二肽基肽酶iv酶活性抑制剂的新用途的制作方法

专利名称：：二肽基肽酶iv酶活性抑制剂的新用途的制作方法二肽基肽酶IV酶活性抑制剂的新用途本中请是2001年4月2日提交的，发明名称为"j-tj于改善糖尿病屮胰岛信号转导和用于其预防的方法"的中国专利申请01807402.2的分案申请。
背景技术：
：胰腺包括两种腺组织，一种是形成胰腺外分泌功能的细胞的集合，这些外分泌细胞在胰腺中将消化酶合成并释放到肠中；第二种组织包括胰腺的内分泌功能，胰腺将激素合成并释放到循环中。在胰腺的内分泌功能巾最重要的是细胞。这些细胞合成并分泌激素胰岛素。激素胰岛素在保持正常的生理血糖水平方面起关键作用。存在胰腺内分泌细胞的效应物分子。肠降血糖素是这种分子的实例。肠降血糖素加强胰腺葡萄糖诱导的胰岛素分泌。已证明肠降血糖素如胰高血糖素样肽-1(7-36)酰胺("GLP-1";或蜥蜴类似物Exen出n-4)和肠抑胃肽("GIP")是促胰岛的，BP，它们的存在或稳定化可以通过它们的促胰岛素分泌(insulin-secretive)效应保持急性血糖控制(Demuth,H.U.等，DE19616486:1-6，1996;Pauly，R.P.等，Regul.:Pept.64(1-3):148，1996,这些文献引入木文作参考)。另外，已证明GLP-l.通过剌激细胞增殖、细胞质量增加，和通过在胰岛的特化细胞中促进未分化的胰细胞而作为胰岛生长激素起作用。这种细胞表现出增加的胰岛素和胰高血糖素分泌(Yaekura，K.等，IN:VIP，PAC:AP，andRelatedPeptides,W,G,Forssmann禾US丄Said(编著》纽约NewYorkAcademyofSciences,1998，p.4'15-450;Buteau，J.等，Diabetologia42(7):856-86'1，1999，这些文献引入本文作参考)。以前曾提出施用外源生物活性GLP-1或其类似物，以刺激体内胰岛细胞再生，或从糖尿病患者获得胰细胞并用生物活性GLP-1在组织培养物中在体外(exvivo)处理这种细胞。认为这种体外处理促进胰岛细胞的再生和/或分化，然后胰岛细胞可以合成和分泌胰岛素或胰高血糖素(Zhou，J.等，Diabetes,48(12):2358-2366，1999;Xu，G.等，Diabetes,48(12):2270-2276，1999，这些文献引入本文作参考)。然而，这种治疗方式需要给病人经肠道或非胃肠施用生物活性GLP-1,包括手术的nj能性。本发明的一个方面是避免手术治疗、肠道或非肠道施用生物活性GUM.的需要。
发明内容木发明涉及一种新方法，其中由酶的效应物诱导的哺乳动物血巾的酶二肽基肽酶(DPIV或CD26)活性或DPIV样酶活性的下降导致作为结果的通过DPIV和DPIV样酶进行的胃肠多肽胰高血糖素样肽酰胺-17-36(GLP-17—36)(或这种肽的结构相关的功能类似物，如GLP-17—37，或GLP-1^的縮短的ftJR、〈j半.物活性的片段)的降解减少。这种治疗将导致功能性活性GLP-1(包括GLP-1M丄的)條外肽激素或它们的类似物的浓度卜'降的减少或延迟。由于因DPIV活性抑制引起的内源GLP-1(包括GLP-1-衍生的)循环肽稳定性提高，因此GLP-1活性延K，导致功能性活性GLP-1(包括GLP-1-衍生的)循环肽激素促进胰细胞的牛长激素样刺激，这样这些细胞增殖成功能性活性胰岛细胞。另外，当暴露于GLP-1时，不敏感的胰细胞或损伤的胰细胞可能转化成功能性活性胰岛细胞。预期不敏感的胰细胞或损伤的胰细胞转化成功能性活性胰岛细胞导致胰岛素分泌增加和血浆中胰岛素水平增加。令人惊讶的是，在研究健康人志愿者和肥胖的糖尿病Zucker人鼠时，用DPIV抑制剂富马酸异亮氨酰噻唑烷(isoleucyltWazoli出nehemifumarate)(P32/98)治疗后胰岛素水平降低(分别见实施例1和2)。然而，胰岛细胞的再生改变内源胰岛素和其它胰岛激素，如胰高血糖素的功效，从而引起所治疗的哺乳动物的糖代谢的剌激。因此，如实施例1和2所不，血糖水平K降到低f高血糖特征的葡萄糖浓度。引发这些作用的详细机理仍未知。然而，这种胰岛细胞的再牛通过预防或缓解这些后遗症而进一步引起代谢的异常，包括葡糖尿、^脂血症以及严重的代谢酸中毒和糖尿病。不同于木领域已知的其他已提出的方法，如胰细胞或组织移植或用GLP-1或exendin-4体外处理胰细胞接着将经处理的细胞再移植，本发明不引起或需要复杂且昂贵的手术，并提供n服有效的治疗。本发明提供一种用来降低升高的血糖浓度的新力'法。它ft仃商用价值并适用于治疗方案，特别是涉及人的疾病，这些疾病中W很多是由于长期升高的血糖水平引起的。简言之，本发明涉及至少-一种—肽基肽酶IV酶活性抑制剂用于牛产用来重复给药以提卨动物中产胰岛素细胞的能力的药物的用途，其中所述提a产胰岛素细胞的能力可以包括使内源产胰岛素细胞成为更有效的胰岛素生产者，或者可以包括使存在T胰腺巾的细胞分化成产胰岛素细胞。所述二肽基肽酶IV酶活性抑制剂优选选自N-(N'-取代的甘氨酰2氰基吡咯垸、N-氨酰基噻唑烷和氨酰基吡咯烷以及它们的药学盐，更优选选fiL-苏-异亮氨酰噻li坐烷、L-别-异亮氨酰噻啤烷、L-苏-异亮氨酰吡咯烷和L-别-异亮氨酰吡咯烷以及它们的药学盐。优选地，所述二肽基肽酶IV酶活性抑制剂是能与所述二肽基肽酶IV结合的底物，其与大然存在的二肽基肽酶IV底物竞争。参照附图可进.二步理解本发明，其中图1是表示口服DP抑制剂配方P32/98的人(n=36)中循环生物活性GLP-1的时间依赖性的图；图2是表示n服DPIV~抑制剂配方P32/98的人(n=36)屮循环生物活性GLP-1的AUC的依赖性的图；图3是显不在给肥胖的糖尿病fe/fe大鼠亚&期(subchronic)单一治疗施用:P32/988.7mg/kg/d后晨血糖(M:BG)的改善的图；图4a是显示由于对肥胖的糖尿病大鼠用DPIV抑制剂治疗16天后，葡萄糖控制改善的图；图4b是显示由于对肥胖的糖尿病大鼠用DPIV抑制剂治疗16天后，胰岛素分泌降低的图5a是显示在用配方的DPIV-抑制剂P32/98亚长期治疗肥胖的糖尿病fa/fa大鼠21天后，在改善的糖血的保持中作为时间的函数的血糖水平的图5b是显示在用配方的DPIV-抑制剂p32/98亚长期治疗肥胖的糖尿病fa/fa大鼠21天后，在改善的糖血的保持中作为时间的函数的血浆胰岛素水平的图。具体实施例方式本发明涉及分化和/或重构胰细胞的新方法。胰岛细胞的再生将正影响内源胰岛素和其它胰岛激素，如胰高血糖素的合成和释放，从而将引起糖代谢的剌激。葡萄糖诱导的胰岛素分泌受多种激素和神经递质的调节。特别感兴趣的是两种胃肠激素，胰高血糖素样肽-1(GLP-l)和肠抑胃肽(GIP),它们都是促胰岛剂。促胰岛剂能够刺激激素胰岛素的合成或表达，或者引起该刺激。GLP-1是有效的肠促胰岛剂，它增加胰岛素分泌并急性降低葡萄糖水T，包括在I型和II型糖尿病中观察到的水平。GLP-1通过肠L细胞、内分泌胰腺的a-细胞和脑巾的神经元巾夂替的组织特异性卵裂形成。gip餐后从十二指肠和邻近的空肠合成并释放。其释放依赖于几个因素包括膳食成分和预先存在的健康状况。它最初因其胃酸抑制性质被发现并命名。然而，随着对该激素研究的进展，更多相关的生理学作用得到说明。具体而言，gip是对胰岛素合成和释放仃刺激作用的促胰岛剂。DPIV是外肽酶，其在倒数第二个N-末端脯氨酸和丙氨酸残基后选择性裂解肽。这种酶的内源底物包括肠降血糖素，如葡萄糖依赖性促胰岛多肽，象GI:P和GL:P-丄。在DPIV存在下，这些激素被酶促还原为失活形式。GIP和GLP的失活形式不能诱导胰岛素分泌，因此血糖水平升高，尤其是在高血糖状态下。升高的血糖水平与许多不M的病理有关，包括糖尿病(I型和II型)和伴随糖尿病的后遗症。还发现D:p:iv在T-细胞介导的免疫应答中起作用，例如，在移植中。d证明D:pIV的抑制延长心同种异体移植物。另外，DPIV的抑制有助于抑制类风湿性关节炎。DPIV还在HIV渗透入T-细胞(T-辅助细胞)中起作用。已开发了如N-(N'-取代的tf氨酰)-2-氰基吡咯烷、L-苏-异亮氨酰噻唑烷(:P32/98)、L-别-异亮氨酰噻唑烷、L-苏-异亮氨酰吡咯烷和:L-别-异亮氨酰吡咯烷这样的药物，它们抑制DPIV的酶活性，这在US6,001,155、WO99/61431、WO99/67278、WO99/67279、D:E19834591、WO97/40832、D:E19616486C2、WO98/19998、WO00/07617、WO99/38501和WO99/46272中有描述，这些文献引入木文作参考。这些药物的目的是抑制:d:pi:v，并且通过这样做来降低血糖水平，从而有效治疗高血糖和与血中升高的葡萄糖水平有关的伴随疾病。本发明者惊奇地发现这样的药物可有利地用于完全不同的治疗g的，该g的完全不同于本领域技术人员以前知道的。特征性地显不高血糖的疾病包括如i型和ii型糖尿病这样的疾病。糖尿病通常以胰细胞激素输出不足为特征。正常地，这些细胞合成并分泌激素胰岛素。在i型糖尿病中，这种不足归因于自身免疫过程对细胞的破坏。II型糖尿病主要归因于13-细胞缺乏和外周抗胰岛素性的结合。在糖尿病患者中，13-细胞的数目降低，因而不仅关注P-细胞合成和释放生理胰岛素的能力，而且关注这些产胰岛素胰细胞的临界质量(criticalmass)。己知细胞损失伴随糖尿病的存在而发生。随着这些产胰岛素细胞的损失，存在胰腺产生例如胰岛素的内分泌功能的过劳。随着胰岛素输出的损失，归因于高血糖的病理过程可能加重。GLP-i通过刺激13-细胞增殖、细胞质量增加和通过促进胰岛细胞的特化细胞中的未分化胰细胞起胰岛生长激素的作用。这种GLP-1暴露的胰细胞显示改善的胰岛素和胰高血糖素分泌(YaekuraK.等，IN:VIP，:PACAP，andRelatedpeptides,W.G.Forssmann和S丄Said(编著)，纽约NewYorkAcademyofSciences,1998，p.445-450;Buteau，J.等，Diabetologia42(7):856-864，1999)。本发明者己发现需要增加GLP-1的半衰期，从而促进胰细胞的革:构。本发明者还发现了一种力'法，其屮为了改善胰细胞的歪构，GLP-1的分解代谢可能被削弱。本发明的治疗哺乳动物，包括但不限f人的高血糖的方法包括通过用酶抑制剂抑制DPIV或相关的酶活性而加强GLP-i的存在。口服给予DPIV抑制剂在大多数情况--F是优选的，特别是长期口服给药。然而，在本发明中也考虑其它给药途径，如静脉内或肌肉注射，特别是长期静脉内或肌肉注射。通过抑制DPIV酶活性，GLP-l的活性形式的半衰期将相当地延长并在生理条件下保持。活性GLP-1的延长的存在，尤其是在胰腺组织中，将促进胰上皮细胞分化成胰腺效应细胞，如产胰岛素P-细胞。而且，延长胰腺组织屮GLP-1的i理^性存在将促进那些已存在但需要修复的P—细胞的再生。令人惊奇的是，这种作用H0在重复给药后才可观察到(见实施例2)。由于在停止药物治疗后，治疗前的代谢状态恢复，需要DPIV效应物的亚K期或l^期给药，以保持所实现的改善的糖血。这些经修复的产胰岛素细胞便能有效地帮助正常牛理血糖水平的矫正和保持。在本发明中，内源G:LP-1以正常生理路线合成并释放。膳食的摄取能够刺激GLP-l的释放。或者，为了剌激内源GLP-1.的释放，可以以药学可接受的载体的形式口服给予葡萄糖或其类似物(例如，"糖丸")。这种葡萄糖可以在给予DPIV抑制剂之前、同时或之后给了本发明还提供药物组合物。这种组合物包括治疗(或预防)W效量的抑制剂(和/或作随给予DPIV抑制剂的糖丸)，以及药学nj接受的载体或赋形剂。在良好实验室规范条件下牛产载休和组合物，并灭菌。根据常规实践，理想地选抒配方以适合给药方式。合适的药学可接受的载体包括但不限于水、盐溶液(例如氯化钠)、醇、阿拉伯胶、植物油、—T醇、聚乙二醇、明胶、糖如乳糖、直链淀粉或淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸酷、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。药物制剂可以是无菌的，并且如果需要，可混以辅剂，例如，润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质和不与活性化合物发生破坏性反应但改善稳定性、可制造性和/或美学作用的物质。如果需要，组合物还nj以含有少一:的润湿或乳化剂，或pH缓冲剂。另外，组合物可以是液休溶液、悬浮液、乳液、片剂、九剂、胶囊剂、缓释配方，或散剂。另外，组合物可以配方成含有常规粘合剂和载体如甘油二酯的栓剂。口服配方可以包括常规载体如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬酯酸镁、聚乙烯吡咯垸,、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。此外，组合物可以根据用于人静脉内给予的药物组合物领域中熟知的方法配方。通常，用于静脉内给予的组合物是无菌等渗的缓冲水溶液。当需要时，组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂以减轻注射部位的疼痛。通常，单一地或混合f单位剂量形式中地提供成分，例如，以冻干粉末或密封容器，如安瓿中的无水浓縮物或指示活性化合物质量的小药囊。当要通过输注给予组合物时，其可以用含有无菌药用级水、盐水或葡萄糖/水的输液瓶分散。当通过注射给予组合物时，可以提供注射用无菌水或盐水的安瓿，这样在给药前各成分可以混合。最后，本发明的组合物可以配方成中性或盐形式。药学可接受的盐包括那些与游离氨某形成的，如衍生fi盐酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等的盐，和衍生fi钠、钾、铵、钙、铁氢氧化物、异丙胺、—乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因的盐，和本领域熟知的其它盐形式。有效治疗特定疾病或症状的本发明的组合物的量将取决于疾病或症状的性质，并可以通过标准临床技术确定。另外，可以任选地采用体外和/或体内测定来帮助鉴定最佳剂量范围。配方中所采用的准确剂量也将依赖T给药路径，以及疾病的严重性。剂量应根据医生考虑每个患者的情况所做的诊断来决定。本领域技术人员容易理解，在不背离本发明的实质或范围的前提下，对于本文给出的实施例和说明可以进行许多改变，包括不同DPIV抑制剂的产生，和改变治疗组合物。下面描述的实施例并不意图限制本发明的范围。实施例实施例丄DPIV抑制剂P32/98通过PepT1肠肽转运蛋白活性转运。P32/98经过肠粘膜的快速和活性转运是其快速起始(festonset)的原因。t皿是二肽基肽酶IV(DPI:V)的有效靶的先决条件。口服P32/98分别在大鼠和人摄取后15到20分钟和30到40分钟导致最大耙抑制。因此，DPIV抑制剂应在葡萄糖或食物摄入前10-20分钟给予。在用P32/98进行的首次人研究屮，在36个健康男性忐愿者屮研究了药物动力学参数，如血浆中胰岛素浓度和GLP-1浓度，以及血糖。P32/98的U服剂量为下列浓度7.5mg、15mg、30mg、60mg、12()mg和240mg。上述药物动力学参数的结果总结f表1中。将36个健康男性受试者分成3个个体组，每组有12个受试者。各个体组中9个受试者接受活性药物:P32/98,3个受试者接受安慰剂。接受活性药物的受试者在不M吋间段以不同强度给药两次。各组接受的P32/98的强度如——F:组I接受7.5mg禾n60mg;组II接受15mg和120mg;组III接受30mg和240mg。各组接受安慰剂的受试者在两个给药间隔都给药。在参加该研究前的3-14天内，对受试者进行预研究检查。研究的第二部分包括实验期和六次单剂量浓度升高的P32/98治疗，(1到6期；表2)它包括跟踪检杏。各受试者参与预研究和实验期，它们被至少5天的洁除期分开。跟踪检査在研究药物最后--次给药后的至少7天后进行。除了所研究的剂^之外，六期的研究过程相同。方法口服葡萄糖耐受实验("OGTT"):要求受试^处于禁食状态至少12小时，并且在各0GTT之前进食富糖的膳食3天。在每一葡萄糖耐受实验中，受试者摄取相当于75g葡萄糖的300mL单/二醣溶液(DextroO.G,T，Boehri'ngerMa'隨'hdm，FRG)。在葡萄糖摄入前和摄入后30、60、90和120分钟时立刻采集血样(1.2mL放入氟化钠管内)。认为在0分钟和i20分钟时仟何超过i26mg/dl(7.0mmol/:L)的葡萄糖浓度是处于病理葡萄糖耐受状态。每个给药时间段的第1天进行延长的OGTT。受试者摄取相当T75g葡萄糖的300mL申./二醣溶液。在以下时间间隔采集血样(1.2rnL):1)葡萄糖摄取前5分钟；2)葡萄糖摄取后5、15、30、45、60、75、90、120、150和180分钟；3)葡萄糖摄取后4、12、24和48小时。另外，进行本领域所熟知的其它药物动力学评价。胰岛素将4.7mL血采集入4.9mLEDTA管中。将样品离心(1500g,10min)并冷冻贮存在-7()。C直到实验室分析。葡萄糖:将i.2mL血采集入i.2mL氟化钠管中。将血浆样品在i500g离心i0分钟并冷冻贮存在-7()°C直到实验室分析。GLP-1:将2.7mL血采集入EDTA管中并放置在冰上或冷冻，向其中加入二肽基肽酶IV抑制剂。抑制剂由研究者预先制备。将血样采集入管中并在冷冻离心机中在1000g下立刻离心10分钟，或者将血放置在冰中并在1小时内离心，并且平均分成几等份。以适宜的等分试样在-7(rc贮存血(以避免多革:冷冻/解冻循环)有到实验室分析。结果活性GLP-1浓度发现了与安慰剂相比P32/98的剂量依赖效应。总的个体浓度在2-68pmol/:L间变化。预给药组平均值在3.77±2.62pmol/L和6.67±9.43pmol/L之间，并在使用安慰剂后增加到4.22至7.66pmol/L，但在使用抑制剂后增加到11.6pmol/L(l5mg)至15.99pmol/:L(240mgP32/98)。如果从绝对浓度评价相对平均增加，在安慰剂治疗后活性GLP-1浓度约增加200-300%，但在用P32/98治疗后约增加300-400%。在使用1.5-24()mgP32/98后，中值的绝对增加与安慰剂和7.5mg剂量相比高2-3倍(表2)，粗略地显示剂量反应关系。相对于P32/98剂量，预剂量值以上的增加存在约3-4小时。胰岛素浓度显示总的个体俏范围在3.40和155,1uILJ/ml之间。平均值(±SD)预给药浓度在7.96±1.92iilU/ml(30mg)禾卩11.93±2.91P1U/ml(6()mgP32/98)的范围内。在给予:P32/98/'安慰剂i0分钟后摄入75g葡萄糖后，平均胰岛素浓度在40-55分钟内增加30,12uIU/ml(l2()mgP32/98)至56,92u1U/ml(3()mg组)。在安慰剂和P32/98给药组间没有明.M差别，没有证据显示P32/98的剂量依赖效应。有意思的是，胰岛素浓度的绝对增加在两个最高P32/98给药组巾最低(见表1)。在所有研究组包括安慰剂组中胰岛素浓度被提高34小时。葡萄糖浓度显示在禁食状态，OGGT期间或进食后所有研究受试者的总的范围在2,47到11.7mmol/L之间。在4.55士0.41(15mg)和4,83士0,30mmol/L(7.5mgP32/98)之间的平均预给药浓度相互紧密吻合并且几乎不显不偏差。在给药后4()-55分钟内，也就是在给予75g葡萄糖后30-45分钟内，达到平均最大浓度。绝对平均浓度在两个安慰剂组和7.5mgP32/98给药组中最卨。最低绝对平均值得自15mg、6()mg和d-24()mg给药组。相应的平均值变化分别在3.44至4.21mmo1/1禾P1.71至3.41mmol/'l的范围内，并且与表1中提供的中值紧密吻合。虽然没有观察到完全的剂.S依赖性，但这些结果显示与安慰剂相比，随P32/98剂量从15-240mg增加，葡萄糖浓度增加较低。表1:药物动力学参数的最大变化(O-12h，中值)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2:ogtt后0-3小时校正的cmax和葡萄糖浓度的auc<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>1来自ANOVA与安慰剂比较的结果p<0.05;、<0.01;'p<0.001在两个安慰剂组和仅给予7.5mgP32/98组巾基线校正的平均峰(Cmax)葡萄糖浓度超过4,0mmol/L。在15mg和240mgP32/98治疗组中这些值也低于3,0mmol/:L。15mg、60mg、l-20mg和24()mgP32/98给药组与安慰剂治疗相比的差异具有统计学显著性，但对于7.5mg和30mg给药组则没Y/。安慰剂和7.5mgP32/98给药后平均基线校正的AUC值>20()mmol*min/L，但15mg禾P240mgP32/98给药后则明显低f20()mmol*min/L。15mg、60mg、i20mg和240mgP32/98给药组中来自OGTT的全身葡萄糖暴露的下降具有统讣学显著性，但对7.5mg和3()mg给药组则没有(见表2)。基线校止值的评价非常类似于得自未校正数据的值。因此，在P32/98治疗的健康受试者中进行OGTT后的数据.M示明.显较低的葡萄糖暴露，这是近似的但不是完全的剂量依赖性指征。结论本研究的结果给出以'卜'药物动力学结论在OGTT前，P32/98治疗iOmin后活性GLP-i约增加300-400%，但是与安慰剂治疗相比，7.5mg剂量水平没有发现可辨别的作用(见图1和2)。用75g葡萄糖刺激后，胰岛素浓度似乎在120-240mg剂量下降低。在健康受试者的OGTT期间，与安慰剂相比，经P32/98治疗(15-240mg)后，葡萄糖浓度显示显著减少的增加，这与P32/98剂量有关。实施例2在肥胖的Zucker大鼠中，P32/98营养依赖性支持最初的胰岛素分泌。然而，在亚K期治疗期间，P32/98降低总的每日胰岛素分泌。与使胰岛素输出增加27%的对照格列本脲相比，P32/98弓l起胰岛素比对照节省45%。进行试验以确定P32/98是否是通过增加肠降血糖素GIP和GLP-1的循环半衰期而影响体内葡萄糖耐受的首选。用格列本服(ManinilBerlin-Chemie，柏林，德国)作为参比物质进行对比研究。格列木脲是降低II型糖尿病患者血糖的最有效的药物之一，并且是最常开药方的磺酰脲类之-一。以以下方式研究在葡萄糖代谢方面表现异常并且是II型糖尿病理想的动物模型的雄性Zuckerfe/fe大鼠在进食前每日一次给予P32/98和格列本脲，共持续21天。所监测的参数为晨血糖和血浆胰岛素水平。在昼夜图中，从第i6天到第i7天监测糖血和胰岛素血。最后在第21天进行0GTT来监测血糖和血浆胰岛素动力学，从而评价葡萄糖耐受的变化。格列本脲(DAB1996;R011150/33372)由Berlin-Chemie(柏林，德国)捐赠。体重级别为3()0g的雄性Zucker(fk/fe)大鼠购自CharlesRiver(Sulzfeld，德国)。方法饲养条件动物在常规条件下养在单个笼子屮，温度控制在(22士2。C)，光照/黑暗循环12/12小时(在早上06:00光照)。标准药丸(sniffe,Soest,德国)和用HCI酸化的自来水无限制。，Bayer，德国)和0.5ml/kgi.p.Velonarkon(ArzneimittelwerkDresden,德国)下将颈动脉导管植入大鼠中。使动物恢复-一周。每周用肝素-盐水(iooru/mi)冲洗导管三次。重复给药将3()只雄性非糖尿病Wistar和3()只雄性糖尿病Zucker大鼠随机分成R:P(参比物质:格列本脲)、TP(测试物质:P32/98)和CO(对照)组(每组N=10)。其后，在下午()5:00(在黑暗期巾的常规食物摄入前)，使非糖尿病Wistar大鼠每日口服RP(5mg/kg体重)或T:P(21.61mg/kg体重)-一次，使糖尿病Zucker人鼠每闩口服R:P(lmg/kg体歪)或TP(21.61mg/kg体歪)一次，共21天。对照组n服1.%纤维素溶液(5ml/kg)。每天清晨07:30从尾静脉采血来测定血糖和血浆胰岛素。这部分程序的最后血样在第15大上午07:30采集来测定血糖和血浆胰岛素。口服药物治疗持续一周。在上述治疗'卜'记录昼夜图，从第i6天(下午OS:OO开始)到第i天(下午02:00结束)检测血糖(At=3h)和血浆胰岛素(At=3-6h)。OGTT:在第21天进行后的OGTT,并从尾静脉采血。在-12h(第21天前的晚上)、0min(OGTT开始前的-一刻)、10、20、30、40、50、60、80、100和120mm时从尾静脉采集血样。将血样采集入用f血糖测定的2()PL玻璃毛细管中和微量离心管(丄00uL)中。后者立刻离心，将血浆部分贮存在-20。C以进行胰岛素分析。血糖用葡萄糖氧化酶过程(SuperGGlukoseme卩gerat;Dr.MffllerGerStebau，Freital，德国)测定葡萄糖水平。血浆胰岛素通过抗体RIA力1去(LINCOResearch,Inc.St.Charles，Mo.，美国)测定胰岛素浓度。结果血糖的昼夜图〖见图4A):/十:第i6天下午05:00用药甜CO组中平均血糖浓度为7.78士().83mmol/L。在黑暗期口服安慰剂和摄食后血糖增加到下午的最大值12.18±1.34mmol/:L。此后，血糖非常缓慢地下降到上午11:00的最低值7.27士0.61mmo1/L，接着在第二天下午02:00增加到8.90±0.92mmol/L。在RP组巾，看到相似的血糖图。然而，对照动物从下午05:00的类似的平均值7.96士1.13mmol/L更强地增加到14.80±1.46mmol/L(下午1.1:00),其后降到7.66±1.22mmol/L(上午11:00),并且在第二天下亇02:00进一歩轻微下降到7.34±0.77mmol/L。在TP-组中，Zucker大鼠在下午05:00时具有正常的平均血糖值5.25±0.16mmol/L,单个值在'1.34到6.()7mmol/L的范闺内。在下午ii:00时血糖增加约3mmol/:L至8.34±0.47mmol/L。接着持久下降直到上午()8:()()时达到基值(5,64±().23),它在上午11:()()(5.33±().14mmol/L)和第二天下午02:00(5.51±0.19mmol/L)保持。fl夷岛素的昼夜图(见图4B〗CO和RPZucker大鼠强烈高胰岛素血。CO组胰岛素平均值有变化，下午05:00(47,0±8,7ng/m:L)、下午08:00(45.5±7,7ng/mL)、上午05:00(54.2±5.7ng/mL)、第二天下午02:00(61.0±1.0.2ng/mL;NS),其不显示与血糖的变化相关。在RP组中，在从下亇06:00到上亇06:00的黑暗期中，血浆胰岛素值显著增加，在....匕午5:00时达到最大。这一参数从强烈高胰岛素血的值5().0±8.2ng/mL('卜'午05:00)经57.3±8.2ng/m:L(下午08:00)增加到76.3±8.6ng/mL(上午05:00;p<O.O丄相对于初始值)，接着下降到58,3±7.3ng/mL(第二天下午()2:()())。在该RP组中，胰岛素与血糖变化相比是强烈phaseshifted。在TP组中，Zucker大鼠也是高胰岛素血的。在下午05:00时的血浆胰岛素显著低于RP巾的(p<0.05相对于RP)。平行于血糖增加(图IV/3A)，在下午08:00时血浆胰岛素增加(41.9±8.5ng/m:L)。最人胰岛素值在上午05:00时测得(57.1.±8.6ng/mL;p<0.01相对于初始值)。在第二天下午约2:00时血浆胰岛素浓度降低到基浓度(24.3±3.7ng/mL)，这显著低于CO或RP组中的浓度(p<0.01相对于CO或TP)。2丄天治疗后OGTT，血糖曲线C见图5A):在第2i天下午05:00最后一次用药，并且彻夜禁食，接着CO组中血糖从8.68±l,26mmol/L(——F午()S:()())显著——F降到5.08±0.24mmol/L(p<0.05),在RP组中血糖从8.81±1.21mmol/L下降到4.91士0.37mmo1/L(p<0.01)，在TP组巾血糖从5.75±0.23mmol/L—卩'降至lj4.88±0.13mmol/L(p<0.01)。由于该原因，从清晨(上午07:30)发现的所有三个实验组中的类似基葡萄糖浓度水平进行n服葡萄糖负荷。在CO组中，U服葡萄糖后血糖在40分钟内增加到峰值14.64±1.42mmol/L。后来，在实验终点(120分钟)血糖轻微、显著地下降到9,75±0,46mmol/L。在RP组中，血糖分别在50分钟和80分钟时陡然增加到16.33±0.98和16.24±U)9mmo1/1。高血糖浓度--一直保持到i20分钟研究终点(i00分钟i5丄3±0.76mmol/L，i20分钟14.81士().66mmo11;NS来自前面的峰值)。在TP组中，发现了与CO组中相似的平均血糖曲线性质。血糖在50分钟时增加到14.54±0.65mmol/L并.M著下降到10.67士0.62mmo1/L(120min;NS来自CO)。在CO和TP组中曲线下葡萄糖面积(G-AUC。—，■)分别是823±41和895±50mmol.min/L(NS)。在RP组屮这一参数确定为1.096±76mmol'min/L，该值显著高于CO(p<0,01)或TP组(p<0,05)中的值。21天治疗后OGTT，血浆胰岛素(见图5B):Zucker大鼠彻夜禁食导致CO动物中血浆胰岛素浓度降低(丄4.6士3.7ng/m:L)，RP组中下降到丄丄.8士丄.5tig/m:L，TP组中下降到9.3士1.5ng/mL。实验组间的差异并不显著。葡萄糖刺激后，CO、RP和TP组中血浆胰岛素大部分保持不变。只在CO组120分钟时发现稍高值，21.3士3.0ng/m:L，它.M著高于TP纟ll(p<0.05)。I-AUC。-12。mm通常很低。TP组中的该参数低于CO或R:P组的(NS)。小节晨血糖安慰剂治疗的对照Xl高血糖(约7.5mmol/L)。在研究期间平均浓度没有变化。RP治疗在两大内增加血糖约1.5mmol/L。血糖保持在较高范围内。TP药物治疗在5天内将血糖降低到正常值。血糖保持在正常范闺内直到研究结束。血浆胰岛素对照Zucker大鼠a胰岛素血并且在14天的观察期间表现出胰岛素的进.'步增加。与对照动物相比，R:P治疗的Zucker大鼠.M示出胰岛素增加到显著高的浓度。与对照动物相比，TP用药的确轻微降低了胰岛素浓度14天。21天治疗后OGTT，血糖实验组中彻夜禁食将血糖降低到iH常佰。安慰剂治疗的动物显示在葡萄糖负荷后40分钟内血糖约增加9mmol/L，其后稍微下降。RP治疗的Zucker大鼠在葡萄糖负荷后显示血糖约增加11mmol/L,并且在整个测试过程中没W下降。TP治疗的动物的平均血糖曲线与对照组的没有区别。与安慰剂用药相比，RP治疗增加G-AUC，TP药物治疗并不增加G-AUC。21天治疗后OGTT,血浆胰岛素在二个实验组中，对照Zucker大鼠具有最^的禁食胰岛素，约15ng/mL。葡萄糖负荷后，胰岛素仅在实验终点(120min)时.M著增加。RP治疗的大鼠在OGTT开始时具有较低的禁食胰岛素，12.5ng/mL，在40分钟时有早期增加，实验终点时没有下降。T:P治疗的人鼠在OGTT开始时具有最低的禁食胰岛素，9ng/mL，相对于血糖升高，在20分钟时有早期适度的增加，在40分钟和1.00分钟之间浓度降低。在TP治疗的大鼠中I-AUC略微降低。结论:D:pi:v抑制剂:P32/98(T:p)，每天给药一次，使晨血糖正常化，降低高胰岛素血，使血糖在昼夜图中保持低于(对于糖尿病患者)临界的8.3mmol/L。在P32/98药物治疗停止后的有限时间内代谢益处得以保留。权利要求二肽基肽酶IV酶活性抑制剂用于生产供长期口服给药以预防哺乳动物中II型糖尿病的药物的用途，其中所述二肽基肽酶IV酶活性抑制剂使存在于胰腺中的细胞分化成产胰岛素细胞，使胰细胞增殖成功能性活性胰岛细胞和/或使不敏感或损伤的胰细胞转化成功能性活性胰岛细胞。2.根据权利要求1的ltj途，其屮所述二肽基肽酶IV酶活性抑制剂选fiN-(N'-取代的甘氨酰>2-氰基吡咯烷、N-氨酰基噻唑烷和N-氨酰基吡咯烷以及它们的药学可接受的盐。3.根据权利要求i的用途，其中所述一肽基肽酶IV酶活性抑制剂选自L-苏-异亮氨酰噻唑烷、L-别-异亮氨酰噻唑垸、L-苏-异亮氨酰吡咯烷和L-别-异亮氨酰吡咯烷以及它们的药学可接受的盐。全文摘要本发明公开了二肽基肽酶IV酶活性抑制剂用于生产供长期口服给药以预防哺乳动物中II型糖尿病的药物的用途，其中所述二肽基肽酶IV酶活性抑制剂使存在于胰腺中的细胞分化成产胰岛素细胞，使胰细胞增殖成功能性活性胰岛细胞和/或使不敏感或损伤的胰细胞转化成功能性活性胰岛细胞。文档编号A61P5/50GK101690815SQ20091020811公开日2010年4月7日申请日期2001年4月2日优先权日2000年3月31日发明者康拉德·格隆德,汉斯-乌尔里希·德穆特申请人:普罗西迪恩有限公司