专利名称：：蜈蚣抗肿瘤活性蛋白的制作方法
技术领域：
：本发明涉及的是一种医药
技术领域：
的产品，具体的说，是涉及一种蜈蚣抗肿瘤活性蛋白。
背景技术：
：蜈蚣为节肢动物门唇足纲整形目蜈蚣科动物，具有祛风镇静、解毒散结、通络止痛等功效，主治小儿惊风，抽搐痉挛，中风，半身不遂，破伤风，风湿顽痹，疮疡，瘰疬，毒蛇咬伤等，在中国的药用历史已有2000多年，始见于《神农本草经》。蜈蚣种类丰富，分布广泛，主要种类有少棘蜈蚣、黑头蜈蚣、多棘蜈蚣、墨江蜈蚣等，其中少棘蜈蚣为常用品种。在近代医学中，应用蜈蚣治疗肿瘤、结核病、百日咳、癫痫、神经性头痛、糖尿病等已获得显著疗效。经对现有技术的文献检索发现，蜈蚣全虫水提物具有明显抑瘤活性。焦波等用精原细胞，对蜈蚣水提物进行了抗肿瘤活性的筛选，结果表明蜈蚣水提物可使小鼠睾丸第7精细管精原细胞显著减少或消失，有一定的抗肿瘤作用(焦波，娄红祥，王东兴，等.蜈蚣提取物对小鼠精原细胞的作用.山东医科大学学报，1999,37(4):358)。曾红等对蜈蚣NaCl-HCl提取液进行两次柱层析，得到八种组分，MTT法表明这八种组分均有不同程度的抗癌活性，提示蜈蚣中存在抗癌活性组分(曾红，张国刚，程巨龙.蜈蚣中抗癌活性成分的提取.湖南中医杂志，2004，20(5):57-58)。李风云等研究表明蜈蚣作为中药制剂可有效的抑制肿瘤的活性，并能提高肿瘤患者的免疫功能(李风云，陈浩然，张蓄兰，等.中药制剂抗肿瘤作用的实验研究.中医药学报，1999，27(5):571)。但迄今为止，对蜈蚣抑瘤成分的研究多停留在粗提物的水平。而在中药蜈蚣中，蛋白质为主要成分，含量可达到68.8%。但目前为止，未见从中药蜈蚣中分离出单一的抗肿瘤蛋白组分的相关技术文献的报道。
发明内容本发明的目的在于从传统的用于抗肿瘤的动物药中分离出一种具有高活性、低毒副作用的蛋白，用于癌症的治疗与辅助治疗。本发明是通过以下技术方案实现的。本发明以少棘蜈蚣为原材料，通过水提、硫酸铵沉淀、离子交换层析、疏水层析制得，该方法具有成本低、易操作、重现性好等优点，可用于蜈蚣抗肿瘤活性蛋白的大规模制备。本发明所提供的蜈蚣抗肿瘤蛋白外观为白色粉末，SDS-PAGE显示是单一条带。发明所提供的蜈蚣抗肿瘤蛋白，经测试具有良好的抗肿瘤活性在给药剂量为6.25-100iig/ml范围内可抑制多种肿瘤细胞的生长，且呈现明显的量效关系。本发明所提供的蜈蚣抗肿瘤活性蛋白，主要用于各种癌症的治疗和辅助治疗，如肺癌、肝癌、乳腺癌、大肠癌等，尤其对A549，Lovo，H印G-2，MCF_7，细胞株有较强的杀伤作用。本发明可以通过以下措施来达到1.蜈蚣抗肿瘤活性蛋白的制备将蜈蚣粉碎水提后，通过硫酸铵沉淀法沉淀蛋白，然后通过离子交换色谱进行第一步分离，分离后的组分进行活性测定，有抗癌活性的组分再进行疏水色谱分离，将各组分透析、浓縮、冻干后再次进行抗癌活性测定。最终得到本发明所提供的抗肿瘤活性蛋白。2.蜈蚣抗肿瘤蛋白的鉴定本发明所提供的蜈蚣抗肿瘤蛋白，外观为白色粉末，经Lowry法检测蛋白质含量为97.5%。对该蛋白进行SDS-PAGE，分离胶浓度为12%、浓縮胶浓度为5%，以分子量在14.4-97.4kDa的混合标准蛋白作为对照，结果见图l，其中，Marker:蛋白质分子量标准；Sample:蜈蚣本发明中的抗肿瘤活性蛋白。由电泳图可见本发明所提供的蜈蚣活性蛋白在SDS-PAGE中显示单一条带，分子量为20kDa。3.蜈蚣蛋白的抗肿瘤活性采用MTT法，取培养45天，处在指数生长期的A549、Lovo、H印G-2、MCF-7癌细胞株，计数板计数后，用RPMI1640培养基稀释为34X104个/ml，取96孔平板种入癌细胞稀释液200iU，在37°C、5%C02培养箱中培养24h后，实验组加入用培养基配制并滤菌的抗肿瘤蛋白50ia，空白组和对照组加入培养基，空白组、对照组和实验组均设五个重复孔。继续培养24h后，每孔加入PBS配制的5mg/ml的MTT溶液20y1，再培养46h后，吸出上清液，每孔加DMS02001，震荡，用酶标仪检测570nm处的吸收值，计算各浓度的蜈蚣药液对各癌细胞的生长抑制率。生长抑制率(％)=100X-(加药孔A值-空白A值)/(对照孔A值-空白孔A值)X100%。图1为本发明SDS-PAGE图谱具体实施例方式1.蜈蚣抗肿瘤活性蛋白的制备取100条中药蜈蚣，洗净，烘干，研磨成粉末，首先将中药蜈蚣用乙醇去除脂类，离心，去上清，加入500ml的水低温浸泡，取上清，残渣继续用200ml的水低温浸泡，合并上清，离心，旋转浓縮，冻干成粉末。取蜈蚣水提液冻干粉2g，溶于10ml水中(浓度为200mg/ml)，加入硫酸铵使硫酸铵终浓度为80X，充分搅拌，4t:放置一个小时候，8000rpm离心25min，弃去上清，加入5ml蒸馏水溶解沉淀，然后置于HI7.6、20mM的Tris-HCL缓冲液透析24h，浓縮并冷冻干燥后既得蜈蚣粗蛋白。将蜈蚣粗蛋白用ra7.6、20mM的Tris-HCL缓冲液溶解后，上样于填装好的DEAE-s印hrosefastflow柱，梯度氯化钠缓冲液洗脱，得到数个不同浓度氯化钠缓冲液的洗脱组分。将收集的各洗脱液组分用ra7.6、20mM的Tris-HCL缓冲液透析，浓縮冻干后进行抗肿瘤活性测定，得到蜈蚣抗肿瘤粗蛋白。将蜈蚣抗肿瘤粗蛋白用含1.7M硫酸铵的HI7.6、20mM的Tris-HCL缓冲液溶解后，上样于填装好的Phenyl-S印haroseCL-4B柱中，梯度硫酸铵缓冲液洗脱，得到数个不同浓度硫酸铵缓冲液的洗脱组分。将各洗脱液组分透析、浓縮、冷冻干燥后测定抗肿瘤活性，第三个峰即为本发明所述的蜈蚣抗肿瘤活性蛋白。2.蜈蚣抗肿瘤蛋白对肿瘤细胞的抑制作用对该蛋白进行抗肿瘤活性测试，经MTT检测，蜈蚣抗肿瘤蛋白能很明显的抑制肿瘤细胞的生长，且量效关系显著，其结果如下蜈蚣抗肿瘤蛋白对人H印G-2肝癌细胞增殖的抑制作用蜈蚣蛋白(ug/ml)抑制率(％)10073.55051.12537.1512.519.186.256.97对人A549肺癌细胞增殖的抑制作用蜈蚣蛋白(ug/ml)抑制率(％)10088.245067.122549.2112.532.166.2515.43蜈蚣抗肿瘤蛋白对人MCF-7乳腺癌细胞增殖的抑制作用蜈蚣蛋白(ug/ml)抑制率(％)100715054.612534.8712.521.545<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>蜈蚣抗肿瘤蛋白对人Lovo大肠癌细胞增殖的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>从以上结果可以看出，蜈蚣抗肿瘤蛋白对于A549，Lovo，H印G-2，MCF-7等细胞株都有很强的抑制作用，且有明显的量效关系。权利要求一种蜈蚣抗肿瘤活性蛋白，其特征在于以中药蜈蚣为原材料提取的分子量为20KDa的活性蛋白。2.—种抗肿瘤蛋白的分离纯化方法，其特征在于采用离子交换色谱和疏水色谱两步色谱法分离纯化了抗肿瘤蛋白。3.根据权利要求1所述的蜈蚣抗肿瘤活性蛋白的应用，其特征在于抗肿瘤蛋白具有抗肿瘤作用，对人A549肺癌细胞，人Lovo大肠癌细胞，人H印G-2肝癌细胞，人MCF-7乳腺癌细胞的生长具有明显的抑制作用，可用于各种癌症的治疗及辅助治疗。全文摘要本发明是通过两步色谱技术从中药蜈蚣中提取出来的抗肿瘤活性蛋白，属于医药
技术领域：
。该抗肿瘤蛋白外观为白色粉末，SDS-PAGE显示为一条带，分子量为20kDa。本发明中的蛋白具有抗肿瘤活性，对多种肿瘤细胞，如人A549肺癌细胞，人Lovo大肠癌细胞，人HepG-2肝癌细胞，人MCF-7乳腺癌细胞的增殖和生长都具有很强的抑制作用，且呈现明显的量效关系，可用于各种癌症(肝癌、肺癌、乳腺癌等)的治疗及辅助治疗。文档编号A61K38/17GK101747423SQ20101010482公开日2010年6月23日申请日期2010年2月3日优先权日2010年2月3日发明者孔毅,惠晶,曹艳华,王泽根,邵妤申请人:中国药科大学