专利名称：一种脂质靶向超声造影剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种以合成磷脂、带探针的棕榈酸等为膜材料的靶向超声造影剂及其制备方法。
背景技术：
超声造影作为超声医学发展的第三次革命，正广泛而深刻地影响着超声医学的应用和发 展，在占位性病变的诊断中发挥了革命性的作用。使用超声造影剂，极大的增加了医生的诊 断信心，提高了临床超声诊断水平。为提高患者诊断准确率发挥重要作用。超声造影剂是一 种血池微气泡，粒径较红细胞稍小，约10um以下，其内包裹气体，利用气体对超声波的强反 射机理，可以观察组织脏器以及病变的微循环，提高超声诊断的敏感性和特异性。
新一代超声造影剂是以氟碳类惰性气体为核心，以合成磷脂为主要材料的膜包裹而成的
微气泡。理想的超声造影剂应具有的特点1)粒径适宜超声波反射强度与微泡直径6次方 呈正比，粒径越大，反射的强度越强，越容易被观察到；但若微泡粒径过大， 一方面不能经 外周静脉注射后通过肺循环到达全身，另一方面，非常容易干扰血液的微循环血流动力学； 相反，粒径过小，超声波反射强度小，不利于超声诊断仪的接收和显示；因此，适宜的微泡 粒径以小于10um，介于l 6um为宜。2)稳定性好超声微泡需要经过心脏泵出输送至全身 ，微泡需要有足够强的稳定性耐受高压力的动脉压，维持微泡形态完整，保持对超声波的反 射。3)安全性高微泡对人体无害，不影响正常生理机能。4)具有足够的浓度经心脏泵
出随机分布于全身后有足够的超声反射强度。
为制备理想的超声造影剂，现在技术集中在膜材料和制备工艺两方面的研究。
例如，中国专利CN1081467C公开了白蛋白为球壁材料的寒气微泡混悬液，制备方法为超 声法；中国专利CN1128638C公开了以表面活性剂司班、吐温等包裹气体而成的，以超声法制 备的造影剂；中国专利CN1209167C公开了由脂质及高分子聚合物等为成模材料的，通过乳液 聚合法制备的超声微泡造影剂；中国专利CN101062423A公开了以磷脂为膜材料的，通过超声 振荡或机械剪切作用制备的微泡混悬液。
已有的造影剂中，很多尚处于研究开发的各阶段，白蛋白微球应用较早，已有产品上市 ，但其有免疫原性，可能引起机体变态免疫反应，在一定程度上限制了其应用；司盘、吐温 类表面活性剂， 一般不用于静脉注射液制剂中；磷脂为材料的微泡具有组织相容性好，微泡 弹性高等优点，已有成熟产品上市。但以往超声微泡膜材料成分复杂，用料多。因此，需要对微泡壁材料进一步研究改进，选择制膜材料及其配置比例，以制备出更节约、有效、安全 和易于制备的微泡。
理想的超声造影剂，应具有粒径均一、密度高、大小适宜的特点。以往超声空化法、机 械制定法、冷冻干燥法、反复冻融法等，要么制备工艺较复杂、要么制备微泡粒径及分布还 不够理想，都需要进一步改进。
当然，上述微泡都是普通超声造影剂，不能用于超声分子成像，而将靶向探针结合在微 泡表面制备靶向超声造影剂，靶向显示组织器官分子水平的病理改变；并以靶向造影剂为载 体，实现药物、基因定点释放，在超声靶向治疗领域有广泛的应用前景。
理想的耙向造影剂特性应包括①循环半衰期长(理想的超过30 60分钟)；②在耙区 部位停留时间长；③敏感、特异性地连接于感兴趣区抗原决定簇；④产生高的信噪比； 毒 性小；⑥易于生产和临床使用；⑦能采用标准化、商业化的成像方式成像。
为制备理想的靶向超声造影剂，最新的技术集中在对靶向配体与微泡结合的研究上。例 如1.直接连接法又称为共价的被动吸附、静电吸附法。缺点是制备得到的靶向超声造 影剂稳定性不强，极易受到溶液物理性质改变的影响，有研究表明体内寻靶效果不佳。2. 偶联剂连接法，缺点是靶向片段结合率不高，且多功能试剂的选择范围有限。3.桥连剂结 合的方法:又称共价结合法，此法产物靶向性稳定，化学基团选择范围非常广泛易得，根据 自己需要引入不同的基团，制备过程同普通超声造影剂等让此法成为现今研究的热点。4. 非吸附性非共价键键结的免疫化学固定法，例如生物素亲和素(biotin — avidin system)法
发明内容
本发明的目的是提供一种以合成磷脂、带探针的棕榈酸等为膜材料的靶向超声造影剂及 其制备方法。制备的超声微泡大小适宜、粒径分布均一、稳定、浓度适宜、耙向探针结合率 高；不需要添加造影剂制备原料以外的试剂材料用于连接配体，制备方法简单，对微泡本身 特性干扰小，有利于纯化靶向造影剂。
本发明的目的是通过以下方式实现的。
一种脂质耙向超声微泡造影剂，平均粒径为1 4微米的微泡混悬液，球壁材料包括合成 磷脂、聚乙二醇、泊洛沙姆；包裹气体为氟碳类组织相容性惰性气体，溶液为去离子双蒸馏 水，球壁材料中还含有结合探针多肽的棕榈酸。
所述的探针多肽的序列为KGDS (赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸)或RGDS (精氨酸-甘 氨酸-天冬氨酸-丝氨酸)，探针多肽与棕榈酸的结合比例为lmol: lmol。所述造影剂中结合多肽的棕榈酸含量为造影剂的O. 1 0.2重量％，合成磷脂含量为造影 剂的0.02-0.9重量％，聚乙二醇含量为造影剂的0.01 0. 1重量％，泊洛沙姆含量为造影剂 的O. 01 0. 1重量％，
所述合成磷脂选自二棕榈酰磷脂酰胆碱和二棕榈酰磷脂酸；所述的聚乙二醇为 PEG-4000;所述气体为全氟丙烷C3Fs。
所述的脂质靶向超声微泡造影剂的制备方法包括以下步骤
a) 将合成磷脂、泊洛沙姆加至去离子双蒸馏水中，于40-5(TC条件下混匀，制得混悬液
A;
b) 将5-10mg结合探针多肽的棕榈酸加至150-250y l有机溶剂无水乙醇中，于35-6(TC条 件下溶解完全，制得溶液B;
c) 将混悬液A应用探头式超声仪超声处理，同时将溶液B逐滴加入其中，充分混匀，得 澄清溶液C;
d) 将PEG-4000加入澄清液C中，溶解完全；再将全氟丙烷气体通入溶液C中，充分饱和 的同时，应用高速机械剪切设备处理，形成平均粒径为1 4微米的微泡混悬液。
其中所述的超声仪为频率10 50KHz的探头式超声仪；混悬液A于探头超声仪中进行超声 处理，工作3秒，暂停3秒，功率30%， 3分钟，超声处理次数为一次或两次。
本发明根据自制造影剂的材料特点，特地选取棕榈酸作为造影剂壁材料的主要原料之一 ，其不溶于水，在维护微泡稳定性发挥着重要作用，并且棕榈酸能够作为表面活性剂并形成 微泡外薄膜，微泡表面覆盖一层薄的棕搁酸壳，其作用在于将气液分开，减慢气体溶解，也 增加了微泡的稳定性。
本发明关键还能以棕榈酸作为桥连剂，将配体(探针多肽)稳定结合于微泡表面，而不 需要添加造影剂制备原料以外的试剂材料用于连接配体，因此制备方法简单，对微泡本身特 性干扰小，有利于纯化靶向造影剂。
此外，配体(探针多肽)结合效率很高棕榈酸是KGDS-TUCA(或RGDA-TUCA)微泡膜重要 的组成成份，而使用的KGDS-棕榈酸化合物(或RGDS-棕榈酸化合物)又是纯度很高的原料(纯 度>95%)，因此微泡膜上有棕榈酸存在，就有配体KGDS (或配体RGDS)连接于表面。
本发明制备超声造影剂，优选少数几种膜材料及其比例，首先将靶向探针结合在棕榈酸 上并纯化，制备工艺采用超声匀化、高速剪切机剪切生成微泡的方法，具有制备原料少，制 备工艺简单、方便，制备的超声微泡大小适宜、粒径分布均一、靶向探针结合率高等特点。 由于棕榈酸不溶于水，溶于乙醇等有机溶剂，而合成磷脂易溶于水，为使棕榈酸与合成磷脂充分混匀，本发明采用超声匀化的方法，既可起到脱气作用，又可使膜材料充分、均匀地以 分子态分散在溶液中，为进一步高速剪切法制备微泡打下良好的基础(与以往超声振荡法制 备超声造影剂时使用超声的目的不同，超声振荡法中使用超声目的是直接产生微泡)；在得 到膜材料充分、均匀混合的溶液后，再根据需要调节高速剪切速度和时间，即可制备粒径、 浓度适宜的靶向超声造影剂。
本发明血栓耙向超声造影剂及其制备方法属于分子影像学(molecular imaging, MI)的 研究范畴，应用超声影像学的方法对活体状态下的生物过程进行细胞和分子水平的定性和定 量研究。 一方面，可以特异地显像以及增强显像活体内血栓，特别是微血栓的形成，对血栓 的形成做到早发现、早诊断、早治疗；另一方面，为进一步合成其他多种以多肽为探针的耙 向超声造影剂提供了一种简单、方便、合成效率高的方法。
图l为普通造影剂经流式细胞仪检测的荧光结果图； 图2为本发明靶向造影剂经流式细胞仪检测的荧光结果图； 图3为荧光显微镜观察本发明靶向超声造影剂荧光图； 图4为本发明靶向造影剂靶向显示血栓的超声图5为结合本发明靶向造影剂的血栓经无气水洗涤后的超声图； 图6为普通造影剂显示血栓的超声图7为靶向拮抗抑制实验显示血栓的超声图。
具体实施例方式
下面结合实施例具体说明本发明，而不是限制本发明。
实施例l:探头超声时的功率、时间对制备微泡的影响
将40mgDSPC、 4mgDPPA、 5mg泊洛沙姆，40-50。C充分混悬于5ml双蒸水中，制成混悬液A ;再将5mg FITC-KGDS-Palm (带荧光的结合多肽的棕榈酸)溶于200 y l无水乙醇中，于40。C 条件下溶解完全，制成溶液B;混悬液A于探头超声仪中进行超声处理(工作3秒，暂停3秒， 功率30%， 3分钟)，超声次数为一次或两次，在超声过程中逐滴加入溶液B，观察所制得溶 液的澄清度。结果见下表。
超声次数(次)溶液澄清度
1稍貌浊，欠澄涪
2完全澄清
溶液c的澄清度直接影响制备的微泡浓度、粒径大小。溶液越澄清，说明脂质成分以分子态分散于溶液中的程度越高，高速剪切时形成的微泡粒径越均匀，微泡密度越大。 实施例2:
将40mgDSPC、 4mgDPPA、 5mg泊洛沙姆，40-50。C充分混悬于5ml双蒸水中，制成混悬液A ;再将8mg FITC-KGDS-Palm溶于250y l无水乙醇中，于6(TC条件下溶解完全，制成溶液B; 混悬液A于探头超声仪中进行超声处理(工作3秒，暂停3秒，功率30%， 3分钟)，超声次数 为一次或两次，在超声过程中逐滴加入溶液B，观察所制得的溶液均澄清。
探针多肽是KGDS或RGDS，设计并采用9-芴甲氧羰基(fluorenylmethoxycarbony， Fmoc) 固相合成法合成了多肽配体棕榈酸直接联结物，高效液相色谱纯化，纯度>95%，质谱鉴定 分子结构正确，探针多肽与棕榈酸的结合比例为lmol: lmol。探针多肽合成及其棕榈酸化由 北京中科亚光生物有限公司特约合成。
实施例3:高速剪切速度对微泡产率和粒径的影响
将5mg PEG-4000加入实施例1和2制备的澄清液C中，溶解完全；通入全氟丙烷气体充分 饱和澄清液C，同时以不同剪切速度、不同剪切时间对溶液C进行处理，制备的微泡混悬液粒 径及浓度如下
剪切速度(r/mm) X时间(mm)微泡浓度(1 t)。/ml) 嫩包平均直径(u m) 5000 Xlmm 0.73 3.8 5,X2mm0.93 3.4 1CI[I00X1腿 1.2 2.0 1Cl[l00X2腿 1.5 1.5
实施例l中结合多肽的棕榈酸含量为造影剂的O. 1重量％，合成磷脂含量为造影剂的0.9 重量％， PEG-4000含量为造影剂的0. 1重量％，泊洛沙姆含量为造影剂的O. 1重量％。
实施例2中结合多肽的棕榈酸含量为造影剂的0. 16重量％，合成磷脂含量为造影剂的 0.9重量％， PEG-4000含量为造影剂的0. 1重量％，泊洛沙姆含量为造影剂的O. 1重量％。
实施例4:本发明KGDS —超声造影剂配体结合效率的实验
随机计数50， OOO个微泡，以未结合KGDS的自制普通超声造影剂与纯化后KGDS耙向造影剂 作对照，检测其荧光度的差别，判断带有荧光FITC的KGDS与微泡结合效率。二者对比，KGDS -TUCA有90.04X的微泡荧光不同，因此配体KGDS与微泡的结合效率约为90.04X。见图l和 2
实施例5:本发明KGDS —超声造影剂体外耙向成像血栓的实验1) 探针KGDS多肽带有FITC荧光，荧光显微镜观察KGDS-TUCA，可见密集分布的表面呈绿 色光环的微泡，其浓度密集，大小均一，形态规整(见图3)，证实配体KGDS连于微泡表面
2) 体外靶向性实验结果
制备血凝块采集5名健康成人手肘静脉血各10ml置于不加任何抗凝剂的试管中，37 °C 恒温水箱孵化1.5h，最后得到15块面积约为0. 5cmX0. 5 cm的新鲜全血细胞凝块(即红色血 栓)。
实验仪器AL0KA alO彩色超声诊断仪，浅表5412探头，频率3. 75腿z、声场深度4cm、 MIO. 11，实验过程中维持增益、取样深度、TGC、聚集范围不变。
含100ml无气水的水槽中加入血凝块、造影剂，采用超声造影模式观察血凝块增强情况
A组(靶向组)血凝块与KGDS-TUCA共孵育后，其表面呈环状高回声增强(如图4)， 采用无气水反复漂洗三次，依然呈环状强回声(如图5)。
B组(对照组)血凝块与普通造影剂共孵育后，血凝块无增强，回声呈"充盈缺损" 声像(如图6)。
C组(拮抗剂阻断组)血凝块与KGDS充分共孵育后，再加入KGDS-TUCA，血凝块表面无 增强，回声呈"充盈缺损"声像(如图7)。序 歹lj 表
〈110> 王，维 高，峰 丁，燕飞
〈120> —种脂质靶向超声造影剂及其制备方法 〈130> 无 〈160> 2
〈170> Patentln version 3.3
〈210> 1
〈211> 4
〈212> PRT
〈213> Artificial
〈220>
〈223> 人工序列 〈400> 1
Lys Gly Asp Ser 1
〈210> 2
〈211> 4
〈212> PRT
〈213> Artificial
〈220>
〈223> 人工序列 〈400> 2
Arg Gly Asp Ser 权利要求
1.一种脂质靶向超声微泡造影剂，平均粒径为1～4微米的微泡混悬液，球壁材料包括合成磷脂、聚乙二醇、泊洛沙姆；包裹气体为氟碳类组织相容性惰性气体，溶液为去离子双蒸馏水，其特征在于球壁材料中还含有结合探针多肽的棕榈酸。
2 根据权利要求l所述的造影剂，其特征在于，所述的探针多肽的序 列为赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸或精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸，探针多肽与棕 榈酸的结合比例为lmol: lmol。
3 根据权利要求l所述的造影剂，其特征在于，结合多肽的棕榈酸含 量为造影剂的O. 1 0. 2重量％。
4 根据权利要求l所述的造影剂，其特征在于，合成磷脂含量为造影 剂的0.02-0.9重量％，聚乙二醇含量为造影剂的0.01 0. 1重量％，泊洛沙姆含量为造影剂 的O. 01 0. 1重量％。
5 根据权利要求l的所述的造影剂，其特征在于，所述合成磷脂选自 二棕榈酸磷脂酰胆碱DSPC和二棕榈酰磷脂酸DPPA;所述的聚乙二醇为PEG-4000;所述气体为 全氟丙烷C3F8。
6 权利要求l所述的脂质靶向超声微泡造影剂的制备方法，其特征在 于，包括以下步骤a) 将合成磷脂、泊洛沙姆加至去离子双蒸馏水中，于40-5(TC条件下混匀，制得混悬液A;b) 将5-10mg结合探针多肽的棕榈酸加至150-250y l有机溶剂无水乙醇中，于35-6(TC 条件下溶解完全，制得溶液B;c) 将混悬液A应用探头式超声仪超声处理，同时将溶液B逐滴加入其中，充分混匀，得 澄清溶液C;d) 将PEG-4000加入澄清液C中，溶解完全；再将全氟丙烷气体通入溶液C中，充分饱和 的同时，应用高速机械剪切设备处理，形成平均粒径为1 4微米的微泡混悬液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的探针多肽的 序列为赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸或精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸，探针多肽与棕榈酸的结合比例为lmol: lmol。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，合成磷脂含量为造 影剂的0.02-0.9重量％， PEG-4000含量为造影剂的0.01 0. 1重量％，泊洛沙姆含量为造影 剂的O. 01 0. 1重量％，
9.根据权利要求6或8的所述的制备方法，其特征在于，所述合成磷 脂选自二棕榈酸磷脂酰胆碱DSPC和二棕榈酰磷脂酸DPPA。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，其中所述的超声 仪为频率10 50KHz的探头式超声仪；混悬液A于探头超声仪中进行超声处理，工作3秒，暂 停3秒，功率30%， 3分钟，超声次数为一次或两次。
全文摘要
本发明涉及一种脂质靶向超声造影剂及其制备方法。该造影剂是将合成磷脂、泊洛沙姆加至去离子双蒸馏水中混匀，制得混悬液A；再将结合探针多肽的棕榈酸加至有机溶剂无水乙醇中溶解，制得溶液B；将混悬液A超声处理，同时将溶液B逐滴加入其中，混匀得澄清溶液C；将PEG-4000加入澄清液C中溶解；再将全氟丙烷气体通入溶液C中，充分饱和的同时，应用高速机械剪切设备处理，形成平均粒径为1～4微米的微泡混悬液。制备的超声微泡大小适宜、粒径分布均一、稳定、浓度适宜、靶向探针结合率高；不需要添加造影剂制备原料以外的试剂材料用于连接配体，制备方法简单，对微泡本身特性干扰小，有利于纯化靶向造影剂。
文档编号A61K49/22GK101637613SQ20091030581
公开日2010年2月3日 申请日期2009年8月19日 优先权日2009年8月19日
发明者丁燕飞, 维 王, 盛小茜, 罗卓琼, 峰 高 申请人:王 维;高 峰;丁燕飞