专利名称：：一种流行性乙型脑炎疫苗的制备方法
技术领域：
：本发明涉及流行性乙脑疫苗的方法，其步骤如下选用10-14日龄、重量在12-15克的健康地鼠，使用乙醚处死，清洗并消毒鼠尸；无菌取肾，剪碎，经胰蛋白酶消化，用培养液分散细胞，制备细胞悬液，分装培养瓶，置37°C士rC培养3-4天。细胞长满单层后接入毒种和培养液，毒种使用量为每100cm2细胞接种lml毒种。病毒培养液主要包括MEM培养液90-95X，小牛血清3-5X，7.5%碳酸氢钠溶液调节pH至7.2-7.6。经澄清过滤后加入终浓度为0.3%人血白蛋白制成。选择细胞生长良好的细胞瓶，弃去培养液，用缓冲液冲洗去除小牛血清，缓冲液冲洗量800-1000ml/瓶，冲洗完毕后每瓶加入1000ml病毒感染液，立即置32-34t:温室继续培养。种毒16-18小时后进行换液，加入维持液1500-2500m1/瓶，置32-34。C温室继续培养48-72小时。收获前检查细胞病变，选择细胞瓶内细胞病变75%以上的细胞瓶进行收集，将细胞瓶进行超声，使细胞从瓶壁上脱落下来收集到10-15万不锈钢罐内，摇匀即为病毒收获液。病毒收获后用14000r/min的连续流冷冻离心机进行离心，流速为1500-2000m1/min，然后用0.5um及0.22um的滤芯过滤。按1:4000的比例加入P-丙内酯置2_8°C7天灭活。将病毒收获液浓縮60倍左右，通过凝胶柱层析，0.02MpH7.2的PBS洗脱，检测波长为280nm，收集第一峰，即为纯化后原液。用0.22um的膜除菌过滤，然后加入0.3-0.5%人血白蛋白作为保护剂，加入总浓度为60ug/ml的硫柳汞防腐。病毒蛋白含量31.1-74.22ug/ml，按抗原含量不少于收获液的四倍配制半成品。各项检验项目经检测后，结果显示均符合国家药典标准。三种方法制备乙脑疫苗的工艺异同点如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>以上对本发明的描述不具有限制性，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明权利要求的保护的情况，作出本发明的其它结构变形和实施方式，均属于本发明的保护范围。权利要求一种流行性乙型脑炎疫苗的制备方法，其特征在于步骤如下(1)、选用10-14日龄、重量在12-15克的健康地鼠，使用乙醚处死，清洗并消毒鼠尸；无菌取肾，剪碎，经胰蛋白酶消化，用培养液分散细胞，制备细胞悬液，分装培养瓶，置37℃±1℃培养3-4天；(2)、选择细胞生长良好的细胞瓶，弃去培养液，用缓冲液冲洗去除小牛血清，缓冲液冲洗量800-1000ml/瓶，冲洗完毕后每瓶加入1000ml病毒感染液，立即置32-34℃温室继续培养；(3)、种毒16-18小时后进行换液，加入维持液1500-2500ml/瓶，置32-34℃温室继续培养48-72小时；收获前检查细胞病变，选择细胞瓶内细胞病变75％以上的细胞瓶进行收集，将细胞瓶进行超声，使细胞从瓶壁上脱落下来收集到10-15万不锈钢罐内，摇匀即为病毒收获液；(4)、病毒收获后用14000r/min的连续流冷冻离心机进行离心，流速为1500-2000ml/min，然后用0.5um及0.22um的滤芯过滤，按1∶4000的重量比例加入β-丙内酯置2-8℃7天灭活；(5)、将病毒收获液浓缩60倍左右，通过凝胶柱层析，0.02MpH7.2的PBS洗脱，检测波长为280nm，收集第一峰，即为纯化后原液；用0.22um的膜除菌过滤，然后加入0.3-0.5％人血白蛋白作为保护剂，加入总浓度为60ug/ml的硫柳汞防腐，病毒蛋白含量31.1-74.22ug/ml，按抗原含量不少于收获液的四倍配制半成品。2.根据权利要求1所述的流行性乙型脑炎疫苗的制备方法，其特征在于所述的病毒培养液包括MEM培养液90-95X，小牛血清3-5X，7.5%碳酸氢钠溶液调节pH至7.2-7.6，经澄清过滤后加入终浓度为0.3%人血白蛋白制成。全文摘要本发明涉及一种流行性乙型脑炎疫苗的制备方法，包括细胞培养、病毒繁殖和疫苗制备工艺。细胞长满单层后接入毒种和培养液，毒种使用量为每100cm2细胞接种1ml毒种。病毒培养液主要包括MEM培养液90-95％，小牛血清3-5％，7.5％碳酸氢钠溶液调节pH至7.2-7.6。经澄清过滤后加入终浓度为0.3％人血白蛋白制成。本发明采用SA14-14-2减毒株生产乙脑纯化疫苗，该减毒株比P3毒株生产的疫苗更加安全有效。本发明的优点在于1、用减毒株制备纯化疫苗安全性好。2、用β-丙内酯灭活病毒灭活效果好，灭活剂自然降解无残留。3、柱层析纯化性质温和，对病毒损伤小。文档编号A61K39/12GK101732708SQ20091015452公开日2010年6月16日申请日期2009年11月10日优先权日2009年11月10日发明者姚伟,沈吉友,苏波申请人:浙江天元生物药业股份有限公司