专利名称：：迟缓爱德华菌弱毒菌株及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及水产养殖动物病害防治技术，具体的说是防治迟缓爱德华菌(Edwardsiellatarda)感染的迟缓爱德华菌弱毒菌株及应用。
背景技术：
：迟缓爱德华菌是一种革兰氏阴性致病菌，感染宿主范围广，可以感染多种低等和高等动物。在水产养殖动物中，该菌是鱼类、两栖类、爬行类的重要致病菌。由其引起的爱德华菌病是养殖鱼类常见的传染病，对养殖动物的健康和水产养殖业危害巨大。在我国，已经从养殖的牛蛙、鳖、鳗鲡、牙鲆、大菱鲆、真鲷等多种动物中分离到致病性的爱德华菌。由于在生产过程中使用各种抗生素进行疾病的防治，已经在世界各地分离到越来越多的爱德华菌抗药性菌株，其中多数菌株呈多重抗药性，不仅使治疗效果下降，而且多种抗药性菌株和抗药质粒的存在增加了环境的压力，对环境造成严重的威胁。早在1981年，国际上就成立了世界《慎用抗生素联盟》，其成员国已达到90多个国家。目前，不少国家已经明令禁止在动物饲料中使用抗生素添加剂。我国加入WTO后，解决抗生素残留等问题已经刻不容缓。为了减少抗生素对环境的影响，通过免疫途径防治爱德华氏菌病发生无疑是一种最佳的方式。人们对迟钝爱德华氏菌的各种疫苗组成(包括灭活菌体细胞苗、脂多糖LPS、去类脂A的多糖、溶血素)和免疫途径(包括注射、浸泡、口服)进行了大量的工作，但这些灭活疫苗或亚单位疫苗的保护效果都不理想，没有达到疾病防控的要求。迟缓爱德华菌的毒力因子有溶血素、软骨素酶、皮下坏死毒素、过氧化氢酶以及蛋白分泌系统，如三型(T3SS)和六型(T6SS)分泌系统，这些致病因子参与了细菌的黏附、定殖、侵袭和在动物宿主体内的繁殖和扩散过程。由于迟缓爱德华菌可侵入宿主的上皮细胞和吞噬细胞，并在细胞内生长和繁殖，因此作为一种有效的疫苗，只有系统地剌激动物体液和细胞的免疫应答反应才可能达到防治爱德华菌病的目的。由于灭活疫苗或亚单位疫苗存在保护抗原不完全、免疫应答反应不全面，尤其是它们主要引起动物的体液免疫应答而不能有效地剌激细胞免疫应答，是疾病防控效果不理想的根本原因；其次是灭活疫苗和亚单位疫苗主要通过注射方式进行鱼类免疫，存在劳动力成本高、给药不方便、容易引起动物应激等副作用。因此到目前为止，还没有可用的迟缓爱德华菌疫苗进入市场。弱毒活疫苗对动物低毒活无毒，能够有效地激发动物的体液和细胞免疫应答，为动物提供全面的免疫保护，是目前疫苗开发领域的主要发展方向之一；同时以弱毒活疫苗作为表达异源抗原的载体而进行多价疫苗的开发是国际的前沿和热点。目前，美国专利有利用利福平(rifampicin)培养基对迟缓爱德华菌进行多次传代的方法筛选弱毒株作为弱毒活疫苗(UnitedStatesPatent7067122)，该方法得到的弱毒株遗传背景不清楚，细菌毒力减弱的机理不明确，在使用时容易造成毒力回复，同时难以对疫苗株进行环境监控。利用转座子或基因插入失活技术构建的弱毒疫苗携带有抗生素和其他外源基因片断，施用时容易将抗生素和外源基因片断释放到环境，存在有基因转移或整合到其他病原体或其他生物的潜在危险。因此这些弱毒活疫苗难以通过各国的生物制品安全检察管理机构的审批法规，从而难以实现商品化。无标记基因突变技术可以对目的基因进行缺失突变。通过对多个目的基因的大片段缺失，大大降低了施用时由于毒力回复而带来的环境传播危险。另外，弱毒株不带任何外源的抗生素筛选标记和外源基因片段，遗传背景清晰、毒力减弱机理明确，易于区分疫苗株和野生型菌株，便于对疫苗株进行环境监控，提高疫苗的安全性和可控性。同时，以无标记基因突变弱毒突变株作为疫苗载体表达异源抗原制备多价疫苗具有防治多种传染病的潜力，因而是目前国际的研究前沿和热点领域。
发明内容本发明的目的在于提供一种新的迟缓爱德华菌弱毒活疫苗，以消除传统弱毒疫苗存在的对环境和动物潜在的安全风险，为防治养殖鱼类爱德华菌病提供一种安全、经济的迟缓爱德华菌弱毒菌株及应用。为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为迟缓爱德华菌弱毒菌株，迟缓爱德华菌野生毒株MZLLSE40的aroA基因突变株，所述迟缓爱德华氏菌突变株为MZLLSE40aroA，其保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.2886，其突变株MZLLSE40aroA不含外源抗生素筛选标记和外源基因片段；迟缓爱德华菌野生毒株MZLLSE40的aroA基因和esrB基因的突变株，所述迟缓爱德华氏菌突变株为MZLLSE40aroAesrB，其保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.2887，其突变株MZLLSE40aroAesrB不含外源抗生素筛选标记和外源基因片段。所述突变株MZLLSE40aroA其于2009年1月19日，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区大屯路，保藏编号为CGMCCNo.2886分类名称为迟缓爱德华氏菌Edwardsiellatarda。所述突变株MZLLSE40aroB其于2009年1月19日，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区大屯路，保藏编号为CGMCCNo.2887分类名称为迟缓爱德华氏菌Edwardsiellatarda。所述菌株可采用胰大豆蛋白胨培养基进行培养，同时每升培养基中补充苯丙氨酸20mg，酪氨酸20mg和色氨酸20mg。迟缓爱德华氏菌株MZLLSE40aroA或迟缓爱德华氏菌株MZLLSE40aroAesrB经活化培养和发酵培养后，将106-109cfu/mL的迟缓爱德华氏菌株MZLLSE40aroA或迟缓爱德华氏菌株MZLLSE40aroAesrB的细菌细胞与无菌磷酸缓冲盐溶液混合，作为防治养殖鱼类爱德华菌病的弱毒活疫苗。将上述弱毒活疫苗注射给药浓度为106-108cfu/尾，浸泡给药浓度为106-108cfu/mL，浸泡时间1030min。本发明所具有的优点本发明由迟缓爱德华野生菌株MZLLSE40得到的二株无标记基因缺陷突变株MZLLSE40aroA和MZLLSE40aroAesrB，与野生菌株MZLLSE40相比毒力大大下降，用作疫苗可有效保护实验用鱼防御强致病性爱德华菌野生型毒株的感染。本发明弱毒活疫苗可根据4需要，以注射或浸泡方式给药免疫而获使免疫鱼获得高效的免疫保护。此外，本发明弱毒活疫苗可用于各种脊椎动物防治爱德华菌病，包括各种经济养殖鱼和淡水养殖鱼、观享鱼、鳖、蛙等。本发明提供的迟缓爱德华菌弱毒疫苗不含任何外源基因片段和外源抗生素筛选标记，对环境不存在外源基因转移和抗生素基因传播的危险。由于采用基因缺失突变手段进行毒力基因和必须氨基酸代谢途径合成基因的大片段缺失、弱毒疫苗毒力不可回复、生长能力受限于必须氨基酸，极大地消除在环境和动物传播大量病原体的危险；突变的遗传背景清楚，减毒机理明确，易于区分疫苗株和野生型菌株，便于对疫苗株进行环境监控，提高疫苗的安全性和可控性。具体实施例方式实施例1:弱毒活疫苗制备l)TSB培养基胰蛋白胨17.0g/L，大豆蛋白胨3.0g/L，NaC15.0g/L，K2HP042.5g/L，葡萄糖2.5g/L，苯丙氨酸20mg/L，酪氨酸20mg/L，色氨酸20mg/L，pH7.3。将上述成分溶解于1000ml蒸馏水中，用10X的NaOH调节pH，于121磅、125t:灭菌15分钟，冷却置室温备用。2)TSA培养基胰蛋白胨17.Og/L，大豆蛋白胨3.0g/L，NaC15.0g/L，K2HP042.5g/L，葡萄糖2.5g/L，苯丙氨酸20mg/L，酪氨酸20mg/L，色氨酸20mg/L，琼脂粉1.5g/L，pH7.3。将上述成分溶解于1000ml蒸馏水中，用10%的NaOH调节pH，于121磅、125t:灭菌15分钟，冷却至6(TC制成平板备用。3)PBS缓冲液Na2HP042H202.74g/L，NaH2P04H200.63g/L。将上述成分溶解于1000ml蒸馏水，于121磅、125t:灭菌15分钟，冷却置室温备用。迟缓爱德华菌野生毒株MZLLSE40的aroA基因突变株，所述迟缓爱德华氏菌突变株为MZLLSE40aroA，MZLLSE40aroA缺失了野生型菌株MZLLSE40染色体上的芳香氨基酸合成代谢途径的aroA基因，其保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.2886，其突变株MZLLSE40aroA不含外源抗生素筛选标记和外源基因片段；迟缓爱德华菌野生毒株MZLLSE40的aroA基因和esrB基因的突变株，所述迟缓爱德华氏菌突变株为MZLLSE40aroAesrB，MZLLSE40aroAesrB缺失了染色体上的aroA基因和三型分泌系统上的esrB基因，其保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.2887，其突变株MZLLSE40aroAesrB不含外源抗生素筛选标记和外源基因片段。本发明的迟缓爱德华菌株MZLLSE40菌株为野生型毒株，从我国北方沿海养海水养鱼场爆发爱德华氏菌病的大菱鲆鱼体内分离，为致病性菌株。其生化鉴定特征符合伯杰氏细菌系统鉴定手册(第九版)。疫苗制备取-S(TC保存的迟缓爱德华氏菌株MZLLSE40aroA或迟缓爱德华氏菌株MZLLSE40aroAesrB菌株划线接种于TSA平板，在25-30。C培养48小时。挑取3-5个菌落，接种于lOOmL的TSB培养基，在25-30。C摇床(200转/分钟)培养12-18小时，取5-10%(V/V)的量接种500mL的TSB培养基，25-30。C摇床(200转/分钟)培养12-18小时。收活细菌菌液，用PBS洗涤三次，离心收集菌体(4000Xg，10分钟，4t:)，而后混合于PBS缓冲液其中细菌浓度为10S-10、fu/mL，保存于fC备用。实施例2:以丝竹鱼(TrichogastertrichopterusPallas)为试验动物的半数致死量LD5。的测定体重为7-8g的健康试验鱼暂养于100L水族箱，配以流动循环水处理和净化系统，养殖水温维持20-22°C。暂养2周后，随机分组至10L试验水族箱，每个水族箱10尾鱼，继续暂养2周。试验水族箱每天上午换水一次，换水量为1/2，维持水温20-22t:。在人工感染试验时，每组实验鱼分别注射不同稀释浓度(105109cfU/mL)的弱毒疫苗株和野生型菌株，每尾鱼腹部肌肉注射O.1M1，对照组注射PBS0.lml/尾。观察14天，记录每组每天的死亡鱼数，计算累计死亡数和死亡率，计算LD5。值(见表1)。表1迟缓爱德华菌野生型和弱毒株对丝竹鱼的致病力试验<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上述结果表明，相对于野生型迟缓爱德华菌株MZLLSE40，弱毒株的毒力显著降低，其中MZLLSE40aroA的毒力下降约41倍，MZLLSE40aroAesrB的毒力下降了1000倍以上。实施例3:以牙鲆(Paralichthysolivaceus)为试验动物的半数致死量LD5。的测定体长为8-10cm的健康试验鱼暂养于的1000L水族箱，配以流动循环水处理和净化系统，养殖水温维持18-2(TC。暂养4周后，随机分组至20L试验水族箱，每个水族箱10尾鱼，继续暂养2周。试验水族箱每天上下午各换水一次，换水量为1/2，维持水温18-2(TC。在人工感染试验时，每组实验鱼分别注射不同稀释浓度(105-106cfu/mL)的弱毒疫苗株和野生型菌株，每尾鱼腹部肌肉注射O.lmL，观察14天，记录每组每天的死亡鱼数，计算累计死亡数和死亡率，计算LD5。值(见表2)。表2迟缓爱德华菌野生型和弱毒株对牙鉀的致病力试验<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>上述结果表明，相对于野生型迟缓爱德华菌株MZLLSE40，弱毒株的毒力显著降低，其中MZLLSE40aroA的毒力下降了约31倍，MZLLSE40aroAesrB的毒力下降了1000倍以上。实施例4:迟缓爱德华菌在牙鉀体内的存活实验体长为8-10cm的健康试验鱼暂养4周后随机分为4组，每组20尾。将制备的迟缓爱德华菌液采用腹部肌肉注射的方式感染实验鱼，野生菌株MZLLSE40的注射剂量为1.03X105cfu/尾，MZLLSE40aroA的注射剂量为5.4X105cfu/尾，MZLLSE40aroAesrB的注射剂量为7.8X106cfu/尾，对照组注射0.1ml/尾的PBS。养殖水温18_20°C。每7天从每组分别取鱼3尾，无菌取肾脏混合称重后以PBS缓冲液匀浆、稀释，在TSA平板涂布进行细菌计数，每稀释度3个平板，记录细菌数量并取平均值(表3)。表3迟缓爱德华菌在牙鲆体内的存活实验<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*为第6天濒死鱼肾脏的细菌数量，到第6天时全部实验鱼死亡。上述结果显示，野生菌株MZLLSE40注射后的第6天，实验鱼全部死亡，濒死鱼呈现典型的败血症状，濒死鱼肾脏内的细菌数量为7.97X109cfu/g;弱毒株在鱼肾脏的细菌数量逐渐下降，其中MZLLSE40aroA株在第28天检测不到细菌，MZLLSE40aroAesrB在第35天检测不到细菌。这些结果表明，突变株细菌在鱼体内的生存能力极大地下降。实施例5:以牙鲆为实验动物的注射免疫效力试验取健康试验鱼随机分为5组，每组30尾鱼。将制备的迟缓爱德华菌液采用腹部肌肉注射的方式进行免疫，MZLLSE40aroA株的注射浓度为5.4X105cfu/尾、5.4X107cfu/尾，MZLLSE40aroAesrB株的注射浓度为8X106cfu/尾、8X108cfu/尾，对照组注射0.lml/尾的PBS。养殖水温18-20免疫4周后将各种试验组大菱鲆用野生型迟缓爱德华菌LSE40活菌以4.5X105cfu/尾的剂量进行攻毒。在7天内统计免疫组和对照组死亡数，计算免疫保护率(见表4)免疫保护率计算公式为免疫保护率(RPS)%=(对照组死亡率_免疫组死亡率)/对照组死亡率X100%表4迟缓爱德华菌弱毒疫苗免疫牙鲆的免疫保护率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>从上可以看出，随着接种剂量增加，弱毒疫苗的免疫保护率也增加。在105cfu/尾107cfu/尾的接种剂量范围显示良好的防治爱德华菌感染的效果。实施例6:以牙鉀为试验动物的浸泡免疫效力试验取健康试验鱼随机分5组，每试验组30尾鱼。将制备的迟缓爱德华菌分别以无特定病原体(SPF)海水配制成浓度为106Cfu/mL、108cfu/mL的疫苗溶液。每组鱼在不同浓度的疫苗溶液中浸泡30分钟，对照组以无菌PBS浸泡30分钟，水温保持18-2(TC。免疫30天后对各试验组鱼进行肌肉注射攻毒，攻毒浓度为4.5X105cfu/尾。在7天内统计免疫组和对照组死亡数，计算免疫保护率(见表5)。表5迟缓爱德华菌弱毒疫苗免疫大菱鲆30天后的免疫保护效力<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>从上可以看出，随着浸泡接种剂浓度增加，弱毒疫苗的免疫保护率也增加，以108cfu/mL的浸泡接种浓度获得的免疫保护效果最好。权利要求一种迟缓爱德华菌弱毒菌株，其特征在于迟缓爱德华菌野生毒株MZLLSE40的aroA基因突变株，所述迟缓爱德华氏菌突变株为MZLLSE40aroA，其保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.2886，其突变株MZLLSE40aroA不含外源抗生素筛选标记和外源基因片段；迟缓爱德华菌野生毒株MZLLSE40的aroA基因和esrB基因的突变株，所述迟缓爱德华氏菌突变株为MZLLSE40aroAesrB，其保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.2887，其突变株MZLLSE40aroAesrB不含外源抗生素筛选标记和外源基因片段。2.按权利要求1所述的迟缓爱德华菌弱毒菌株，其特征在于所述菌株可采用胰大豆蛋白胨培养基进行培养，同时每升培养基中补充苯丙氨酸20mg，酪氨酸20mg和色氨酸20mg。3.按权利要求l所述的迟缓爱德华菌弱毒菌株的应用，其特征在于迟缓爱德华氏菌株MZLLSE40aroA或迟缓爱德华氏菌株MZLLSE40aroAesrB经活化培养和发酵培养后，将106-109cfu/mL的迟缓爱德华氏菌株MZLLSE40aroA或迟缓爱德华氏菌株MZLLSE40aroAesrB的细菌细胞与无菌磷酸缓冲盐溶液混合，作为防治养殖鱼类爱德华菌病的弱毒活疫苗。4.按权利要求3所述的迟缓爱德华菌弱毒菌株的应用，其特征在于将上述弱毒活疫苗注射给药浓度为106-108(^11/尾，浸泡给药浓度为1(f-108cfu/mL，浸泡时间1030min。全文摘要本发明涉及水产养殖动物病害防治技术，具体的说是防治迟缓爱德华菌感染的迟缓爱德华菌弱毒菌株及应用。迟缓爱德华氏菌突变株为MZLLSE40aroA，其保存于CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.2886，迟缓爱德华氏菌突变株为MZLLSE40aroAesrB，其保存于CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.2887。将106-109cfu/mL的迟缓爱德华氏菌株MZLLSE40aroA或迟缓爱德华氏菌株MZLLSE40aroAesrB的细菌细胞与无菌磷酸缓冲盐溶液混合，作为防治养殖鱼类爱德华菌病的弱毒活疫苗。本发明涉及菌株的毒力相关基因和营养代谢相关基因框内大片段缺失、毒力不可回复，不含有外援基因片段和抗生素抗性标记，对环境和动物安全。文档编号A61P31/04GK101705198SQ20091016459公开日2010年5月12日申请日期2009年7月17日优先权日2009年1月23日发明者李杰,杨佳银,王波,肖鹏,茅云翔,莫照兰申请人:中国科学院海洋研究所