专利名称：一种载多烯紫杉醇plga缓释微球的制备方法及其在超声介导下肿瘤间质化疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于肿瘤间质化疗的缓释制剂，具体而言，本发明是制备一种多
烯紫杉醇的缓释制剂，通过超声影像学技术引导注射到肿瘤组织内，建立一种可较彻底灭活肿瘤，操作简便，全身毒副作用低的肿瘤间质化疗新方法。
背景技术：
多烯紫杉醇是一种新型抗肿瘤药物，主要通过抑制细胞微管解聚，使纺锤体失去正常功能，导致细胞死亡。此外，多烯紫杉醇还可以抑制细胞DNA、 RNA或蛋白质的合成，对肝癌、卵巢癌、乳腺癌、周围型肺癌、胰腺癌、头颈部等肿瘤等有效。由于多烯紫杉醇难溶于水，现行制剂通常使用表面活性剂Tween 80和乙醇增溶，容易导致病人过敏反应。多烯紫杉醇全身给药后可迅速分布于除中枢神经之外的几乎所有组织中，常造成骨髓抑制，中性粒细胞减少，外周神经毒性，血液系统毒性、体液储留等毒副作用。因此，改进多烯紫杉醇剂型与给药方式，提高肿瘤局部药物浓度，减轻全身毒副作用具有重要意义。
传统化疗全身给药后肿瘤局部药物浓度低，且全身不良反应明显，对部分实体瘤如肝癌等的疗效较差。近年来随着高分子材料在医药学领域的应用，脂质体、微球、凝胶等药物控缓释新制剂不断涌现，肿瘤间质化疗逐渐成为肿瘤治疗研究的热点之一。将抗癌药物制备成具有缓释作用的给药系统，经不同方式，如超声影像学技术介导下植入肿瘤组织、瘤周组织的间质或肿瘤切除后的瘤床，使药物在肿瘤局部缓慢、持续释放，维持局部较高的药物浓度，同时降低全身毒副作用。本发明采用聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)包载抗肿瘤作用强、抗瘤谱广的多烯紫杉醇，制备一种缓释制剂，可在超声影像学技术引导下注射到肿瘤局部进行间质化疗，达到高效安全的效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肿瘤间质化疗的载多烯紫杉醇的PLGA缓释微球，该微球以PLGA包载多烯紫杉醇，可通过超声影像学技术介导注射到肿瘤组织内，提高肿瘤局部药物浓度，减轻全身给药的毒副作用，达到安全高效的目的。 本发明采用的技术方案是，所述的载多烯紫杉醇的PLGA缓释微球是将PLGA与多烯紫杉醇通过单乳化法制成的载药微球。具体说是将PLGA与多烯紫杉醇通过单乳化法制成的载药微球，所述的载药微球中的PLGA分子量为5000-50000dal ，乳酸/羟基乙酸摩尔比为75 : 25 50 : 50， PLGA与多烯紫杉醇的投料比为100/1 100/10，在有机溶剂中乳化制备而成，其中水相分散介质采用浓度为1 6%的聚乙烯醇。载多烯紫杉醇的PLGA缓释微球在下文中简称(载药微球)。 本发明的载多烯紫杉醇PLGA缓释微球以PLGA为基质材料，PLGA与多烯紫杉醇的投料比为100/1到100/10，即100/1 100/10，通过通用的单乳化法制备。所述的载多烯紫杉醇PLGA微球，其PLGA分子量为5000 50000dal，乳酸(lactic acid， LA) /羟基乙酸(glycolic acid，GA)摩尔比为75 : 25 50 : 50，有机溶剂采用二氯甲烷，乳化可采用电动匀浆、超声乳化或电动搅拌等方法。水相分散介质采用聚乙烯醇，型号可为PVA1788，浓度为1 6%。我们优选PLGA的分子量为10000dal， LA/GA = 50/50 (以摩尔比计)的PLGA为基质材料，PLGA与多烯紫杉醇的投料比为50/3，二氯甲烷为有机相，3X PVA为水相，800转/分钟电动搅拌2min，然后加入蒸馏水磁力搅拌4hr进行固化，洗涤3次后冷冻干燥。结果制备的微球平均粒径为23. 8 ii m，大小较均匀一致，表面光滑、无粘连，包封率达98. 6% ，载药率达5. 59%，可持续稳定释放药物达6周，缓释最佳，且实验表明在超声引导下载药微球局部注射抗实验性裸鼠荷人肝癌作用最佳，能在制备治疗肝癌、乳腺癌、卵巢癌、周围型肺癌、胰腺癌、头颈部等肿瘤的载药缓释微球药物中的应用。 本发明的载多烯紫杉醇PLGA缓释微球具有降低多烯紫杉醇降解的保护作用。多烯紫杉醇在水溶液中稳定性差，随着时间延长，多烯紫杉醇逐渐发生降解。采用PLGA微球包载多烯紫杉醇，可显著降低药物水解。反相疏水高效液相法检测结果显示，体外释放于水溶液的多烯紫杉醇出现了明显的降解片段吸收峰，而包载在微球内的多烯紫杉醇结构较完整，无明显降解片段出现。 本发明的载多烯紫杉醇缓释微球制剂适用于机体绝大部分实体瘤的超声介导下间质化疗，包括肝、肾、胰腺、脾、前列腺、子宫、卵巢、腹膜后、甲状腺、乳腺以及颈部和浅表软组织肿瘤，包括良性和恶性肿瘤。 本发明的载多烯紫杉醇缓释微球制剂尤其在注射到荷人肝癌、乳腺癌、卵巢癌的裸鼠肿瘤组织内，通过病理组织学检查肿瘤坏死情况，结果表明载多烯紫杉醇的缓释微球可彻底的消融灭活肿瘤，并且显著减少药物的全身毒副作用，是一种极具临床应用前景的超声介入肿瘤间质化疗的新方法。
图1A为本发明的多烯紫杉醇-聚乳酸羟基乙酸微球的扫描电镜X500图。
图1B为本发明的多烯紫杉醇-聚乳酸羟基乙酸微球的扫描电镜X2000图。
图2为本发明的多烯紫杉醇-聚乳酸羟基乙酸微球体外释放曲线图。
图3A为本发明的多烯紫杉醇_聚乳酸羟基乙酸微球体外释放前检测的HPLC图，在保留时间约为7. 6min时出现了多烯紫杉醇的吸收峰。 图3B图为本发明的多烯紫杉醇-聚乳酸羟基乙酸微球体外释放7天的上清液的HPLC图，在9. 3min时出现了新的吸收峰，峰面积为多烯紫杉醇的28. 1%。
图3C为本发明从体外释放7天的多烯紫杉醇微球抽提多烯紫杉醇的HPLC图，在9. 3min时也出现了新的吸收峰，但峰面积仅为多烯紫杉醇的5. 2%。
具体实施例方式
下面结合附图对本发明进行详细说明
实施例 1.载多烯紫杉醇的PLGA缓释微球的制备 采用溶剂挥发法制备载多烯紫杉醇的PLGA微球。精密称取PLGA 50mg，溶于lml二氯甲烷，加入多烯紫杉醇3mg，涡旋振荡充分溶解，为有机相。用lml注射器吸取有机相，缓缓注入50ml 3XPVA水溶液中，800rpm电动搅拌2分钟，继续磁力搅拌3小时。固化好的载药微球经0. 22 i！ m微孔滤膜抽滤，用500ml蒸馏水反复洗涤，收集载药微球，真空冷冻干燥即得载多烯紫杉醇的PLGA微球。 实验证明当PLGA与多烯紫杉醇的投料比为50mg/3mg时，所获得的载多烯紫杉醇
的PLGA缓释微球具有最佳的包封率和载药率，分别为98. 6%与5. 59% 。 上述的PLGA基质材料的分子量为10000dal， LA/GA = 50/50 (以摩尔比计)，此材
料可以是市售产品或采用通用的开环聚合法合成制成。 2.载药微球表面形态观察及粒径测定 取适量载药微球冻干粉，置双面胶带上，均匀涂布，离子镀膜仪溅金后，扫描电镜观察，微球大小较均匀，表面光滑，分散良好，无粘连，见图1A和图1B。测量300个载药微球的粒径，平均粒径为23. 8 ii m。
3.载药微球包封率和载药率的测定 采用高效液相色谱法(HPLC)检领U。色谱条件如下流动相为甲醇/水=70/30，流速为1. 0ml/min，柱温3(TC，检测波长227nm。精密称取多烯紫杉醇适量，加入甲醇溶解成浓度为lmg/ml的标准贮备液。精密量取多烯紫杉醇储备液0. 05、0. 1、0. 25、0. 5和1. Oml置10ml量瓶中，甲醇定容得系列浓度的对照溶液。20 iU进样，以峰面积(Y)对对照溶液浓度(X mg/L)进行直线回归。 精密称取载药微球10mg于5ml离心管中，加入0. 5ml 二氯甲烷，超声使微球溶解，再加入2. 5ml甲醇，涡旋10min，5000Xg离心10min，取上清液进样20 yl 。测定峰面积，代入标准曲线计算多烯紫杉醇浓度。结果，当PLGA与多烯紫杉醇的投料比为50mg/3mg时可获得最佳的包封率和载药率，分别为98. 6%与5. 59%。
4.载药微球的体外释放 精密称取载药微球10mg置于青霉素瓶中，加入5ml pH为7. 2的磷酸盐缓冲液(含3 % PEG 6000)，涡旋lmin后在37 °C 、 (75 ± 5) rpm振荡，分别于第1 、 7 、 14、 21 、 28 、 35 、 42天，5000Xg离心10min，取出所有上清液，同时补充等量释放液，继续振荡。HPLC法测定释放液中多烯紫杉醇浓度。结果，载多烯紫杉醇的PLGA缓释微球释放较平稳，第1天释放了 4. 2% ，无明显"突释"行为，到第42天累积释放了 65. 3%，见图2的载多烯紫杉醇PLGA微球的体外释放曲线图。 5.体外释放多烯紫杉醇的结构稳定性检测 精密称取载药微球50mg置于青霉素瓶中，加入10ml释放液，37°C 、 (75±5) rpm振荡，在第7天，5000 X g离心10min分离上清液，沉淀的载药微球残渣真空干燥后，用二氯甲烷溶解，甲醇萃取多烯紫杉醇，HPLC法测定释放液和沉淀微球的多烯紫杉醇，比较吸收峰的差异。用于参照的图3A为载药微球体外释放前检测的HPLC图，在保留时间约为7. 6min时出现了多烯紫杉醇的吸收峰。载药微球体外释放上清液在保留时间约为9. 3min时出现一新的吸收峰，峰面积约为多烯紫杉醇峰面积的28. 1X，见3B，说明体外释放的多烯紫杉醇出现了降解。体外释放后的载药微球在保留时间约为9. 3min亦可见该吸收峰峰，但峰面积极小，仅为多烯紫杉醇峰面积的5. 2%，见图3C。这表明包载在PLGA微球的多烯紫杉醇比释放在缓冲液中的药物更稳定，PLGA载体具有保护多烯紫杉醇药物，减少其发生降解的作用。
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6.超声引导下载药微球局部注射抗实验性裸鼠荷人肝癌作用
人肝癌Bel-7404细胞体外培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，细胞融合生长至90%后，收集细胞制备5 X 107cells/ml的单细胞悬液。取雄性BALB/c-皿裸小鼠，右腋下接种0. 2ml细胞悬液，14天后选取肿瘤直径1. 5-2. Ocm的50只，随机分成5组，为模型对照组、空白微球组、多烯紫杉醇静脉给药组、多烯紫杉醇微球瘤内注射给药高、低剂量组，每组10只。微球给药组裸鼠在超声引导下，将微球注射到肿瘤局部，使药物均匀分布到整个肿瘤。结果，模型组与空白微球裸鼠的肿瘤持续生长，而各给药组都表现出一定的抗肿瘤作用，其中多烯紫杉醇微球瘤体内注射高剂量组抗肿瘤作用最显著，抑瘤率高达72. 67%。注射后14天每组取3只裸鼠肿瘤进行病理检查，可见肿瘤组织大片坏死，微血管密度减低。取肿瘤组织进行荧光定量PCR检测肿瘤血管生成相关基因VEGF、Ang2、bFGF表达的变化，结果见载药微球组基因表达明显下调(表l)。余下裸鼠观察42天，剥离肿瘤称质量，各组裸鼠的抑瘤率见表2。 表1各组裸鼠肿瘤组织VEGF、 Ang2、 bFGF基因表达的A Ct值比较
组另ljVEGFAng2bFGF
模型对照组0. 68±0. 293. 34±0. 772. 44±0. 63
空白微球对照组0. 77±0. 422.97±0. 832. 81土0. 96
多烯紫杉醉静脉组1. 76±0. 574. ll土l. 093. 33±0. 88
多烯紫杉醇微球高剂量组3. 17±1.055. 08±1. 544. 02 ±1. 12
多烯紫杉醇微球低剂量组2. 76±0. 974. 59土1.663. 47±0. 79 表2多烯紫杉醇微球对荷人肝癌裸鼠抗肿瘤作用
组另!J 瘤质量(g) 抑瘤率(％)
模型对照组4. 61 ±0. 93一
空白微球对照组4. 83 ±1.02一
多烯紫杉醇静脉组3. 68±0. 7720. 17
多烯紫杉醇微球高剂量组1.26±0. 2572.67
多烯紫杉醇微球低剂量组2. 33±0. 4649. 46 7.载药微球局部注射抗实验性裸鼠荷人乳腺癌作用 人乳腺癌MDA-MB-231细胞体外培养于含10%胎牛血清的L-15培养液，细胞融合生长至90%后，收集细胞制备5X 107cells/mL的单细胞悬液。取雌性BALB/c-皿裸小鼠，于右腋下接种0. 2ml， 14天后随机分为模型组、空白微球对照组、多烯紫杉醇静脉注射组、多烯紫杉醇微球注射组，每组6只。给药后42天剥离肿瘤称质量，结果多烯紫杉醇微球组抑瘤率达83. 5%，明显高于静脉注射组的33. 8% 。
8.载药微球局部注射抗实验性裸鼠荷人卵巢癌作用 人卵巢癌细胞SK0V3体外培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，细胞融合生长至90%后，收集细胞制备5X 107cells/mL的单细胞悬液。取雌性BALB/c-皿裸小鼠，于右腋下接种0. 2ml， 14天后随机分为模型组、空白微球对照组、多烯紫杉醇静脉注射组、多烯紫杉醇微球瘤内注射组，每组6只。给药后42天剥离肿瘤称质量，结果多烯紫杉醇微球组抑瘤率达79. 2%，明显高于静脉注射组的29. 4%。
权利要求
一种载多烯紫杉醇的PLGA缓释微球，其特征在于是将PLGA与多烯紫杉醇通过单乳化法制成的载药微球，所述的载药微球中的PLGA分子量为5000-50000dal，乳酸/羟基乙酸摩尔比为75∶25～50∶50，PLGA与多烯紫杉醇的投料比为100/1～100/10，在有机溶剂中乳化制备而成，其中水相分散介质采用浓度为1～6％的聚乙烯醇。
2. 根据权利要求1所述的载多烯紫杉醇的PLGA缓释微球，其特征在于所述的PLGA的分子量为10000dal，乳酸/羟基乙酸摩尔比为50/50，PLGA与多烯紫杉醇的投料比为50/3，二氯甲烷为有机相，3% PVA为水相，乳化制备成平均粒径为23.8ym，包封率为98.6%，载药率为5. 59%的载药微球。
3. 权利要求1所述的载多烯紫杉醇的PLGA缓释微球制备方法，包括如下步骤称取配比量的PLGA溶于二氯甲烷，加入配比量的多烯紫杉醇，涡旋振荡充分溶解，为有机相；用注射器吸取有机相，缓缓注入适宜量及适宜浓度的PVA水溶液中，电动搅拌后继续磁力搅拌，固化好的载药微球经0. 22阳微孔滤膜抽滤，用适量蒸馏水反复洗涤，收集载药微球，真空冷冻干燥即得载多烯紫杉醇的PLGA缓释微球。
4. 根据权利要求3所述的载多烯紫杉醇的PLGA缓释微球制备方法，其特征在于所述的PLGA分子量为5000-50000dal，乳酸/羟基乙酸摩尔比为75 : 25 50 : 50，PLGA与多烯紫杉醇的投料比为100/1 100/10，聚乙烯醇浓度为1 6%。
5. 根据权利要求4所述的载多烯紫杉醇的PLGA缓释微球制备方法，其特征在于所述的PLGA的分子量为10000dal，乳酸/羟基乙酸摩尔比为50/50，PLGA与多烯紫杉醇的投料比为50/3， 二氯甲烷为有机相，3 % PVA为水相，乳化制备成平均粒径为23. 8 y m，包封率为98. 6 % ，载药率为5. 59 %的载药微球。
6. 权利要求1所述的载多烯紫杉醇的PLGA缓释微球，在制备治疗肝癌、乳腺癌、卵巢癌、周围型肺癌、胰腺癌、头颈部等肿瘤的载药缓释微球药物中的应用。
7. 权利要求1所述的载多烯紫杉醇的PLGA缓释微球，在超声介导下肿瘤间质化疗中的应用。
全文摘要
本发明公开一种载多烯紫杉醇PLGA缓释微球的制备方法及其在超声介导下肿瘤间质化疗中的应用，所述的载多烯紫杉醇的PLGA缓释微球是将PLGA与多烯紫杉醇通过单乳化法制成的载药微球，所述的载药微球中的PLGA分子量为5000-50000dal，乳酸/羟基乙酸摩尔比为75∶25～50∶50，PLGA与多烯紫杉醇的投料比为100/1～100/10，在有机溶剂中乳化制备而成。本发明的载多烯紫杉醇缓释微球制剂在注射到荷人肝癌、乳腺癌、卵巢癌的裸鼠肿瘤组织内，通过病理组织学检查肿瘤坏死情况，结果表明载多烯紫杉醇的缓释微球可彻底的消融灭活肿瘤，并且显著减少药物的全身毒副作用，是一种极具临床应用前景的超声介入肿瘤间质化疗的新方法。
文档编号A61K9/16GK101697963SQ20091011271
公开日2010年4月28日 申请日期2009年10月29日 优先权日2009年10月29日
发明者林礼务, 蔡敏娴, 薛恩生, 陈志奎 申请人:福建医科大学附属协和医院