专利名称：一种鳖甲抗肝纤维化提取物的制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种鳖甲抗肝纤维化有效物质的的提取制备方法，具体是涉及一 种鳖甲中能显著抑制肝星状细胞(HSC)活化增殖及胶原合成、发挥防治肝纤维化作用的活 性部位的提取制备方法。
背景技术：
肝纤维化是各种原因引起的一系列损伤_修复、导致细胞外基质(ECM)合成与降 解失衡、合成沉积远远超过降解吸收、以及构成成分比例明显改变的结果，大量ECM沉积于 肝小叶内并逐渐形成纤维间隔，严重破坏了肝组织的正常结构和功能，可致肝窦毛细血管 化，血流障碍，门脉高压。肝纤维化是各种慢性肝病的共同病理学基础，也是诱发肝硬化和 肝癌的必经途径。肝纤维化治疗主要包括去除病因与抗纤维化治疗。公认彻底驱除原发 病因后，肝纤维化仍可继续进展，机理为活化的肝星状细胞通过自分泌或旁分泌再次激活 HSC，是故有效的抗纤维化治疗成为控制慢性肝病进展和预防肝硬化肝癌、改善预后不可或 缺的重要环节。基因治疗研究取得较大进展，目前存在的主要问题有基因导入的靶向性、表 达效率、可调控性及安全性尚未完全解决，真正应用于临床还待时日；目前部分用治肝纤维 化的化学药和生物药存在一些毒副反应；许多以鳖甲为君药组方的复方制剂如复方鳖甲软 肝片、鳖甲抗纤方、鳖甲煎丸等，抗肝纤维化疗效较好，但存在药效物质基础不明确、质量控 制标准不完善、药物疗效不稳定、临床服用剂量过大、价格较昂贵等弊端，难以满足广大患 者尤其是农村和贫困地区患者的需求，据统计我国约1. 3亿人患有肝病，占总人口的10%， 针对国情，亟待开发价廉、有效且毒副作用小的抗肝纤维化药物。 鳖甲为常用传统中药，源于鳖科动物鳖(Trionyx sinensis Wiegmann)的背甲，具 有滋阴潜阳、软坚散结、退热除蒸等功效；主治阴虚发热、劳热骨蒸、虚风内动、癥瘕、久疟疟 母等病症。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种鳖甲抗肝纤维化提取物
的制备方法，尤其是一种鳖甲抗肝纤维化有效物质的制备方法，并鉴定了鳖甲抗肝纤维化
活性部位为分子量小于6000的肽类物质，从而为诠释鳖甲抗肝纤维化的药效物质基础提
供了科学依据，并为将鳖甲研究开发成高科技含量抗肝纤维化药物奠定坚实基础。 本发明的目的是通过如下技术方案来完成的； —种抗肝纤维化的鳖甲提取物的提取方法，该方法包括 (1)称取常规研磨的鳖甲粉50 100重量份，加蒸馏水200 300重量份，超声提 取5 30分钟，抽滤，滤渣再加蒸馏水50 300重量份，超声提取5 15分钟，抽滤；合并 两次产生的滤液，冷冻干燥后得冻干粉； (2)用加蒸馏水50 300重量份溶解上述的冻干粉，将水溶液装于半透膜 (3. 500A)内，置100 150重量份蒸馏水中透析1 10小时，温度为2 l(TC;同法再透析一次，合并两次膜外透析液，真空冷冻干燥，收集A型冻干粉0. 2 10重量份。
本发明取上述膜内液体，将膜袋置50 100重量份蒸馏水中透析1 6小时，温度为2 l(TC ;同法透析三次，弃去膜外透析液，将膜内液体真空冷冻干燥，收集B型冻干粉O. 5 10重量份。 A型冻干粉为分子量小于6000的物质，即鳖甲粗多肽成品；B型冻干粉为分子量大于6000的物质。 本发明项目的药理实验结果显示，与对照组相比，分子量小于6000的鳖甲多肽类物质及其分离组分，能明显抑制肝星状细胞增殖，显著下调转化生长因子！^(TGF-e》剌激的LX-1细胞I、 III型胶原、a-肌动球蛋白(a-SMA)蛋白表达，呈现量效关系，在较高实验浓度时作用显著强于公认有效的抗肝纤维化药物/细胞因子Y-干忧素(IFN-Y)。表明鳖甲活性物质抗肝纤维化作用可能是通过阻断TGF-13工在HSC内的Smad、MAPK信号转导，阻止HSC向肌成纤维细胞(MFB)转化，使I、III型胶原等基因表达明显下调，减少胶原合成分泌与促进胶原降解，达到抗肝纤维化目的。 本发明项目通过多学科交叉的研究方法，应用现代科学技术，对鳖甲抗肝纤维化的药效物质基础进行了较系统的研究。采用膜分离技术和生化药理学结合的研究方法，筛选出甲提取物分子量小于6000的物质具有生物活性，从而确定了鳖甲抗肝纤维化的皿 。简言之，本发明项目确定了鳖甲抗肝纤维化li&M^为分子量小于6000的多肽类物质，从而诠释了鳖甲抗肝纤维化的药效物质基础；结合本课题组同期动物实验研究确定的鳖甲抗肝纤维化药效学的有效性，为药食同源的传统中药鳖甲用于临床治疗肝纤维化疾患提供了科学依据，并进一步为将鳖甲研发成中药保健食品和中药新制剂奠定了坚实基础。
具体实施例方式
以下通过实例来进一步详细说明本发明。本发明所述的抗肝纤维化的鳖甲提取物的提取方法，该方法包括 (1)称取常规研磨的鳖甲粉50 100重量份，加蒸馏水200 300重量份，超声提取5 30分钟，抽滤，滤渣再加蒸馏水50 300重量份，超声提取5 15分钟，抽滤；合并两次产生的滤液，冷冻干燥后得冻干粉； (2)用加蒸馏水50 300重量份溶解上述的冻干粉，将水溶液装于3. 500A的半透膜内，置100 150重量份蒸馏水中透析1 10小时，温度为2 l(TC ;同法再透析一次，合并两次膜外透析液，真空冷冻干燥，收集A型冻干粉0. 2 10重量份。
本发明取上述膜内液体，将膜袋置50 100重量份蒸馏水中透析1 6小时，温度为2 l(TC ;同法透析三次，弃去膜外透析液，将膜内液体真空冷冻干燥，收集B型冻干粉O. 5 10重量份。 A型冻干粉为分子量小于6000的物质，即鳖甲粗多肽成品；B型冻干粉为分子量大于6000的物质。
实施例1 —种抗肝纤维化的鳖甲提取物的制备步骤 (1)称取鳖甲粉100g，加蒸馏水200ml，超声提取二十分钟，抽滤，滤渣再加蒸馏水100ml，超声提取十分钟，抽滤；合并两次滤液，冷冻干燥，得冻干粉；
(2)加蒸馏水10ml溶解上述制得的冻干粉，将水溶液装于3. 500A的半透膜内，截留分子量6000，置100ml蒸馏水中透析五小时(4t:，5min摇一次)；同法再透析一次，合并两次膜外透析液，真空冷冻干燥，收集A型0. 4g冻干粉。 (3)取膜内液体，将膜袋置500ml蒸馏水中透析三小时(4。C，磁力搅拌)；同法透析三次，弃去膜外透析液，将膜内液体真空冷冻干燥，收集B型3. 2g冻干粉。
A型冻干粉为分子量小于6000的物质(鳖甲粗多肽成品)，B型冻干粉为分子量大于6000的物质。 本发明的其它实施例可以通过前述的技术方案中所公开的配比范围，以及温度等范围的选择得到多种实施例，因这种选择对本领域技术人员是容易的，为此不作更具体的描述。 本发明提取分离得到的分子量小于6000的肽类物质具有显著的抑制肝星状细胞活化增殖及胶原合成的生物活性，因此可以确定为鳖甲抗肝纤维化的有效部位物质，详见下述试验。 实施试验例1 :鳖甲提取物分子量小于6000的肽类物质对HSC-Te细胞增殖的影响
1.材料与方法 细胞系肝星状细胞系HSC-T6购自上海中医药大学肝病研究所，为SV40转染的Sprague-Dauley大鼠肝星状细胞，其表现型为活化的HSC，表达高水平的I型胶原、TMP-lmRNA等。 主要试剂细胞培养试剂羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、胰蛋白酶(trypsin)、L-谷氨酰胺等(美国Sigma公司)，DMEM培养基(高糖、低糖)(美国GIBCO公司)，小牛血清(fetal calf serum， FCS)(武汉亚法生物技术公司)，青霉素、链霉素(华北制药股份公司)，碳酸氢钠(湖北化工厂)，二氧化碳(C02)(武汉无机盐厂)。细胞增殖检测用试剂二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT) (Sigma公司)。 试剂配制DMEM液1L的DMEM高糖及低糖培养基干粉各一包，并称取2. 38gHEPES、2. Og NaHC03溶于2L三蒸水中，调pH为7. 2，0. 22 y m滤膜抽滤除菌，分装置4"备用，用前加入10% FCS， 1% L-谷氨酰胺，100ii /ml青霉素，即为完全培养基。MTT的配制称取MTT10mg，37。C温浴中溶解于2ml 0. Olmol/L PBS， 4，即为5mg/ml的MTT溶液，0. 22 ii m过滤除菌，背棕色小瓶中，4t:冰箱保存。 HSC-T6的培养及传代HSC-T6培养于37°C、5% C02的含10%胎牛血清、100 y /ml青霉素、100mg/ml链霉素、l^L-谷氨酰胺的DMEM(低糖与高糖比例为l : l)培养液中，在倒置显微镜下观察细胞长到亚单层或细胞密度约80% 90%时，是HSC-T6传代的标志，吸弃培养基，加入0. 25%胰蛋白酶4 5ml，以浸没细胞为宜，37°C消化5 7min，待细胞回縮，瓶壁有少量细胞脱落，即用含10X小牛血清培养基终止，收集细胞悬液于50ml消毒离心管中，1700rpm，4t:离心7min，弃上清，加入含10%小牛血清的DMEM用吸管反复吹打、分散细胞，取10 yl细胞悬液光镜下计数，完全培养基调整细胞浓度，以1X107ml传代。
MTT比色法测定HSC_T6增殖传代HSC_T6细胞按1 X 105的密度接种于96孔培养板，每孔加lOOii l，细胞贴壁长满孔底12h后，换含5% FCS的DMEM培养基，培养12h，加入不同浓度的鳖甲提取物(以含5% FCS的DMEM培养基倍比稀释成14. 0000mg/ml、7. OOOOmg/ml、3. 5000mg/ml、l. 7500mg/ml、0. 8750mg/ml、0. 4375mg/ml、0. 2188mg/ml、0. 1094mg/ml，0. 45iim滤膜过滤)共同培养48h、72h，4孔重复，另设空白对照组(含5% FCS的DMEM培养基)，去培养基(翻板)，每孔加20iUMTT溶液，pH7. 2PBS，浓度为5mg/ml，过滤除菌，置棕色小瓶中，4t:冰箱保存。孵育4h，每孔加入二甲基亚砜(匿SD)100iU，在微型混合器上振荡2min， 10min后于酶标仪上测定0D490值。存活率=(药物组OD值/对照组OD值)X 100% 。抑制率=(1-药物组OD值/对照组OD值)X 100 % 。
统计学方法数据以X±S表示，进行方差分析和组间q检验，P < 0. 05为差异具
有显著性意义。 2.试验结果 鳖甲提取物分离物质组分对肝星状细胞(HSC-T6)增殖影响的试验结果表明，分子量小于6000的肽类物质组MTT法的OD值明显低于空白组和分子量大于6000的物质组，中位值差异均非常显著(P < 0. 01 0. 001)。当大鼠肝星状细胞系(HSC-T6)与鳖甲提取物分离物质组分分别共同培养48小时和72小时，鳖甲提取物分子量大于6000的物质组分对肝星状细胞增殖的抑制率分别为-119. 76%和-58. 91%;分子量小于6000物质组分的抑制率则为5.89% 68. 74% (培养72小时结果)，中位抑制率51. 67% 。从而确定了鳖甲提取物中分子量小于6000的物质组分为其抗肝纤维化的有效物质部位。
实施试验例2 :鳖甲提取物分子量小于6000的肽类物质对TGF- P工剌激的LX_1细胞活化及胶原合成的影响 y-干忧素(IFN-y)是目前已知的作用最强的抗肝纤维化细胞因子。以往的体外及动物实验均证实IFN-y可有效地改善日本血吸虫、四氯化碳、二甲基亚硝胺等引起的肝纤维化。本实验通过Western blot法检测鳖甲粗多肽成品(分子量< 6000) 、 IFN-y等各作用组、对照组对TGF-I3 :剌激的LX-1细胞I、III型胶原和a -SMA表达的影响，探讨鳖甲中多肽类成分抗肝纤维化的活性和作用机制。
1.材料与方法 细胞系人肝星状细胞系LX-1由美国Mount Sinai医学院肝病科Friedman SL教
授惠赠。 主要试剂IFN-y、 TGF-I^(美国R&D公司)，DMEM培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司)，P-肌动蛋白(P-actin)多克隆抗体、羊抗III型胶原多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，小鼠抗a -SMA和I型胶原单克隆抗体(美国Sigma Aldrich公司)，IgG-HRP羊抗兔、兔抗羊和抗小鼠第二抗体(美国Santa Cruz公司)，SDS-PAGE蛋白电泳及转膜试剂，Western-blot试剂，PVDF膜，ECL显色剂，Re-blot洗膜试剂。
LX-1细胞的培养按文献的方法培养LX-1细胞系，于37t:、饱和湿度、体积分数5% C02条件下，含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养。 膜透析法提取分离鳖甲分子量小于6000的肽类物质的制备方法同"发明内容"项下"l. (1)、 (2)"。 药物处理、Western-blot法检测将LX-1按1 X 106接种于10cm的培养皿，待细胞贴壁，加入含不同浓度药物的培养基(2XFCS-DMEM，培养时间48h)预处理2h后，加入800pg/ml重组TGF-13 p37。C、5X C02培养72h。加200iil/dish的细胞裂解液，用机械法收集细胞，冰浴30min， 10000rpm离心10min，收集上清液用BCA protein assay试剂盒进行总蛋白定量。取40ug蛋白加上样缓冲液煮沸10min变性，进行10% SDS-PAGE电泳后，电转移至醋酸纤维素膜，5X脱脂奶粉室温封闭2h，加入相应的一抗(Santa Cruz)分别以封闭液适当稀释，将PVDF膜浸泡其中，摇床缓慢4t:反应过夜；洗膜4次每次10min，加辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1 : 2000， Santa Cruz)，室温反应2h ;洗膜5次后ECL化学发光显色、曝光，胶片作激光密度扫描，结果以I型胶原、III型胶原、a-SMA与对应的P-肌动蛋白(Actin)的密度积分比值来表示蛋白的相对表达量。实验以Actin为内参照，作空白对照、TGF-13 i剌激对照和hIFN- y对照。
统计学方法同"实施试验例1"项下"1."。
2.试验结果 Western blot法检测鳖甲粗多肽成品对TGF_ P i剌激的LX_1细胞活化及胶原合成影响的试验结果显示TGF-P !剌激组LX-1细胞Col I、 Col III、 a -SMA表达显著高于空白对照组(P < 0. 01) ;LX-1细胞IFN-y及鳖甲粗多肽成品10、5、lmg/ml作用组三种蛋白表达显著低于TGF-P工剌激对照组(P < 0. 01);鳖甲粗多肽成品10、5mg/ml组三种蛋白表达显著低于IFN-y作用组(P < 0. 05);鳖甲粗多肽成品10mg/ml组三种蛋白表达显著低于空白对照组(P < 0. 05);鳖甲粗多肽抑制TGF-P i剌激的LX-1细胞Col I、 Col III、a -SMA蛋白表达在实验浓度范围呈现量效依赖关系。 采用Western blot法，以目前抗肝纤维化作用最强的药物IFN_ Y作为对照，检测鳖甲提取物中分子量小于6000的肽类物质对TGF-P i剌激的LX-1细胞I、 III型胶原和a-SMA蛋白表达的影响。试验结果表明，鳖甲提取物分子量小于6000的肽类物质能有效抑制肝星状细胞激活及胶原合成，从而阻抑肝纤维化的发展，其抑制效果呈现量效关系，高中剂量的抑制效果明显优于对照药物IFN-y ，从而进一步确定了鳖甲提取物分子量小于6000的肽类化合物为其抗肝纤维化的有效物质部位。
权利要求
一种鳖甲抗肝纤维化提取物的制备方法，其特征在于该方法包括(1)称取常规研磨的鳖甲粉50---100重量份，加蒸馏水100-300b量份，超声提取5--30分钟，抽滤，滤渣再加蒸馏水100-300重量份，超声提取5--15分钟，抽滤；合并两次产生的滤液，冷冻干燥后得冻干粉；(2)用加蒸馏水0.1-5重量份溶解上述制得的冻干粉，将水溶液装于的半透膜内，置100-150重量份蒸馏水中透析1--10小时，温度为2-10℃；同法再透析一次，合并两次膜外透析液，真空冷冻干燥，收集A型冻干粉0.1-1.0重量份。F2009101547927C0000011.tif
2. 根据权利要求1所述的鳖甲抗肝纤维化提取物的制备方法，其特征在于取上述膜内液体，将膜袋置50-100重量份蒸馏水中透析l一6小时，温度为2-10°C ;同法透析三次，弃去膜外透析液，将膜内液体真空冷冻干燥，收集B型冻干粉0. 5-10重量份。
全文摘要
一种鳖甲抗肝纤维化提取物的制备方法，该方法包括(1)称取常规研磨的鳖甲粉50---100重量份，加蒸馏水100-300重量份，超声提取5--30分钟，抽滤，滤渣再加蒸馏水100-300重量份，超声提取5--15分钟，抽滤；合并两次产生的滤液，冷冻干燥后得冻干粉；(2)用加蒸馏水0.1-5重量份溶解上述制得的冻干粉，将水溶液装于的半透膜内，置100-150重量份蒸馏水中透析1--10小时，温度为2-10℃；同法再透析一次，合并两次膜外透析液，真空冷冻干燥，收集A型冻干粉0.1-1.0重量份；本发明确定了鳖甲抗肝纤维化活性部位为分子量小于6000的多肽类物质，从而为诠释鳖甲抗肝纤维化的药效物质基础提供了科学依据，为将鳖甲提取物的活性肽类物质开发成高科技含量抗肝纤维化药物和保健食品奠定了坚实基础。
文档编号A61K35/56GK101708189SQ20091015479
公开日2010年5月19日 申请日期2009年12月8日 优先权日2009年12月8日
发明者刘焱文, 张赤志, 邵志华, 高建蓉 申请人:浙江衢化医院;湖北中医学院;巨化集团公司