含防止此类融合或凝集发生的添加剂。可以使用的添加剂包括山梨醇、甘露醇、氯化钠、葡萄糖、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和聚(乙二醇)(PEG)例如PEG 400。此类和其他添加剂描述于文献，例如美国药典，USP XXII，NF XVII，The United States Pharmacopeia, The National Formulary,United States Pharmacopeial Convention Inc. ,12601 Twinbrook Parkway,Rockville,Md. 20852中，其公开内容通过引用完整并入本文。冻干的制剂通常具有更长的贮存期限的优点。通常，本发明的脂质混合物包含阴离子长链脂质。在一个实施方案中，用于合成包含鞘脂激活蛋白C的脂质体的脂质混合物包含1)阴离子长链脂质、幻中性长链脂质和3) 短链脂质。短链脂质可以是中性的或阴离子的。在另一个实施方案中，脂质混合物只包含阴离子长链脂质和中性或阴离子短链脂质。下表举例说明了可用于合成包含鞘脂激活蛋白 C的脂质体以便实现本发明的目的的磷脂的组合的实例。可使用本文中描述的方法向下列脂质的组合中加入鞘脂激活蛋白C或鞘脂激活蛋白C的多肽。下列表1举例说明可用于实践本发明的磷脂的组合。例子不是穷尽性的，而只是意欲举例说明本发明的可能的实施方案。表1表1.可与鞘脂激活蛋白C或鞘脂激活蛋白C的多肽组合使用以形成根据本发明的包含促融合蛋白的脂质体的长链和短链磷脂的组合。
权利要求
1.用于将试剂递送至生物膜的靶向生物膜的纳囊泡，所述纳囊泡包含a.选自长链磷脂、短链脂质和其混合物的一种或多种磷脂；b.安全且有效量的显像剂或治疗剂；c.源自鞘脂激活蛋白C的归巢肽；和d.药学上接受的载体，其中所述纳囊泡能够与被靶向的生物膜融合。
2.权利要求1的组合物，其中所述归巢肽具有这样的序列，所述序列包含选自下列的式的约9个至约20个连续氨基酸EKEILDAFDKMCSKLPK EKEILDAFDKMCSKLP FDKMCSKLPK FDKMCSKLPEVCEFLVKEVTKLIDNNKTEKEILDAFDKMCSKLP KSLSEECQEVVDTYGSSILSILLEEVSPELVCSMLHLCSG SPELVCSMLHLCSG。
3.权利要求1的组合物，其中所述归巢肽具有下式的约9个至约20个连续氨基酸的序列
4.AsnLysThrGluLysGluIleLeuAspAlaPheAspLysMetCysSerLysLeuProLys
5.权利要求1的组合物，其中所述归巢肽具有下式的约9个至约20个连续氨基酸的序列XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaPheAspLysMetCysSerLysLeuProXaa其中位置1上的Xaa是Glu或不存在；其中位置2上的Xaa是Lys或不存在；其中位置3上的Xaa是Glu或不存在；其中位置4上的Xaa是Ile或不存在；其中位置5上的Xaa 是Leu或不存在；其中位置6上的Xaa是Asp或不存在；其中位置7上的Xaa是Ala或不存在；以及其中位置17上的Xaa是Lys或不存在。
6.权利要求1的组合物，其中所述归巢肽具有选自下列的式的序列 glu-lys-glu-ile-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-lys 17 phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-lys 10glu-lys-glu-ile-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro 16 lys-glu-ile-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro 15 glu-ile-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro 14 ile-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro 13 leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro 12 asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro 11 ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro 10 phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro 9lys-glu-ile-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-lys 16 glu-ile-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-lys 15 ile-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-lys 14leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-lys 13 asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-lys 12 ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-lys 11 phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-lys 10glu-lys-glu-ile-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-lys 17 glu-lys-glu-ile-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-Xaa 17 lys-glu-ile-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-Xaa 16 glu-ile-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-Xaa 15 ile-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-Xaa 14 leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-Xaa 13 asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-Xaa 12 ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-Xaa 11 phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-Xaa 10Xaa-lys-glu-ile-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-lys 17 Xaa-Xaa-glu-ile-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-lys 16 Xaa-Xaa-Xaa-ile-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-lys 15 Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Ieu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-1eu-pro-lys 14 Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-lys 13 Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-1eu-pro-lys 12 Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-1eu-pro-lys 11 phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-1eu-pro-lys 10Xaa-lys-glu-ile~leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-1eu-pro-Xaa 17 Xaa-Xaa-glu-ile~leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-1eu-pro-Xaa 16 Xaa-Xaa-Xaa-ile~leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-1eu-pro-Xaa 15 Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Ieu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-1eu-pro-Xaa 14 Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-1eu-pro-Xaa 13 Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-1eu-pro-Xaa 12 Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-1eu-pro-Xaa 11 phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-1eu-pro-Xaa 10其中Xaa是选自val，leu, ile，met，pro，phe和ala的疏水性氨基酸；选自thr，ser， tyr，gly，gin和asn的不带电荷的极性氨基酸；或不存在。
7.权利要求1的组合物，其中所述磷脂是磷脂酰胆碱。
8.权利要求1的组合物，其中所述磷脂酰胆碱选自二油酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、双十五酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱。
9.权利要求1的组合物，其中所述磷脂选自二油酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰胆碱和己酰磷脂酰胆碱。
10.权利要求1的组合物，其中所述试剂是治疗剂或显像剂。
11.权利要求1的组合物，其中所述试剂是显像剂。
12.权利要求1的组合物，其中所述显像剂选自放射性核素、生物素、荧光团、抗体、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、纳米颗粒、量子点、可检测的抗癌剂的纳米滴、脂质体药物和细胞因子。
13.权利要求1的组合物，其中所述显像剂缀合至归巢肽。
14.用于将试剂靶向细胞或组织的膜的方法，其中所述方法包括给所述膜施用权利要求1的组合物，其中肽的浓度是足以将所述试剂递送通过膜的量。
15.权利要求14的方法，其中所述试剂是显像剂。
16.权利要求14的方法，其中所述显像剂是选自磁共振、荧光或CT/PET可检测标记的一种或多种试剂。
17.权利要求14的方法，其中所述显像剂具有两个或更多个成像性质。
18.权利要求14的方法，其中所述显像剂是包含荧光团和Gd(III)部分的PHR染料， 其能通过磁共振成像(MRI)或共聚焦荧光显微术进行检测。
19.权利要求14的方法，其中将所述显像剂递送穿过血脑屏障的膜，其中所述纳囊泡的浓度是足以递送安全且有效量的药物试剂通过所述膜的量，并且其中所述磷脂形成总体电荷为负的脂质体。
全文摘要
本发明包括利用促融合蛋白将药物试剂和/或显像剂递送至皮肤的膜、粘膜的膜和其他细胞膜内和/或通过所述膜，和穿过血脑屏障的方法。促融合蛋白与磷脂膜例如脂质体缔合。脂质体可包括二油酰磷脂酰丝氨酸，带负电荷的长链脂质。可选地，脂质体包含带负电荷的长链脂质、中性长链脂质和中性短链脂质。优选的促融合蛋白包括鞘脂激活蛋白C和源自鞘脂激活蛋白C的其他蛋白质、多肽和肽类似物。脂质体中包含的活性剂可包括生物分子和/或有机分子。该技术可用于美容和医学应用，其中目的是将活性剂递送至生物膜内和/或生物膜下或者穿过血脑屏障和神经元膜。
文档编号A61K9/127GK102264349SQ200880132489
公开日2011年11月30日 申请日期2008年11月7日 优先权日2008年11月7日
发明者祁晓阳 申请人:儿童医院医疗中心