专利名称：稳定剂和含一种或多种减毒活黄病毒的疫苗组合物的制作方法
稳定剂和含一种或多种减毒活黄病毒的疫苗组合物本发明涉及用于包含一种或多种减毒活黄病毒的疫苗组合物的稳定剂、用该稳定 剂稳定的散装(bulk)疫苗组合物、尤其是制备自该散装疫苗组合物的干燥疫苗组合物、以 及用于稳定一种或多种减毒活黄病毒的方法。黄病毒为黄病毒科的病毒属。所述属包括登格热(DEN)病毒、黄热病(YF)病毒、圣 路易斯脑炎病毒(Saint Louis encephalitis virus)、日本脑炎(JE)病毒和西尼罗(WN) 病毒。在这些病毒中，某些为不稳定的。在本发明的范围内，术语“黄病毒”意指黄病毒科中对动物包括哺乳动物是致病 的任何病毒，尤其是对人类是致病的黄病毒。作为非限制性实例，可指以下黄病毒登格热 (DEN)病毒血清型1、2、3和4、日本脑炎(JE)病毒、黄热病(YF)病毒和西尼罗(WN)病毒。术语“活的”以其常规意思使用，活病毒为未灭活的病毒，即能在允许细胞中复制 的病毒。减毒活黄病毒为不会引起由相应的野生型病毒在动物或人类中引起的疾病，并且 能诱导特异性免疫应答的黄病毒。作为可与本发明的稳定剂一起使用的减毒活黄病毒的非限制性实例，可指减 毒病毒株例如JEV毒株SA-14-14-2、描述于US 6589522中的YF毒株、描述于申请WO 2006/134433 Al中的登格热病毒株、尤其是VDVl毒株、描述于申请WO 2006/134443 Al 中的毒株、尤其是VDV2毒株；例如在申请:W0 02/66621、WO 00/57904、WO 00/57908、WO 00/57909 ；WO 00/57910、WO 02/095075 和 WO 02/102828 中描述的毒株，以及毒株 DEN-I 16007/PDK13(也称为“LAV1”)、DEN-2 16681/PDK53 (也称为“LAV2”)和 LAV4，其描述于专 利申请EPl 159 968 A中。VDVl毒株为得自野生型DEN-I毒株16007的毒株，该野生型DEN-I毒株16007在 PDK细胞中经过11次传代(DEN-1 16007/PDK11)，随后将其在Vero细胞中于32°C下扩繁， 纯化其RNA并转染至Vero细胞中。VDV-I毒株与疫苗毒株DEN-I 16007/PDK13 (在PDK-原 代犬肾细胞中经过13次传代)相比具有14个额外的突变。VDV-I毒株的完整序列以及制 备方法和表征在申请WO 2006/134433A1中给出。所述毒株可基于该教导容易地繁殖。VDV-2毒株为得自野生型DEN-2毒株16681的毒株，所述DEN-2毒株16681在PDK 细胞中经过50次传代(DEN-2 16681/PDK50)，纯化空斑，然后在转染入Vero细胞之前提取 和纯化其RNA。随后通过在Vero细胞中的空斑纯化和扩繁得到VDV-2毒株。VDV-2毒株与 疫苗毒株DEN-2 16681/PDK53 (在PDK细胞中经过53次传代)相比具有10个额外的突变。 VDV-2毒株的完整序列以及制备方法和表征在申请WO 2006/134443 Al中给出。所述毒株 可基于该教导容易地繁殖。在可与本发明的稳定剂一起使用的减毒活黄病毒中，还可以非限制性方式提及嵌 合病毒，例如描述于例如国际申请WO 93/06214中的嵌合病毒以及ChimeriVax 。术语 “ChimeriVax ”或“CYD”指嵌合黄热病(YF)病毒，其包含YF病毒的骨架，其中编码前驱 膜(premembrane)蛋白和包膜蛋白的序列已用不同黄病毒(例如登格热(DEN)病毒、日本 脑炎(JE)病毒或西尼罗(WN)病毒)的任何毒株的相应序列置换。这些ChimeriVax 的构建已详细描述于国际专利申请WO 98/37911和WO 03/101397，可作出对其关于制备这些 ChimeriVax 方法的准确描述的引用。由 C.-J. Lai 和 T. P. Monath 在“Advances in Virus Research", (2003)第61卷，第469-509页中给出关于可在本发明的范围内使用的减毒活
嵌合黄病毒的综述。因此，包含登格热血清型1毒株(DEN-I)的PrM和E序列的嵌合YF病毒称为 CYD-I或CYD DENl。包含DEN-2毒株的prM和E序列的嵌合YF病毒称为CYD-2或CYD DEN2。包含DEN-3毒株的prM和E序列的嵌合YF病毒称为CYD-3或CYD DEN3。包含DEN-4 毒株的PrM和E序列的嵌合YF病毒称为CYD-4或CYD DEN4。登格热嵌合病毒可例如为 ChimeriVax DEN-1、尤其是YF17D/DEN-1 病毒、或其它ChimeriVax DEN-2、尤其是YF17D/ DEN-2 病毒、ChimeriVax DEN-3、尤其是 YF17D/DEN-3 病毒、或者 ChimeriVax DEN-4、尤 其是YF17D/DEN-4病毒。在实施例中描述的嵌合体通过使用得自DEN 1 PU0359 (TVP1140)、 DEN2 PU0218、DEN3 PaH881/88 和 DEN4 1228 (TVP 980)毒株的 prM 和 E 序列产生。优选的是，嵌合YF病毒包含减毒黄热病毒株YF17D Crheiler M和Smith HH (1937) J Exp. Med 65，第 767-786 页·) (YF17D/DEN-1、YF17D/DEN-2、YF17D/DEN-3、YF17D/DEN-4 病毒)的骨架。可使用的YF17D毒株的实例包括YF17D204 (YF-Vax ，Sanofi-Pasteur, Swifwater, PA, USA ；Stamaril Sanofi-Pasteur, Marcy I ‘ Etoile, France ；ARILVAX , Chiron,Speke,Liverpool,UK ；FLAVIMUN(S)5Berna Biotech,Bern,Switzerland ；YF17D-204 France (X15067, X15062) ；YF17D-204，234 US (Rice 等，1985，Science, 229 :726-733)，或者 其它相关毒株 YF17DD (Genbank 登记号 U17066)、YF17D-213 (Genbank 登记号 U17067)和由 Galler 等(1998，Vaccines 16(9/10) :1024-1028)描述的 YF17DD 毒株。可在人类中使用 的任何其它减毒黄热病毒株可用于嵌合体的构建。因此，这些所述黄热病毒株可与本发明 的稳定剂一起用于制备可在针对黄热病的免疫情形下使用的组合物。如例如在专利申请WO 96/40933和WO 01/60847中所述，其中载体为登格热病毒 的嵌合体也可与本发明的稳定剂一起使用。嵌合病毒的不同实施方案也描述于申请WO 02/102828 ；WO 03/103571 ；WO 02/072835 ；WO 2004/045529 ；WO 2005/082020中，其病毒也可与本发明的稳定剂一起使用。此外，其中插入的异源序列为如申请WO 03/102166中所述的序列的上述嵌合载 体也可在本发明的范围内使用。嵌合病毒具有显示如上面定义的减毒活病毒特征的特殊性。因此，有可能在本发 明的范围内使用任何嵌合病毒，其表达包膜蛋白或者一种或多种黄病毒的一种或多种包膜 蛋白的一个或多个表位，并且诱导特异性免疫应答，所述特异性免疫应答包括中和所述包 膜蛋白或所述表位所来源的毒株或者至少一种所述毒株的抗体。在本发明的范围内，术语“散装疫苗组合物”意指退出抗原产生的最终阶段，纯化 或非纯化的、单价、或多价混合后的组合物。在本发明的范围内，术语“干疫苗组合物”意指以下组合物，其残留水含量少于或 等于3%，并且其随时可用水溶液重构以用作疫苗或直接呈干颗粒形式。术语“喷雾冷冻干燥”应理解为意指在低温环境中与流体一起喷雾，接着冷冻干燥 所得到的冷冻颗粒。
术语“泡沫干燥”应理解为意指通过蒸发水以玻璃状泡沫形式干燥浓溶液。术语“冷冻泡沫干燥”应理解为意指在低于玻璃化转变温度和矩阵坍塌温度 (matrix collapse temperature)的温度下，通过冰的升华以玻璃状泡沫形式干燥预冷冻 的溶液。黄病毒的含水组合物在长期和温度高于5°C下不允许良好的病毒稳定性。作为实 例，YF-DEN(黄热病-登格热)嵌合体的散装含水组合物在液体中稳定时在37°C下储存1 天后损失超过41og。现今，该热不稳定性在冷藏环节条件下运输困难的亚热带YF流行国家 中是严重的问题。在1970-1980年间，冻干的黄热病疫苗显示严重的热不稳定问题(储存在+5°C 下6个月)。这些冻干的无稳定剂的疫苗当暴露于高于20°C的温度下时降解非常迅速。人 们作出了对改善冻干的黄热病疫苗组合物的稳定性的努力(在37°C下于7天内的损失， 未稳定化疫苗0. 871og，稳定化疫苗0. 241og)。发现开发用于黄热病的稳定剂(M. Barme 和 C. Bronnert, J. Biol. Standardization, 1984，12，第 4；35 页)，在用于嵌合 YF-DEN(黄 热病-登革热)疫苗时为无效的(在37°C下于7天内的损失对于血清型1 :2. Ilog ；对于 血清型2 1. 31og ；对于血清型3 1. 41og ；对于血清型4 :1. 91og)。最近，A. A. Adebayo等 (Biologicals (1998) 26, 309-316)提出了用于冻干的17D黄热病疫苗的稳定剂，他们发现 在37°C下储存观天后活的且有效的17D病毒的损失为50% (0.31og)。也是最近，在WO 2008/057550中提出将作为稳定剂的人血清白蛋白(HSA)与作为填充剂的糖以及缓冲剂混 合用于含减毒活黄病毒的冻干组合物中。本发明使解决黄病毒疫苗组合物、尤其是嵌合黄病毒疫苗、特别是YF-DEN(黄热 病-登革热)嵌合体的稳定化问题成为可能。因此，本发明涉及用于包含一种或多种减毒活黄病毒的疫苗组合物的稳定剂，其 特征在于其在无动物源蛋白且没有加入具有二价阳离子的盐的水溶液中包含-缓冲剂，- 2. 5%-6. 5%的山梨醇，- 2. 5%-13% 的蔗糖，- 0-7. 5%的海藻糖和/或0-7. 5%的任何其它二糖或三糖，- 0. 2%-0. 5% 的尿素，- 0.8% -2.5%的氨基酸混合物，其包含精氨酸(Arg)、胱氨酸(Cys-Cys)、组氨酸 (His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Wie)、苏氨 酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)、天冬酰胺(Asn)、天冬 氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)和丝氨酸(Ser)。本发明的稳定剂可包含一种或多种选自以下的缓冲剂TRIS(三(羟基甲基)氨 基甲烷)、HEPES(244-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基)乙磺酸)和磷酸钾和/或磷酸钠，TRIS 的浓度例如为5-10mM，HEPES的浓度例如为7. 5_20mM。更具体的是，本发明的稳定剂包含3.8% (w/v)的山梨醇，7.5% (w/v)的蔗糖，5.5% (w/v)的海藻糖，
0. 25% (w/v)的尿素和
1.5% (w/v)的氨基酸混合物。
本发明还涉及稳定化散装含水疫苗组合物，其包含一种或多种减毒活黄病毒以及 本发明的上述稳定剂。
本发明的组合物可包含减毒活登格热(DEN)病毒和/或减毒活黄热病(YF)病毒 和/或减毒活西尼罗(WN)病毒病病毒和/或减毒日本脑炎(JE)病毒的一种或多种血清型。
本发明的变体包括一种或多种减毒活嵌合黄病毒，例如嵌合YF-DEN (黄热病-登 革热)病毒、嵌合YF_WN(黄热病-西尼罗病毒)病毒和/或嵌合YF-JE(黄热病-日本脑 炎)病毒的一种或多种血清型。
本发明还涉及用于稳定一种或多种减毒活黄病毒的方法。在制备减毒活黄病毒的 最后阶段(例如，在Vero细胞中培养，感染和病毒培养，之后的一步或多步纯化)，通过加 入稳定剂以得到终浓度的本发明稳定剂，来稀释包含减毒活黄病毒的纯化或非纯化的和浓 缩或非浓缩的病毒收获物(viral harvest)，以得到本发明的稳定化散装含水疫苗组合物。 通过混合纯化或非纯化的、浓缩或非浓缩的且稳定化病毒收获物，得到多价组合物。
本发明的稳定化方法还可包括通过选自以下的方法干燥含水组合物泡沫干燥、 喷雾干燥或冷冻泡沫干燥，例如通过冷冻干燥法或通过喷雾冷冻干燥法干燥含水组合物。 就选择冷冻干燥或喷雾冷冻干燥法而言，本发明的稳定化方法可通过以下步骤改良在第 一步中以均勻颗粒或珠粒形式冷冻含水溶液，在第二步中干燥冷冻的均勻颗粒或珠粒，以 便得到均勻颗粒形式或珠粒形式的稳定化干燥制品。珠粒的产生可优选在无菌条件下进 行。通过滴入非常冷的气体(蒸发的液氮)中或通过直接滴入低温液体(例如液氮)中 冷冻本发明的含水组合物的液滴，来产生均勻颗粒或珠粒(或更具体地微珠)。从水溶液 或液体制备冷冻的均勻颗粒或冷冻的珠粒阐述于I3Hce等(US 36555838)、Adams等(US 4211015)、Α· A. Fawzy等(US 5307640)、R. 0. Williams III等(US6862890B2),P. F. Herbert 等(WO 96/36317)和P.-R. Nyssen等(US 6903065B2)中。还可例如实现对小滴的冷冻，以 对本发明的稳定化散装含水疫苗组合物进行造粒(prill)，以便产生标准小滴(calibrated droplet)，其直径范围为IOOym至1500μπι，具有极窄的粒度分布。这些小滴落入低温室， 其中通过制冷剂(freezing medium)通过直接喷射/喷雾液氮或者通过逆流流动非常冷的 气体例如氮气、CO2或空气来保持低温。在小滴落下期间使其冷冻，以便形成标准冷冻颗粒。
造粒(prilling)，也称为层状射流分散技术(laminar jet break-up technique)，为产生标准液体小滴的熟知技术，标准液体小滴常用于生物催化剂和 活细胞固定化领域(Hulst 等，1985. A new technique for the production of immobilized biocatalyst and large quantities (用于制备和大量制备固定化生物 催化剂的新技术).Biotechnol. Bioeng. 27，870-876 ；Gotoh 等，1993. Mass production of biocatalyst-entrapping alginate gel particles by a forced oscillation method(通过强迫振荡法大量制备包埋生物催化剂的藻酸盐凝胶颗粒).Chem. Eng. Commun. 120,73-84. ；Seifert 禾口 Philips,1997.Production of small, monodispersed alginate beads for cell immobilization(用于细胞固定化的小的单分散藻酸盐珠粒的 制备)· Biotechnol. Prog. 13，562-568)。Lord Rayleigh最早分析关于牛顿流体从喷嘴中 喷出的毛细管射流的不稳定性并提出描述该不稳定性的模型(Rayleigh L, 1978. On thestability of jets (关于射流的稳定性).Proc. London Math. Soc. 10,4-13) offeber (Weber C, 1931. Zum Zerfall eines Fliissigkeitsstrahles. Ζ. Angew. Math. Mech. 11,136-154)扩 展了该分析，包括了粘度的影响。关于最快增长扰动(fastest growing disturbance)和 射流分散的最佳波长由以下公式给出
权利要求
1.一种用于包含一种或多种减毒活黄病毒的疫苗组合物的稳定剂，所述稳定剂在无动 物源蛋白且没有加入具有二价阳离子的盐的水溶液中包含缓冲剂，·2.5% -6. 5%的山梨醇，·2. 5% -13%的蔗糖，·0-7. 5%的海藻糖和/或0-7. 5%的任何其它二糖或三糖，·0. 2% -0. 5%的尿素，·0. 8% -2. 5%的氨基酸混合物，其包含精氨酸(Arg)、胱氨酸(Cys-Cys)、组氨酸(His)、 异亮氨酸(He)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸 (Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸 (Asp)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)和丝氨酸(Ser)。
2.权利要求1的稳定剂，所述稳定剂包含一种或多种选自以下的缓冲剂TRIS(三(羟 基甲基)氨基甲烷)、HEPES(244-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基)乙磺酸)和磷酸钾和/或磷 酸钠。
3.权利要求2的稳定剂，其中所述TRIS以5-10mM的浓度存在。
4.权利要求2的稳定剂，其中所述HEPES以7.5-20mM的浓度存在。
5.权利要求1-4中任一项的稳定剂，所述稳定剂包含3.8% (w/v)的山梨醇，7.5% (w/v)的蔗糖，5.5% (w/v)的海藻糖，0. 25% (w/v)的尿素以及·1.5% (w/v)的氨基酸混合物。
6.一种稳定化散装含水疫苗组合物，所述组合物包含一种或多种减毒活黄病毒以及权 利要求1-5中任一项的稳定剂。
7.权利要求6的组合物，所述组合物包含一种或多种减毒活登格热(DEN)病毒血清型。
8.权利要求6或7的组合物，所述组合物包含减毒活黄热病(YF)病毒。
9.权利要求6或8的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含减毒活西尼罗(WN)病毒病病
10.权利要求6-9中任一项的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含减毒活日本脑炎(JE)病毒。
11.权利要求6-10中任一项的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含一种或多种嵌合减毒活黄病毒。
12.权利要求11的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含嵌合YF-DEN(黄热病-登格热) 病毒的一种或多种血清型。
13.权利要求11-12中任一项的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含嵌合YF-WN(黄热 病-西尼罗病毒)病毒。
14.权利要求11-13中任一项的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含嵌合YF-JE(黄热 病-日本脑炎)病毒。
15.一种用于稳定一种或多种减毒活黄病毒的方法，所述方法包括通过加入稳定剂以获得终浓度的权利要求1-5中限定的稳定剂，来稀释包含一种或多种减毒活黄病毒的纯化 并浓缩的病毒收获物，以获得权利要求6-14中任一项的组合物。
16.权利要求15的稳定化方法，所述方法包括用选自泡沫干燥、喷雾干燥或冷冻泡沫 干燥的方法干燥含水组合物。
17.权利要求15的稳定化方法，所述方法包括用冷冻干燥法干燥含水组合物。
18.权利要求15的稳定化方法，所述方法包括用喷雾冷冻干燥法干燥含水组合物。
19.权利要求17和18中的任一项的稳定化方法，其中在第一步中，以均勻颗粒形式或 以珠粒形式冷冻水溶液，以及其中在第二步中，使冷冻的均勻颗粒或珠粒经过干燥，以获得 均勻颗粒形式或珠粒形式的稳定化干燥制品。
20.权利要求19的稳定化方法，其中稳定化干燥制品的均勻颗粒或珠粒具有约 100μπι-1500μπι 的直径。
21.权利要求20的稳定化方法，其中稳定化干燥制品的均勻颗粒或珠粒具有约 500μπι-1000μπι 的直径。
22.—种干燥疫苗组合物，所述组合物通过干燥权利要求6-14中任一项的稳定化散装 组合物而获得。
23.权利要求22的干燥疫苗组合物，所述组合物以均勻颗粒形式或以珠粒形式存在。
24.权利要求23的干燥疫苗组合物，其中每一个颗粒或每一个珠粒包含各种减毒活黄 病毒和/或嵌合减毒活黄病毒的混合物。
25.权利要求23的干燥疫苗组合物，其中每一个颗粒或每一个珠粒包含单一类型的减 毒活黄病毒和/或嵌合减毒活黄病毒。
26.一种用于制备疫苗的方法，所述方法包括用水溶液重构权利要求22-25中任一项 的组合物的步骤。
27.一种黄病毒的疫苗试剂盒，所述试剂盒包括含权利要求22-25中任一项的干燥疫 苗组合物的第一容器，以及含用于重构疫苗的水溶液的第二容器。
28.权利要求27的试剂盒，其中第一容器包含权利要求25的各种疫苗组合物的混合物。
全文摘要
本发明涉及用于包含一种或多种减毒活黄病毒的疫苗组合物的稳定剂、用该稳定剂稳定的散装疫苗组合物、尤其是制备自该散装疫苗组合物的干燥疫苗组合物、以及用于稳定一种或多种减毒活黄病毒的方法。
文档编号A61K39/12GK102089002SQ200980127083
公开日2011年6月8日 申请日期2009年7月9日 优先权日2008年7月9日
发明者A·弗兰孔, A·莱勒, O·布拉斯, P·索温克 申请人:赛诺菲巴斯德有限公司