专利名称：聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医用材料及组织工程技术，具体涉及一种聚乳酸/壳聚糖复合纳
米纤维支架及其制备方法与应用。
背景技术：
骨组织损伤已成为世界性多发病和常见病，虽然自体骨移植是治疗骨缺损的最佳方法，但其来源极其有限，远不能满足实际需求，骨组织工程为骨缺损的修复或重建提供了有效的途径。其中，细胞外基质的结构与功能对细胞生长与组织形成起关键调控作用。天然细胞外基质主要由蛋白多糖和胶原纤维组成，直径为50-500nm的胶原纤维构成纳米纤维网络，细胞正是通过这种纳米结构的外基质与周围环境发生作用。因此构建具有类细胞外基质结构和功能的纳米纤维支架，为细胞的生长、增殖和分化提供仿生的微环境，将有利于新组织的形成。 组织工程纳米纤维支架的构建方法主要有三种自组装、电纺丝与相分离。自组装技术构建的支架力学强度较低，不能满足骨组织工程的强度要求。电纺丝技术可以控制纳米纤维的尺寸，并且制得的支架强度也较高，但是支架的孔结构不能控制，得不到有利于细胞生长以及输送营养物质和细胞代谢产物的大孔结构。相比之下，相分离技术既能获得较高的支架强度，又能利用致孔剂对孔结构进行控制，通过控制相分离的条件还可以对纳米纤维的尺寸进行调控，是制备骨组织工程纳米纤维支架的有效方法。目前，常用单一材料的相分离来制备纳米纤维支架，如聚乳酸、聚e-己内酯纳米纤维支架等。但单一材料往往很难同时满足各方面的性能要求，例如聚乳酸虽然具有良好的力学性能、易于成型加工、可生物降解等优点，但存在亲水性差、细胞亲和力弱、降解产物偏酸性等缺点。
发明内容
本发明的目的是提供一种模拟细胞外基质的结构，为骨细胞提供良好的微环境，能够有效促进细胞迁移、生长、分化的一种仿生聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架及其制备方法与应用。 本发明的技术方案如下 —种聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架，该支架的基体是聚乳酸纳米纤维支架，在聚乳酸纳米纤维支架的外壁与内孔均匀分布有壳聚糖纳米纤维。 作为优选，所述聚乳酸纳米纤维支架的孔径大小为100 900iim，聚乳酸纳米纤维的直径大小为50 500nm。 作为优选，所述壳聚糖纳米纤维的直径大小为50 500nm。 —种聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架的制备方法，包括如下步骤 a)制备质量浓度为0. 01-0. 08g/ml的聚乳酸溶液； b)将步骤a)中得到的聚乳酸溶液滴加到装有明胶微球致孔剂的模具中，在_18°C l(TC下进行第一次相分离，该温度下保持1 24小时后移至_701:下保存1
324小时，然后冷冻干燥得到聚乳酸/致孔剂复合物； c)将步骤b)中得到的聚乳酸/致孔剂复合物置于萃取溶剂中，萃取致孔剂2 4 天，得到内孔连通的聚乳酸纳米纤维支架； d)将步骤c)中得到的聚乳酸纳米纤维支架先浸泡于壳聚糖醋酸溶液，所述壳聚 糖醋酸溶液中壳聚糖浓度为1X10—4 1X10—2g/ml，醋酸浓度为5X10—5 1X10—2g/ml ;使 壳聚糖溶液完全充满聚乳酸纳米纤维支架的内孔，取出支架置于_20°C -196t:下进行第 二次相分离10分钟 24小时，然后冷冻干燥得到聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架。
作为优选，步骤a)中，所述聚乳酸溶液的溶剂为良溶剂与非溶剂的混合溶剂，良 溶剂与非溶剂的体积比为80 : 20 95 : 5。所述的良溶剂是常温下对聚乳酸的溶解度较 大的溶剂，例如可以是三氯甲烷、二氯乙烷、1.4-二氧六环或四氢呋喃；而非溶剂是在常温 下对聚乳酸的溶解度很小甚至完全不溶解的溶剂，非溶剂更优选为吡啶、水、甲醇或乙醇。
作为优选，步骤b)中，所述的致孔剂是可以在聚乳酸支架内部形成孔形貌与孔径 大小分布均匀且相互连通的孔结构的物质，例如可以是石蜡、明胶或氯化钠。
作为优选，步骤b)中，所述致孔剂的粒径范围为100 900iim。
作为优选，步骤c)中，所述的萃取溶剂对致孔剂具有良好的溶解性，但不能使聚 乳酸支架发生溶解，例如可以是正己烷、环己烷或蒸馏水。 本发明制备的仿生聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架主要应用于制备用于修复 受损骨组织的骨替代材料。 本发明的基本原理如下本发明的出发点是选择两种性能互补的材料复合来制备 综合性能良好的骨组织工程支架。壳聚糖是天然存在的唯一碱性多糖，分子结构与细胞外 基质的多糖组分相似，具有优异的生物相容性和特殊的生物活性，且来源丰富，是目前应用 最为广泛的一种天然高分子生物材料，其缺点是机械性能差，正好与聚乳酸材料形成互补， 在组织工程研究中常被用来跟聚乳酸材料复合。由于相分离技术制备纳米纤维支架主要受 材料的相分离条件影响(包括浓度、温度和时间)，而不同材料的相分离条件不同。因此，控 制相分离条件，通过两次相分离可以制备仿生的聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架。
本发明与现有技术相比，具有以下优点 本发明方法制备的仿生聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架，更客观真实地模拟了 细胞外基质的结构，通过将聚乳酸纳米纤维支架与壳聚糖纳米纤维复合，并控制纳米纤维 的直径大小，既保证了支架较高的机械强度又能有效地促进细胞的迁移、生长和分化，有利 于提高受损骨组织的修复效率，具有良好的应用前景。
图1是实施例1所得聚乳酸纳米纤维支架(PLLA)在扫描电镜下的形态。 图2是实施例1所得PLLA与聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架(PLLA/CSNF)的
孔径与孔隙率的对比。 图3是实施例1所得PLLA在扫描电镜下的纳米纤维结构。
图4是实施例1所得PLLA/CSNF在扫描电镜下的形态。
图5是是实施例2所得PLLA的在扫描电镜下的形态。
图6是实施例2所得PLLA/CSNF的在扫描电镜下的形态。
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图7是实施例2所得PLLA与PLLA/CSNF力学性能对比图。 图8是实施例2所得PLLA与PLLA/CSNF上负载细胞生长曲线的对比图。
具体实施例方式
下面结合实施例，对本发明做进一步地详细说明，但本发明的实现方式并不局限 于此。 所用试剂或材料的商业来源 聚乳酸山东省医疗器械研究所 壳聚糖sigma-aldrich公司 石蜡上海标本模型厂 明胶天津市科密欧化学试剂有限公司 氯化钠天津市大茂化学试剂厂 冰醋酸天津市富宇精细化工有限公司 三氯甲烷天津市富宇精细化工有限公司 二氯乙烷天津市富宇精细化工有限公司 1. 4_ 二氧六环天津市福晨化学试剂厂 四氢呋喃天津市富宇精细化工有限公司 吡啶天津市大茂化学试剂厂 甲醇天津市富宇精细化工有限公司 乙醇天津市大茂化学试剂厂 实施例1 : a)在搅拌下将聚乳酸溶解在三氯甲烷与甲醇的混合溶剂中，三氯甲烷与甲醇的体 积比为95 : 5，得到质量浓度为0.08g/ml的聚乳酸溶液。 b)将步骤a)中得到的聚乳酸溶液滴加到装有明胶微球致孔剂的模具中，明胶 微球的粒径为300 450 m。在_10°C下进行第一次相分离，该温度下保持24小时后移 至-7(TC下保存2小时，然后冷冻干燥得到聚乳酸/明胶微球复合物。 c)将步骤b)中得到的聚乳酸/明胶微球复合物置于蒸馏水中，萃取明胶微球3 天，每天更换3次溶剂，得到聚乳酸纳米纤维支架，其形态如图1所示，聚乳酸纳米纤维支架 的内孔高度连通，孔径大小为300 450iim，孔隙率高达90X以上，如图2所示。大孔内壁 由直径50 500nm的聚乳酸纳米纤维组成，如图3所示，具有类似于天然细胞外基质的胶 原纳米纤维结构(50 500nm)，此仿生的纳米纤维结构将有利于细胞的粘附与生长。
d)将步骤c)中得到的聚乳酸纳米纤维支架浸泡在浓度为5X 10—4g/ml壳聚糖醋 酸溶液中，醋酸浓度为5X10—5g/ml，抽真空使壳聚糖溶液完全充满聚乳酸纳米纤维支架的 内孔，取出支架置于_701:下进行第二次相分离5小时，然后冷冻干燥得到聚乳酸/壳聚糖 复合纳米纤维支架，其形态如图4所示，壳聚糖纳米纤维的平均直径为 100nm，在聚乳酸 支架内孔穿插并均匀分布，聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架仍然保持高度的孔洞连通结 构，孔隙率仍在90%左右。壳聚糖纳米纤维的引入将有利于提高支架的生物活性，促进细胞 的黏附与生长，同时壳聚糖纳米纤维在聚乳酸支架内孔的穿插架构也可以促进细胞向支架 的孔洞中心生长，利于新组织的形成。
实施例2 : a)在搅拌下将聚乳酸溶解在二氧六环与水的混合溶剂中，二氧六环与水的体积比 为90 : 10，得到质量浓度为0.03g/ml的聚乳酸溶液。 b)将步骤a)中得到的聚乳酸溶液滴加到装有石蜡微球致孔剂的模具中，石蜡微 球的粒径为300 450 ii m。在8"C下进行第一次相分离，该温度下保持6小时后移至_70°C 下保存6小时，然后冷冻干燥得到聚乳酸/石蜡微球复合物。 c)将步骤b)中得到的聚乳酸/石蜡微球复合物置于正己烷中，萃取石蜡微球4 天，每天更换3次溶剂，得到内孔连通的聚乳酸纳米纤维支架，其形态如图5所示，图中可见 聚乳酸纳米纤维支架的内孔高度连通，孔径大小为300 450 ii m，孔隙率高达90%以上。大 孔内壁由直径50 500nm的聚乳酸纳米纤维组成，具有类似于图2的仿生纳米纤维结构， 有利于细胞的生长。 d)将步骤c)中得到的聚乳酸纳米纤维支架浸泡在浓度为1 X 10—3g/ml壳聚糖醋 酸溶液中，醋酸浓度为2X10—、/ml，抽真空使壳聚糖溶液完全充满聚乳酸纳米纤维支架的 内孔，取出支架置于_196°〇下进行第二次相分离10分钟，然后冷冻干燥得到聚乳酸/壳聚 糖复合纳米纤维支架，其形态如图6所示。从图中可看出，壳聚糖纳米纤维的平均直径为 300nm，在聚乳酸支架内孔穿插并均匀分布，聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架仍然保持高 度的孔洞连通结构，孔隙率仍在90%左右。壳聚糖纳米纤维的引入将有利于提高支架的生 物活性，促进细胞的黏附与生长，同时壳聚糖纳米纤维在聚乳酸支架内孔的穿插架构也可 以促进细胞向支架的孔洞中心生长，利于新组织的形成。 此实例制得的聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架，通过使用拉力试验机测试其压 縮性能，得到的压縮模量如图7所示。可见通过在聚乳酸纳米纤维支架内孔引入壳聚糖纳 米纤维，不仅提高支架的生物活性，有利于促进细胞的黏附与生长，而且壳聚糖纳米纤维的 引入还使得聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架的力学性能比纯聚乳酸纳米纤维支架略有 提高，对维持细胞生长以及新组织形成提供了良好的支撑作用。 此实例制得的聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架，通过将SD大鼠骨髓干细胞植入 聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架中体外培养，采用MTT法来测定细胞的生长曲线，如图8 所示。结果表明聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架比纯聚乳酸纳米纤维支架更能促进细胞 的生长，可见壳聚糖纳米纤维的引入确实有助于细胞在支架内部的黏附与生长。
实施例3 : a)在搅拌下将聚乳酸溶解在四氢呋喃与乙醇的混合溶剂中，四氢呋喃与乙醇的体 积比为80 : 20，得到质量浓度为0.01g/ml的聚乳酸溶液。 b)将步骤a)中得到的聚乳酸溶液滴加到装有明胶微球致孔剂的模具中，明胶
微球的粒径为150 300 ym。在_181:下进行第一次相分离，该温度下保持2小时后移
至-7(TC下保存24小时，然后冷冻干燥得到聚乳酸/明胶微球复合物。 c)将步骤b)中得到的聚乳酸/明胶微球复合物置于蒸馏水中，萃取明胶微球
3天，每天更换3次溶剂，得到内孔高度连通的聚乳酸纳米纤维支架，孔径大小为150
300iim。 d)将步骤c)中得到的聚乳酸纳米纤维支架浸泡在浓度为1X10—2g/ml壳聚糖醋 酸溶液中，醋酸浓度为1X10—2g/ml，抽真空使壳聚糖溶液完全充满聚乳酸纳米纤维支架的
6内孔，取出支架置于-7(TC下进行第二次相分离5小时，然后冷冻干燥得到平均直径为
500nm的壳聚糖纳米纤维在聚乳酸纳米纤维支架的内孔均匀穿插分布的聚乳酸/壳聚糖复
合纳米纤维支架，此复合纳米纤维支架具有类似于天然细胞外基质的胶原纳米纤维结构，
可促进细胞的粘附与生长。此实施例所得支架的结构与性能与实施例1和2类似。 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的
限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，
均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架，其特征在于该支架的基体是聚乳酸纳米纤维支架，在聚乳酸纳米纤维支架的外壁与内孔均匀分布有壳聚糖纳米纤维。
2. 根据权利要求1所述的聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架，其特征在于所述聚乳酸纳米纤维支架的孔径大小为100 900 ii m，聚乳酸纳米纤维的直径大小为50 500nm。
3. 根据权利要求1所述的聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架，其特征在于所述壳聚 糖纳米纤维的直径大小为50 500nm。
4. 一种权利要求1 3中任一项所述的聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架的制备方 法，其特征在于包括如下步骤a) 制备质量浓度为0. 01-0. 08g/ml的聚乳酸溶液；b) 将步骤a)中得到的聚乳酸溶液滴加到装有明胶微球致孔剂的模具中，在-18t: l(TC下进行第一次相分离，该温度下保持1 24小时后移至_701:下保存1 24小时，然 后冷冻干燥得到聚乳酸/致孔剂复合物；c) 将步骤b)中得到的聚乳酸/致孔剂复合物置于萃取溶剂中，萃取致孔剂2 4天， 得到内孔连通的聚乳酸纳米纤维支架；d) 将步骤c)中得到的聚乳酸纳米纤维支架先浸泡于壳聚糖醋酸溶液，所述壳聚糖醋 酸溶液中壳聚糖浓度为1X10—4 1X10—2g/ml，醋酸浓度为5X10—5 1X10—2g/ml ;使壳聚 糖溶液完全充满聚乳酸纳米纤维支架的内孔，取出支架置于_20°C -196t:下进行第二次 相分离10分钟 24小时，然后冷冻干燥得到聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架。
5. 根据权利要求4所述的聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架的制备方法，其特征在于 步骤a)中，所述聚乳酸溶液的溶剂为良溶剂与非溶剂的混合溶剂，良溶剂与非溶剂的体积 比为80 : 20 95 : 5。
6. 根据权利要求5所述的聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架的制备方法，其特征在于 步骤a)中，所述的良溶剂包括三氯甲烷、二氯乙烷、1.4-二氧六环或四氢呋喃；非溶剂包括 吡啶、水、甲醇或乙醇。
7. 根据权利要求4所述的聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架的制备方法，其特征在于 步骤b)中，所述的致孔剂包括石蜡、明胶或氯化钠。
8. 根据权利要求7所述的聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架的制备方法，其特征在于 步骤b)中，所述致孔剂的粒径范围为100 900 ii m。
9. 根据权利要求4所述的聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架的制备方法，其特征在于 步骤c)中，所述的萃取溶剂包括正己烷、环己烷或蒸馏水。
10. 权利要求1 3中任一项所述的复合纳米纤维支架在制备用于修复受损骨组织的 骨替代材料中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架及其制备方法与应用，该支架的基体是聚乳酸纳米纤维支架，在聚乳酸纳米纤维支架的外壁与内孔均匀分布有壳聚糖纳米纤维。制备步骤包括首先利用第一次相分离制备聚乳酸纳米纤维支架，然后将其内孔充满壳聚糖醋酸溶液；利用第二次相分离制备壳聚糖纳米纤维，并均匀分布在聚乳酸纳米纤维支架的外壁与内孔，得到仿生聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架。本发明制备方法简单，得到的纳米纤维支架的结构与天然细胞外基质的结构相类似，具有良好的力学性能和生物相容性，可有效地促进骨细胞的迁移、生长和分化。
文档编号A61L27/48GK101703807SQ20091019394
公开日2010年5月12日 申请日期2009年11月17日 优先权日2009年11月17日
发明者周长忍, 屠美, 曾戎, 查振刚, 赵剑豪 申请人:暨南大学