专利名称：疫苗制剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒和基于病毒的疫苗的稳定剂型。在低于水的冰点的温度下使病毒稳定的难点是在冷冻和融化过程中防止结构和功能组分的物理破坏。为了确保储存期间的稳定性，感染性病毒的原种通常储存在<60°c下。此外，病毒的冷藏(例如5_8°C)制剂可能具有有限的稳定性。发明一般背景改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)是痘病毒科(Poxviridae)正痘病毒属 (Orthopoxvirus)的高度减毒的成员。被工程化改造以表达外源基因的痘病毒是在生物医学研究中用于靶蛋白合成和疫苗开发的公认工具。它们的有利特性包括对重组DNA的大包装能力、靶基因表达的精确的病毒特异性控制、在宿主中缺乏持久性或基因组整合、作为疫苗的高免疫原性以及载体和疫苗容易生产。在安全性顾虑主导的人类中复制缺陷型病毒的开发后，MVA作为痘苗病毒(VV)天花疫苗的替代物出现。在鸡胚成纤维细胞中传代超过570代之后，MVA失去了 VV的广谱细胞宿主范围，在许多哺乳动物来源的细胞、包括人类细胞中不能有效生长。MVA已经用于超过100，000人的初次天花疫苗接种而没有严重问题，并且在试验动物中测试后被认为是无致病力的。对于大多数目的来说，MVA载体的产生需要来自质粒的单一基因组插入片段，该片段带有一个或两个置于VV特异性启动子控制下的重组基因。在MVA基因组或编码VV蛋白胸腺嘧啶核苷激酶或血细胞凝集素的基因座中天然存在的缺失位点，被用作插入重组基因序列的位点。许多早期研究致力于开发对抗人类多种病毒感染的MVA候选重组疫苗，所述多种病毒包括引起AIDS、流感、早期儿童呼吸道疾病、麻疹、日本脑炎、登革热或疟疾的病毒。因为迫切需要对抗AIDS的有效疫苗，产生免疫缺陷病毒抗原的重组MVA是在人类中作为候选疫苗而被评估的第一批载体病毒之一。病毒在其天然环境之外通常是不稳定的，所述环境在细胞区室与细胞外流体之间可能相当不同。如果某些条件不能维持，纯化的病毒可能不能正常发挥作用或保持可溶。此外，病毒滴度可能受到蛋白水解、聚集和亚最适缓冲条件的影响。例如，在疫苗接种中使用的纯化病毒通常需要储存较长时间，同时保持其原始结构完整性和/或活性。储存“货架寿命”的范围可以从数周到一年以上不等，并依赖于病毒的性质和使用的储存条件。为了确保稳定性，治疗性病毒制剂一般作为冻干物质提供，其在临使用前溶解在独立包装的水溶性稀释剂中；然而，这种方法增加了制造成本，并牵涉不正确给药的增加风险，因为冻干蛋白需要在临使用前溶解，并且经常在冻干过程后观察到感染性滴度的损失。 可选地，治疗性病毒制剂可以作为溶液提供，其含有用于增加稳定性的添加剂。例如，已经提出了可用于配制蛋白溶液的添加剂例如游离氨基酸(例如亮氨酸、色氨酸、丝氨酸、精氨酸和组氨酸)。一些目前在市场上可获得的病毒制剂含有蛋白质作为稳定剂。人血清白蛋白(HSA)或纯化的明胶可用于抑制病毒溶液中的化学和物理变化。但是，添加这些蛋白牵涉用于除去病毒污染的复杂过程。此外，它们可能产生强过敏反应，其限制了它们的应用。液体病毒制剂通常作为冷冻固体储存。常规的深低温保藏法利用各种添加剂来促进玻璃化。玻璃化是通过快速移除或添加热量或通过与添加剂混合，将材料转变成不含任何晶体结构的玻璃样无定形固体的过程。玻璃状固体的固化发生在玻璃化转变温度下(由于过冷现象，其低于熔化温度Tm)。在低温生物学中使用或由生活在极地区域的生物体天然产生的添加剂被称为低温保护剂。常规的低温保护聚焦于获得对生物材料的长期储存最为有利的固体状态，即聚焦于从液体向固体状态的转变。然而，本研究令人吃惊地发现，一旦获得固体冷冻状态后，病毒组合物可能不稳定。发明概述本发明的第一方面提供了液体或冷冻液体组合物，其包含(a)改良的安卡拉痘苗(MVA)病毒或其变体或衍生物；以及(b)甘露糖醇，其中(b)是组合物的唯一稳定剂。本发明的组合物是稳定的。甘露糖醇通常在冻干病毒疫苗剂型中用作增量或结块剂。例如，Maa等Q004， J. Pharm. Sci. 93 (7) :1912-1923)公开了包含甘露糖醇、葡聚糖和肌醇的流感疫苗喷雾冷冻干燥剂型。作者主要使用甘露糖醇作为吸湿剂，但是也假设通过增加脱水粒子的机械强度而改进疫苗稳定性。在冻干的基于MVA的疫苗中使用甘露糖醇作为稳定剂，在本技术领域中是已知的。Zang 等(2007，Chem. Res. Chinese U. ,23(3) =329-332)描述了包含海藻糖、甘露糖醇、 葡聚糖和肌醇的稳定的冻干MVA疫苗组合物。据报道，海藻糖和葡聚糖促进蛋白质天然结构的保护，而甘露糖醇和肌醇据说起到自由基氧化抑制剂的作用。甘露糖醇已被用于液体疫苗剂型中，包括基于MVA的疫苗。美国专利申请 No. 11/202，516在其一般性公开内容中将甘露糖醇与海藻糖和/或葡萄糖的组合列于可能的赋形剂中。然而，没有描述所预期的甘露糖醇的性质。同样，美国专利申请No. 10/379，572 公开了口服MVA-天花疫苗剂型，其任选共同包含甘露糖醇以及其他赋形剂包括AFFA ( 一种营养级鱼油)、羟乙基淀粉和甘油。同样地，没有描述甘露糖醇的所预期的功能性质。美国授权专利7，256，037描述了 MVA液体剂型，其任选包含甘露糖醇作为等渗剂。在液体和冷冻液体病毒疫苗组合物中使用甘露糖醇作为稳定剂，也已有报道。在 WO 2001/066137和WO 2005/052116中，叙述了甘露糖醇由于既是低温保护剂又是自由基清除剂而将其作为病毒稳定剂。W02001/066137也陈述了组合物的病毒可以任选是痘苗病毒。此外，美国专利4，147，772也叙述了甘露糖醇作为液体疫苗剂型的稳定剂。然而，这些公开都没有使用甘露糖醇作为唯一稳定剂。相反，稳定性是使用可以包含甘露糖醇的赋形剂的组合而获得的。使用“变体”，我们是指病毒基因组不具有与改良的安卡拉痘苗病毒(MVA) (GenBank登记号AY603355，VRL 2004年5月15日)100%的核酸序列同一性，但仍然能够赋予对天花的免疫性并感染鸡胚成纤维细胞，同时不能在人类HeLa细胞系中复制。例如， 基因组可以包含与MVA的核酸序列具有至少90%同一性的核酸序列，更优选与所述核酸序列至少 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一。百分同一性可以通过本技术领域公知的方法来确定，例如使用Expasy实验室网站上的 LALIGN 程序(Huang 和 Miller，Adv. App 1. Math. (1991) 12 :337-357)，使用整体比对选项(global alignment option)、计分矩阵(scoring matrix)BL0SUM62、孔间隙罚分 (opening gap penalty)—14、扩展|1]|5|^罚分(extending gap penalty)_4 白勺参使用“衍生物”，我们是指包含基因组插入、缺失和/或取代的重组MVA。使用“稳定的”，我们是指在8°C 士2°C或-23°C 士5°C下储存4周后，组合物的病毒滴度为使用前原始病毒滴度的至少20%，优选为原始感染性的至少30%或40%或50%或 60%或70%或80%或85%或90%，最优选为原始病毒滴度的至少95%、96%、97%、98%或 99%。优选情况下，在储存至少3个月后并且优选在储存6个月、1年、2年、3年或4年后， 最优选在储存5年或更多年后，组合物的病毒滴度维持在该/这些水平上。使用“稳定剂”，我们是指与缺乏某种试剂的相同组合物相比，促进病毒滴度维持的试剂。典型情况下，可以在冷冻储存的一个月至几个月内的比较性研究中检测不稳定性。 然而，由本发明的试剂提供的稳定性效应可能扩展到组合物的整个使用寿命，其可以是5 年或更长时间。优选情况下，在8°C 士2°C或-23°C 士5°C下储存4周后，包含稳定剂的组合物与不含稳定剂的相同组合物相比，具有高至少20%的病毒滴度，更优选高至少30%或 40 %或50 %或60 %或70 %或80 %或85 %或90 %的病毒滴度。优选情况下，在储存至少3 个月后并且优选在储存6个月、1年、2年、3年或4年后，最优选在储存5年或更多年后，包含稳定剂的组合物的病毒滴度与不含稳定剂的相同组合物相比，维持在该/这些水平上。 使用“稳定剂”，我们不包括典型的药物组合物赋形剂，例如(但不限于)防腐剂、缓冲剂、抗微生物剂、增量/填充剂、黏度调节剂、等渗剂、去污剂、乳化剂和表面活性剂。相反，使用“稳定剂”，我们包括了简单的糖例如蔗糖、右旋糖、葡萄糖和果糖，糖醇 /多元醇例如甘油、山梨糖醇、木糖醇、赤藓糖醇和肌醇，以及血清白蛋白例如人血清白蛋白 (HSA)或牛血清白蛋白(BSA)。病毒滴度可以使用本技术领域已知的任何标准技术，例如噬菌斑测定法(在适合时)或TCID5tl测定法等来测量。在病毒噬菌斑测定法中，在包含在某些营养培养基中的细胞培养物中形成可见的结构。通过在细胞培养物中繁殖，病毒产生被称为噬菌斑的细胞破坏区。这些噬菌斑可以凭视觉检测，有时使用裸眼，有时通过其他技术例如染色、显微术、红细胞吸附或免疫荧光，以确定病毒滴度。TCID5tl (组织培养感染剂量50)测定法测定当接种到大量易感组织培养物中时将感染50%的个体培养物的感染性因子、例如病毒的量。为了测定TCID5tl，按照例如基本上如下所述的US 5，391，491的方法(含有或不含血清)制备鸡胚胎细胞(CEC)。将微孔板接种有100 μ ICEC悬液，浓度为切105士20%个细胞/ml。将板在36°C 士2°C下在CO2培养箱中温育过夜。稀释前，将样品和对照制剂(对照)用超声波处理。将样品和对照以10倍的步级在细胞培养基中稀释，产生覆盖整数对数或半对数步级的连续稀释液。稀释步级的适合数量取决于预计的病毒滴度。重组MVA空白对照样品从未稀释的样品开始测试。分别将100 μ 1每种制备的样品或对照稀释液转移8次到含有CEC单层的制备好的微孔板中。另外8个孔用细胞培养基接种，作为阴性(细胞)对照。随后将微孔板在
权利要求
1.一种液体或冷冻液体组合物，其包含(a)改良的安卡拉痘苗(MVA)病毒或其变体或衍生物；以及(b)甘露糖醇，其中(b)是组合物的唯一稳定剂。
2.权利要求1的组合物，其中甘露糖醇在10°C至0°C之间的储存温度下提供稳定效应。
3.权利要求1的组合物，其中组合物是疫苗或在哺乳动物、优选为人类中用于基因治疗、病毒治疗、免疫治疗或癌症治疗。
4.权利要求3的组合物，其中组合物是活疫苗。
5.权利要求4的组合物，其中病毒用于免疫接种，以对抗由选自下列的微生物引起的疾病或病症腺病毒、单纯性疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、细胞肥大病毒、爱泼斯坦巴尔病毒、乙型肝炎病毒、流感病毒、人类乳头瘤病毒、副流感病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、鼻病毒、甲型肝炎病毒、痘苗病毒、大天花病毒、 类天花病毒、轮状病毒、嗜人类T淋巴细胞病毒-1、人类免疫缺陷病毒(HIV)、狂犬病病毒、风疹病毒、黄热病毒、虫媒病毒、阿菲波菌(Afipia spp)、布鲁菌(Brucella spp)、 类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)、衣原体(Chlamydia)、贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)、土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、单核细胞增生性李其jf特菌(Listeria monocytogenes) > 鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、立克次氏体(Rickettsiae)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、鼠疫耳口尔森氏菌(Yersinia pestis)、疱原虫(Plasmodium spp)、小泰累尔梨浆虫(Theileria parva)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、小球隐孢子虫 (Cryptosporidium parvum)、禾[|什曼原虫(Leishmania)、克氏维虫(Trypanosoma cruzi)禾口新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)。
6.权利要求1的组合物，其中组合物基本上是水性的。
7.权利要求1的组合物，其包含0.01%至40%(w/v)的甘露糖醇。
8.权利要求7的组合物，其包含0.至10% (w/v)的甘露糖醇。
9.权利要求8的组合物，其包含约5%(w/v)的甘露糖醇。
10.一种使液体或冷冻液体组合物稳定的方法，所述组合物包含改良的阿卡拉痘苗病毒(MVA)或其变体或衍生物，所述方法包含添加足够量的甘露糖醇，其中甘露糖醇是组合物的唯一稳定剂。
11.权利要求10的方法，其中组合物用于权利要求3或4任一项中限定的目的。
12.权利要求10或11的方法，其中组合物的病毒如权利要求5中所限定。
13.权利要求10到12任一项的方法，其中组合物如权利要求6到9任一项中所限定。
14.甘露糖醇的应用，用于使包含改良阿卡拉痘苗病毒(MVA)或其变体或衍生物的液体或冷冻液体组合物稳定，其中甘露糖醇是组合物的唯一稳定剂。
15.权利要求14的应用，其中组合物用于权利要求3或4任一项中限定的目的。
16.权利要求14到15的应用，其中组合物的病毒如权利要求5中所限定。
17.权利要求14到16任一项的应用，其中组合物如权利要求6到9任一项中所限定。
全文摘要
一种液体或冷冻液体组合物，所述组合物包含改良的安卡拉痘苗(MVA)病毒或其变体或衍生物以及甘露糖醇，其中甘露糖醇是组合物的唯一稳定剂。甘露糖醇可以在0至+10℃下或在冷冻液体组合物中、例如在-10℃至-30℃或-20℃至-23.5℃之间提供稳定效应。MVA可以在哺乳动物、优选为人类中用作疫苗，用在基因治疗、病毒治疗、免疫治疗或癌症治疗中。
文档编号A61K39/285GK102215866SQ200980145709
公开日2011年10月12日 申请日期2009年11月13日 优先权日2008年11月14日
发明者克丽斯塔·陶尔, 曼弗雷德·欧贝瑞瑟, 福柯格雷特·福克纳 申请人:巴克斯特医疗保健股份有限公司, 巴克斯特国际公司