专利名称：：喹唑啉生物碱及其在抗肿瘤方面的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新颖的喹唑啉生物碱类化合物，以及该类化合物在制备肿瘤细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的用途。生物碱是中草药、生物及海洋生物中抗肿瘤的主要活性成分。已发现的具有抗肿瘤活性的生物碱类主要有紫杉醇类生物碱、长春碱类苦参类生物碱、喜树碱类、小檗碱、吴茱萸碱、粉防己碱、龙葵碱等。目前从自然界已经分离得到的喹唑啉生物碱类化合物总共仅10个化合物(fumiquinazolinesAJ)，其中fumiquinazolinesAG生产于海水鱼Pseudolabrusjaponicus肠道分离的烟曲霉，而fumiquinazolinesH禾PI生产于海洋被囊动物Ecteinascidiaturbinata中分离的真菌Acremoniumsp.。喹唑啉生物碱类化合物从生源学的角度看，这些分子是由邻氨基苯丙酸，色氨酸，丙氨酸衍生的三肽和四肽衍生物。文献报道fumiquinazolinesAG对P388细胞具有中等强度的细胞毒活性，H和I则具有弱的抗真菌活性。
发明内容本发明旨在提供一类新化学结构的具有肿瘤细胞增殖抑制等抗肿瘤活性的化合物，具体而言，是要提供一种喹唑啉生物碱类化合物。本发明的另一目的在于提供该类新化合物在制备肿瘤细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的用途。本发明首次从自然界微生物发酵物中发现了一种新的喹唑啉生物碱类式I化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>式I式I中，其中，&为氢、羟基、烃基、酰氧基、氨基或酰氨基；R2为氢、烃基。优选的本发明化合物是&为羟基；R2为甲基的式I化合物。本发明式I化合物的制备方法是，通过发酵培养可生产喹唑啉生物碱类化合物的微生物，首先获取含式I化合物的发酵产物，再利用相关专业技术人员熟知的分离纯化技
背景技术：
：术，如液液萃取、柱层析、高效液相等，纯化制备并获得式I化合物。本发明采用丽丝胺罗丹明B(sulforhodamineB，SRB)法、四氮唑盐(MTT)还原法和流式细胞术结合显微镜下检测细胞形态特征的方法，测试评价了本发明式I化合物对小鼠乳腺癌tsFT210细胞、人肺癌A549细胞、人肝癌BEL-7402细胞、小鼠白血病P388细胞、人白血病HL60细胞的细胞增殖抑制、细胞周期抑制和细胞凋亡诱导以及对肿瘤细胞的直接杀伤等作用。实验证实，式I化合物对肿瘤细胞可通过抑制细胞增殖、诱发癌细胞凋亡或直接的杀伤等方式，显示抑制肿瘤细胞增殖的生物学活性，从而发挥其抗肿瘤作用，特别是对BEL-7402和P388细胞的增殖抑制作用较强。本发明的式I化合物与药物可接受的各种载体、赋形剂或辅料配伍，可制成作肿瘤细胞杀伤剂等抗肿瘤药物，用于肿瘤的治疗。具体实施例方式下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。在如下的实施例中所指的化合物I的化学结构是式I化合物，其中&为羟基；R2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式I实施例化合物I的体外抗肿瘤活性测试l实验样品及实验方法被测样品溶液的配制测试样品为化合物I纯品。精密称取适量样品，用甲醇配制成所需浓度的溶液，供测活性。细胞系及细胞的继代培养采用人肺癌A549细胞、人肝癌BEL-7402细胞、人白血病HL60细胞、小鼠乳腺癌tsFT210细胞及小鼠白血病P388细胞等癌细胞系。各种细胞均用含10%FBS的RPMI-1640培养基，在32°C(tsFT210和P388细胞)或在37°C(A549、HL60及BEL-7402细胞)于通入5%二氧化碳的培养箱中继代培养。细胞增殖抑制活性测试方法丽丝胺罗丹明B(SRB)法取对数生长期的人肺癌A549细胞、人肝癌BEL-7402细胞或小鼠乳腺癌tsFT210细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升2X105个细胞的细胞悬液，按每孔200微升接种于96孔板中，每孔加入2微升不同浓度的样品或空白溶液，32。C下培养17小时(tsFT210细胞)或37。C下培养24小时(A549或BEL—7402细为甲基胞)。取药物作用下培养后的细胞，首先在光学显微镜下观察药物处理引起的形态学变化，判断有无细胞周期抑制，细胞凋亡或细胞坏死的形态学特征，继而在4°C、3000转/分钟离心3分钟，吸去上清。每孔细胞中加入20%三氯醋酸50微升，置于4t:固定1小时，用水冲洗5次并空气干燥。每孔加入0.4%SRB的醋酸溶液50微升并在室温静置30分钟。用1%醋酸水清洗4次，除去未结合的游离SRB染料。每孔加入150微升Tris缓冲液(10mmo1/L，pH10.5)溶解蛋白结合染料并利用MD公司产SPECTRAMAXPlus型酶标仪测定每孔在520nm处的光密度(OD)值。在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔，另设三孔空白对照和无细胞调零孔(如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞调零)。各孔OD值先做相应无细胞调零，再取三孔平均OD值按IRX二(0D站对照-0D样。。。)/0D空自对照X100X式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR%)。四氮唑盐(MTT)法取对数生长期的人白血病HL60细胞和小鼠白血病P388细胞，将细胞密度调至每毫升2X105个细胞，按每孔200微升接种干96孔细胞培养板中，于37t:通入5%C02的培养箱中培养4小时。每孔加样品液或空白液各2微升，培养24小时后，每孔加MTT液(MTT的每毫升5毫克生理盐水溶液)10微升，继续培养4小时，37°C、2000转/分钟离心8分钟，吸去上清。每孔加入匿SO各100微升，在微量振荡器上振荡15分钟，至结晶完全溶解后，利用MD公司产SPECTRAMAXPlus型酶标仪测定每孔在570nm处的吸光值(OD值)。在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔，另设三孔空白对照和无细胞调零孔(如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞调零)。各孔OD值先做相应无细胞调零，再取三孔平均OD值按IR%=(OD空自对照-OD样。。。)/0D空自对照X100X式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR%)。2实验结果化合物I对癌细胞增殖的抑制活性在SRB法测试中，化合物I在100iig/mL，10yg/mL和1yg/mL的浓度下，处理17小时，对小鼠乳腺癌tsFT210细胞增殖的抑制率分别为18.8%，18.6%和16.9%。在SRB法或MTT法测试中，不同浓度的化合物I对人肺癌A549细胞、人肝癌BEL-7402细胞、人白血病HL60细胞和小鼠白血病P388细胞的增殖抑制结果见表1。表1不同浓度的化合物I对癌细胞增殖的抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>形态学检测结果在光学倒置显微镜下观测到，经高浓度的化合物I处理后，各种癌细胞呈不同程度的典型的坏死性细胞的形态学特征，表明化合物I在高浓度时对哺乳动物癌细胞具有一定的直接杀伤性细胞毒活性。3结论化合物I对多种人癌细胞及哺乳动物癌细胞具有直接杀伤作用和对细胞增殖的抑制，特别是对BEL-7402和P388细胞的增殖抑制作用较强。这些结果表明化合物I可制成肿瘤细胞杀伤剂等抗肿瘤药物，用于肿瘤的治疗。权利要求式I化合物，其特征在于，R1为氢、羟基、烃基、酰氧基、氨基或酰氨基；R2为氢、烃基。式IF2009101725178C0000011.tif2.权利要求1所述的式I化合物，其特征在于其中&为羟基；R2为甲基。3.权利要求1所述的式I化合物I，其特征在于在制备肿瘤细胞增殖抑制剂中的用途。4.权利要求1所述的式I化合物，其特征在于在制备抗肿瘤药物中的用途。全文摘要本发明涉及新颖的喹唑啉生物碱类化合物及其在抗肿瘤方面的用途。本发明采用新颖化学结构的喹唑啉生物碱类化合物作为肿瘤细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂。本发明的喹唑啉生物碱类化合物对多种人癌细胞及哺乳动物癌细胞具有直接杀伤作用和对细胞增殖的抑制，特别是对BEL-7402和P388细胞的增殖抑制作用较强。文档编号A61K31/517GK101709061SQ20091017251公开日2010年5月19日申请日期2009年11月9日优先权日2009年11月9日发明者刘睿,张敏,赵文英,韩小贤申请人:河南工业大学