专利名称：玛咖咪唑生物碱在制备心血管药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及天然药物化学领域，具体而言，本发明涉及一种从天然植物玛咖(Lepidium meyenii Walper，还常见其同种异名称谓Lepidiumperuvianum Chacon sp.)中直接分离获得的咪唑生物碱在制备心血管药物中的应用。
背景技术：
心血管疾病是人类健康的第一杀手，其中包括高血压、心律失常、高血脂、冠心病等多种疾病形式，据世界卫生组织预测，至2020年，非传染性疾病将占我国死亡原因的79％，其中心血管病将占首位。高血压是最常见的心血管疾病，其患病率在全世界各国均最高，而且疾病人群有年轻化的趋势，我国高血压人群增加迅猛，因此，目前降血压药物的需求量不断增加，筛选新型高效的降血压药物也一直是心血管疾病药物研究的重点和热点。心律失常也是心血管疾病中非常常见的病症，通常用抗心律失常药物治疗，但目前多数抗心律失常化学药物作用机制单一、疗效个体差异大、容易产生毒副作用(损害内脏、头晕头痛、视力模糊等)，甚至引发新的心律失常症状，因此从天然植物中寻找疗效确切、副作用小的新型抗心律失常药物就成为心血管药物研究领域的一个重要组成部分。
玛咖是原产南美安第斯山区的药食两用植物，由于其营养成分丰富，并且具有多种保健功能(例如抗疲劳、增强免疫、抗贫血)，以及多种药用功效(例如提高生育力、改善性功能等)，联合国粮农组织FAO对其倍加推崇，推荐各国大量种植这种经济作物(文献余龙江，金文闻，李为等.南美植物玛咖的研究进展[J].中草药.2003，34(2)附7-9.)。玛咖在秘鲁有较大的种植面积，每年作为保健食品原料大量向各国出口，我国也开展了玛咖引种的工作并于近两年引种成功，在云南会泽、云南丽江、西藏林芝等地的种植规模得到不断扩大。2003年，Cui BL等人从植物玛咖中分离到两种玛咖咪唑生物碱Lepidiline A和Lepidiline B，通过体外实验发现这两种咪唑生物碱具有体外抗肿瘤活性(文献Cui BL，Zheng BL，He K，et al.Imidazole alkaloids from Lepidium meyenii[J].J Nat Prod.2003，66(8)1101-1103.)，并对该类化合物及其抗增殖性疾病(如抗肿瘤)方面的应用申请了专利保护(US 6878731 B2)。Cui BL等人制备玛咖咪唑生物碱是通过溶剂提取，回收溶剂后浸膏用酸性甲醇溶液溶解，静置沉淀后，上清液依次通过萃取、大孔吸附树脂层析、正相硅胶柱层析、酸性氧化铝柱层析、制备型高效液相色谱等，获得两种玛咖咪唑生物碱Lepidiline A和LepidilineB。该方法步骤较多，玛咖咪唑生物碱提取过程中损失较大，10千克的玛咖干粉最终只纯化到22毫克的Lepidiline A以及更少的Lepidiline B，该缺陷在一定程度上制约了玛咖咪唑生物碱的研发，尤其是其在活性筛选和药理方面的应用，致使目前玛咖咪唑生物碱的应用仅限于在肿瘤等增殖性疾病方面的治疗。
发明内容
本发明的目的是提供玛咖咪唑生物碱在制备心血管药物中的新应用。
本发明提供的一种玛咖咪唑生物碱的用途，其特征在于玛咖咪唑生物碱在制备心血管药物中的应用，玛咖咪唑生物碱活性成分全部或主要是通过具有下列化学结构式的化合物单独或混合构成
其中R1为H或CH3，R2为H或OCH3。
发明人所在的研究单位也开展了长达5年的玛咖咪唑生物碱研究，发现玛咖咪唑生物碱含量在玛咖干粉中含量比较高，种类也比较多，前人的方法尚有需要改进的地方，在通过科研解决了玛咖咪唑生物碱高效液相色谱分离和检测技术后，改进了提取分离方法，尽量减少分离步骤，并采用固相萃取法替代了制备型高效液相色谱技术，使设备要求和纯化成本降低，最终能大量、高效、低成本的从玛咖干粉中获得具有生物活性的玛咖咪唑生物碱组合物，并进一步由该组合物中分离纯化得到四种玛咖咪唑生物碱单体。
在对上述组合物及单体开展广泛的药物筛选研究中，发明人除了验证了这些物质的体外抗肿瘤活性，还首次发现了这些物质在降血压、抗心律失常方面的显著药用活性。因此通过该新工艺制备获得的玛咖咪唑生物碱不仅具有开发抗肿瘤药物的用途，而且可以预期作为治疗相应的心血管疾病的药物，由此完成本发明。
图1为玛咖咪唑生物碱对肾型高血压模型大鼠的降血压疗效，显示了玛咖咪唑生物碱组合物及其四种单体具有显著的降血压作用。
具体实施例方式 本发明制备了具有治疗心血管疾病(包括高血压、心律失常)和抗肿瘤应用潜力的玛咖咪唑生物碱组合物及其各玛咖咪唑生物碱单体，提及的玛咖咪唑生物碱可指具有如结构式一所示的化合物单体及其组合物
结构式一 其中根据R基的差别又分为四种玛咖咪唑生物碱单体，分别为 化合物1(R1＝H，R2＝H)，即LepidilineA，1，3-二苄基-4，5-二甲基咪唑氯化物； 化合物2(R1＝CH3，R2＝H)，即Lepidiline B，1，3-二苄基-2，4，5-三甲基咪唑氯化物； 化合物3(R1＝H，R2＝OCH3)，即Lepidiline C，3-苄基-1-(3-甲氧基苄基)-4，5-二甲基咪唑氯化物； 化合物4(R1＝CH3，R2＝OCH3)，即Lepidiline D，3-苄基-1-(3-甲氧基苄基)-2，4，5-三甲基咪唑氯化物。
而从以上的玛咖咪唑生物碱单体出发，通过成熟的合成方法又可以获得更多的类似物质，如在美国专利文献US 6878731 B2也提及可通过合成手段获得具有如结构式二所示结构特征的一些化合物单体
结构式二 其中R1可以为H或CH3，R2～R7可以为H、CH3、CH3O、OH、CHO、COOH、Cl、I、F、S、P、NO3、NO2、NH2，R2～R7可以相同，也可以不同。
本发明提及的从植物玛咖中直接获取玛咖咪唑生物碱组合物及其各玛咖咪唑生物碱单体的制备方法具体为 1)将干燥玛咖根粉碎至40～200目，将玛咖干粉置于中草药闪式提取器的不锈钢提取容器中，按照料液重量比为1∶8～1∶15加入有机溶剂，有机溶剂为质量百分比浓度为80％～100％的乙醇或质量百分比浓度为80％～100％的甲醇，或者含有体积分数0.5％盐酸的所述有机溶剂，在8000～20000转/分钟下提取2～5分钟，提取液用400目滤布抽滤后，将滤渣再按上法提取一次，将滤液合并，在50℃～60℃减压旋转蒸发下回收提取液，得到提取浸膏； 2)提取浸膏加入等体积的质量百分比浓度20％甲醇混合均匀，缓慢加入大孔吸附树脂柱中，填料为聚苯乙烯型弱极性大孔吸附树脂，依次用5～10倍柱体积的水、质量百分比浓度为10％甲醇、质量百分比浓度为40％～80％的甲醇、甲醇洗脱，收集第三洗脱组分，在50℃～60℃减压旋转蒸发回收溶剂，得到玛咖咪唑生物碱粗浸膏；其中40％～80％的甲醇中含有体积分数0.2％～0.8％的冰乙酸溶液； 3)将玛咖咪唑生物碱粗浸膏用氯仿溶解，再上正相柱层析，正相柱层析为中性氧化铝柱层析或正相硅胶柱层析，依次采用5～10倍柱体积的氯仿、氯仿∶甲醇(16∶1，v/v)、氯仿∶甲醇(9∶1，v/v)、氯仿∶甲醇(7∶3，v/v)、甲醇洗脱，收集第三、四洗脱组分，50℃～60℃减压旋转蒸发回收溶剂，浸膏用甲醇溶解后上C18反相硅胶柱进行层析，首先用5～10倍柱体积的水，然后再依次利用质量百分比浓度为10％甲醇、20％甲醇、40％甲醇、甲醇洗脱，收集第二、三、四洗脱组分中含有玛咖咪唑生物碱部分，合并后在50℃～60℃减压旋转蒸发回收溶剂，得到玛咖咪唑生物碱组合物(本发明中也简称为Lepidilines)，通过高效液相色谱检测，含有四种玛咖咪唑生物碱单体Lepidiline A～D，总玛咖咪唑生物碱纯度达到80％～90％； 4)玛咖咪唑生物碱组合物用甲醇溶解后，通过固相萃取柱进一步纯化，固相萃取柱填料可以为C18或C8硅胶填料，洗脱采用甲醇∶四氢呋喃∶20毫摩尔/升的乙酸铵溶液(19∶1∶80v/v)，通过高效液相色谱检测监控对四种玛咖咪唑生物碱分别进行收集合并，50℃～60℃减压旋转蒸发下回收溶剂后，依次采用丙酮、丙酮∶甲醇(9∶1v/v)、四氢呋喃、四氢呋喃∶石油醚(9∶1v/v)结晶，即可得到四种玛咖咪唑生物碱单体，其中2千克玛咖干粉可得到0.21～0.48克的Lepidiline A，0.10～0.29克的Lepidiline B，0.080～0.15克的Lepidiline C，0.030～0.065克的Lepidiline D，各单体纯度均达到95.0％～99.5％。
进一步说，本发明上述制备方法中用于检测及监控玛咖咪唑生物碱成分的高效液相色谱技术可采用下述方法实现 美国Agilent 1200高效液相色谱仪，配备G1314BVWD紫外可见检测器和Agilent LC系统化学工作站，流动相选用甲醇∶乙腈∶20毫摩尔/升的乙酸铵溶液(75∶5∶100v/v)，色谱柱选用250×4.6毫米的C18柱(粒径5μm)，柱温30℃，流速1.0毫升/分钟，检测波长258纳米，在保留时间7～13分钟之间依次出现分离良好的四种玛咖咪唑生物碱吸收峰，结构确认分别对应Lepidiline A～D。
本发明上述制备方法中所得的四种玛咖咪唑生物碱结构已经通过液质联用技术、核磁共振光谱、红外光谱、紫外光谱进行了确认。
本发明通过药理学实验筛选，发现上述玛咖咪唑生物碱组合物及其各单体均具有体外抗肿瘤活性。
本发明还发现上述玛咖咪唑生物碱组合物及其各单体在心血管疾病上的作用，包括显著的降血压和抗心律失常作用，这两项玛咖咪唑生物碱的药用活性增加了该类化合物的新用途，拓展了该类化合物的应用新领域，可供开发新型的心血管疾病药物。这是本发明的重要创新之一。
下面以一些实施例对本发明所述的玛咖咪唑生物碱组合物及其各单体的制备方法、结构鉴定、体外抗肿瘤实验、降血压及抗心律失常动物实验做进一步说明。实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。
实施例一 称取40目的干燥玛咖根粉1千克置于中草药闪式提取器的不锈钢提取容器中，加入15千克质量百分比浓度为100％的乙醇，在8000转/分钟下提取5分钟，通过400目滤布抽滤后将滤渣再提取一次，滤液合并回收提取液，将所得到提取浸膏加入等体积质量百分比浓度20％的甲醇充分溶解，加入HP20大孔吸附树脂柱中(70×5.5cm i.d.)，依次采用10倍柱体积水、5倍柱体积质量百分比浓度为10％的甲醇、10倍柱体积质量百分比浓度为40％的甲醇溶液洗脱(含有体积分数0.8％的冰乙酸)，收集第三洗脱组分在60℃下减压旋转蒸发回收溶剂，浸膏用氯仿溶解，再上正相硅胶柱层析(50×2.6cm i.d.，填料为200-300目柱层析用硅胶)，依次采用10倍柱体积氯仿、5倍柱体积氯仿∶甲醇(16∶1)、10倍柱体积氯仿∶甲醇(9∶1)、10倍柱体积氯仿∶甲醇(7∶3)、5倍柱体积甲醇洗脱，收集第三、四洗脱组分在50℃下减压旋转蒸发回收溶剂，浸膏用甲醇溶解上C18反相硅胶层析柱(40×1.6cm i.d.，填料为ODS-A球型硅胶，
孔径，粒径50μm)，依次用10倍柱体积水、10倍柱体积质量百分比浓度为10％的甲醇、10倍柱体积质量百分比浓度为20％的甲醇、5倍柱体积质量百分比浓度为40％的甲醇、5倍柱体积甲醇洗脱，采用高效液相色谱技术对玛咖咪唑生物碱进行监控，流动相选用甲醇∶乙腈∶20毫摩尔/升的乙酸铵溶液(75∶5∶100v/v)，色谱柱选用250×4.6毫米的C18柱(粒径5μm)，柱温30℃，流速1.0毫升/分钟，检测波长258纳米，收集第二、三、四洗脱组分中含有本发明中所述玛咖咪唑生物碱的部分，合并后在50℃下减压旋转蒸发回收溶剂，干燥得到玛咖咪唑生物碱组合物0.556克，为略带黄色的不定型粉末，通过高效液相色谱检测，采用面积归一化法计算，总玛咖咪唑生物碱纯度达到87.5％。
实施例二 精密称取实施例一中玛咖咪唑生物碱组合物(Lepidilines)0.2克用甲醇溶解，通过C18固相萃取柱对玛咖咪唑生物碱组合物进一步纯化(萃取柱为10g/60ml，填料为ODS-A不定型硅胶，
孔径，粒径40-60μm)，洗脱采用甲醇∶四氢呋喃∶20毫摩尔/升的乙酸铵溶液(19∶1∶80v/v)，采用高效液相色谱技术监控对四种玛咖咪唑生物碱进行收集，50℃下减压旋转蒸发回收溶剂后，通过结晶可得到四种玛咖咪唑生物碱单体，干燥后精密称重，Lepidiline A为0.0863克(纯度98.5％)，Lepidiline B为0.0402克(纯度98.2％)，0.0192克(纯度96.8％)，0.0117克(纯度95.6％)。对这四种单体进行显微观察并采用液质联用、核磁共振、红外光谱、紫外光谱对其结构进行鉴定，所得一些理化性质及重要的结构信息如下，根据这些信息可确认本发明所得四种单体化合物1～4分别对应玛咖咪唑生物碱Lepidiline A、Lepidiline B、Lepidiline C和Lepidiline D 1)Lepidiline A，分子式C19H21N2Cl，白色针状，碘化铋钾试剂显色阳性，熔点为236℃～240℃；UV(甲醇)λmax(logε)200(3.29)、258(2.24)、278(2.12)nm；红外光谱IR(KBr压片)vmax 3439，3030，2955，1632，1560，1453，1362，1219，1199，742，725，701cm-1；正模式ESI-MS m/z277[M-Cl]+、185[M-Cl-benzyl]+、91[benzyl]+；1H NMR(CD3OD∶D2O＝1∶3v/v，400MHz)δ8.69(1H，s，H-2)、δ7.22～7.35(6H，m，H-3’，H-4’，H-5’)、δ7.10～7.15(4H，dd，J＝7.6，1.2Hz，H-2’，H-6’)、δ5.18(4H，s，PhCH2N)、δ1.98(6H，s，CCH3-4/5)；13C NMR(CD3OD∶D2O＝1∶3v/v，400MHz)δ7.51(CH3，C-6，C-7)、δ47.31～48.60(CH2，PhCH2N)、δ127.55(CH，C-4’)、δ127.89(C，C-4，C-5)、δ128.81(CH，C-3’，C-5’)、δ129.21(CH，C-2’，C-6’)、δ133.40(C，C-1’)、δ133.97(CH，C-2)。
2)Lepidiline B，分子式C20H23N2Cl，白色片状，碘化铋钾试剂显色阳性，熔点为223℃～226℃；UV(甲醇)λmax(logε)201(3.31)、258(2.25)、278(2.11)nm；红外光谱IR(KBr压片)vmax 3437，3029，2955，2360，1648，1555，1454，1217，1195，740，725，700cm-1；正模式ESI-MS m/z291[M-Cl]+、199[M-Cl-benzyl]+、91[benzyl]+；1H NMR(CD3OD∶D2O＝1∶3v/v，400MHz)δ7.24～7.32(6H，m，H-3’，H-4’，H-5’)、δ6.99～6.98(4H，d，J＝6.8Hz，H-2’，H-6’)、δ5.26(4H，s，PhCH2N)、δ2.40(3H，s，CH3-2)、δ2.06(6H，s，CH3-4/5)；13C NMR(CD3OD∶D2O＝1∶3v/v，400MHz)δ7.69(CH3，C-7，C-8)、δ9.56(CH3，C-6)、δ47.28～48.58(CH2，PhCH2N)、δ125.99(CH，C-4’)、δ126.47(C，C-4，C-5)、δ128.34(CH，C-3’，C-5’)、δ129.17(CH，C-2’，C-6’)、δ133.81(C，C-1’)、δ143.17(CH，C-2)。
3)Lepidiline C，分子式C20H23N2OCl，白色柱状聚晶，碘化铋钾试剂显色阳性，熔点为225℃～228℃；UV(甲醇)λmax(logε)205(3.34)、275(2.27)、282(2.15)nm；红外光谱IR(KBr压片)vmax 3415，3030，2958，1633，1602，1560，1456，1352，1265，1209，1188，1036，836，793，745，730，703cm-1；正模式ESI-MS m/z307[M-Cl]+、215[M-Cl-benzyl]+、185[M-Cl-methoxybenzyl]+、91[benzyl]+、121[methoxybenzyl]+；1H NMR(CD3OD∶D2O＝1∶3v/v，400MHz)δ8.59(1H，s，H-2)、δ7.23～7.34(4H，m，H-3”，H-4”，H-5”，H-5’)、δ7.13～7.16(2H，dd，J＝7.6，2.2Hz，H-2”，H-6”)、δ6.86～6.88(1H，dd，J＝8.4，2.4Hz，H-4’)、δ6.72～6.74(1H，d，J＝7.6Hz，H-6’)、δ6.68(1H，s，H-2’)、δ5.21(2H，s，PhCH2N-3)、δ5.18(2H，s，PhCH2N-1)、δ3.66(3H，s，OCH3)、δ2.02(3H，s，CH3-4)、δ2.00(3H，s，CH3-5)；13C NMR(CD3OD∶D2O＝1∶3v/v，400MHz)δ7.48(CH3，C-7)、δ7.51(CH3，C-6)、δ47.32～48.61(CH2，PhCH2N)、δ55.29(CH3，OCH3)、δ113.07(CH，C-2’)、δ114.23(CH，C-4’)、δ120.07(CH，C-6’)、δ127.55(CH，C-4”)、δ127.99(C，C-4)、δ128.04(C，C-5)、δ128.85(CH，C-3”，C-5”)、δ129.24(CH，C-2”，C-6”)、δ130.58(CH，C-5’)、δ133.47(C，C-1”)、δ134.06(CH，C-2)、δ135.17(C，C-1’)、δ159.50(C，C-3’)。
4)Lepidiline D，分子式C21H25N2OCl，白色片状，碘化铋钾试剂显色阳性，熔点为211℃～214℃；UV(甲醇)λmax(logε)208(3.35)、274(2.27)、282(2.14)nm；红外光谱IR(KBr压片)vmax 3419，3030，2957，2367，1635，1604，1560，1456，1265，1213，1186，1038，832，793，742，733，703cm-1；正模式ESI-MS m/z321[M-Cl]+、229[M-Cl-benzyl]+、91[benzyl]+、199[M-Cl-methoxybenzyl]+、121[methoxybenzyl]+；1H NMR(CD3OD∶D2O＝1∶3v/v，400MHz)δ7.18～7.31(4H，m，H-3”，H-4”，H-5”，H-5’)、δ7.00～7.02(2H，d，J＝7.2Hz，H-2”，H-6”)、δ6.81～6.79(1H，dd，J＝8.0，2.2Hz，H-4’)、δ6.53～6.54(1H，d，J＝5.6Hz，H-6’)、δ6.51(1H，s，H-2’)、δ5.29(2H，s，PhCH2N-3)、δ5.27(2H，s，PhCH2N-1)、δ3.66(3H，s，OCH3)、δ2.48(3H，s，CH3-2)、δ2.13(3H，s，CH3-4)、δ2.08(3H，s，CH3-5)；13C NMR(CD3OD∶D2O＝1∶3v/v，400MHz)δ7.48(CH3，C-8)、δ7.51(CH3，C-7)、δ9.19(CH3，C-6)、δ46.98～48.25(CH2，PhCH2N)、δ54.45(CH3，OCH3)、δ111.84(CH，C-2’)、δ113.29(CH，C-4’)、δ117.70(CH，C-6’)、δ125.93(CH，C-4”)、δ126.57(C，C-4)、δ126.63(C，C-5)、δ128.24(CH，C-3”，C-5”)、δ129.07(CH，C-2”，C-6”)、δ130.27(CH，C-5’)、δ133.87(C，C-1”)、δ135.35(C，C-1’)、δ143.71(CH，C-2)、δ160.57(C，C-3’)。
实施例三 玛咖咪唑生物碱组合物及其四种单体的抗肿瘤作用 取实施例一和实施例二中的玛咖咪唑生物碱组合物和各种咪唑生物碱单体配制成1微克/毫升、10微克/毫升、20微克/毫升、40微克/毫升、80微克/毫升共5个浓度梯度的待测液，采用MTT法研究这些物质对人肺癌细胞NCI-H460、人肝癌细胞HepG-2、人膀胱癌细胞UMUC3、人胰腺癌细胞PACA2、人胸腺癌细胞MDA231以及人卵巢癌细胞FDIGROV的体外细胞毒性。取对数期肿瘤细胞制成细胞悬液(20000个/毫升)，接种于培养板内，每孔200微升，培养48小时后倒出培养液，加入20微升各种待测液(设空白对照)，培养24小时后再加入MTT溶液20微升，继续培养4小时，倒出培养液，加入200微升的DMSO，在酶标仪上测定各孔A值，检测波长为490纳米，通过检测结果计算出玛咖咪唑生物碱组合物和各种咪唑生物碱单体对不同肿瘤细胞增殖的半抑制率(IC50值)，所得IC50值如表1 表1玛咖咪唑生物碱对不同肿瘤细胞增殖的半抑制率
*注IC50＞10μg/ml时表明没有肿瘤细胞毒性或作用较弱；IC50＜4μg/ml时表明有显著细胞毒性，具有抗肿瘤药物开发潜力。
通过表1的试验结果，可以发现无论是玛咖咪唑生物碱组合物还是各单体，对多种肿瘤细胞的体外增殖活性均有抑制作用，如比较显著的是Lepidiline D、Lepidiline B对FDIGROV、MDA231、PACA2的细胞毒性，Lepidilines对FDIGROV的细胞毒性。实验结果显示通过本发明制备得到的天然植物成分，对多种人体肿瘤细胞具有体外细胞毒性，具备进一步开发抗肿瘤药物的潜力。
实施例四 称取200目的干燥玛咖根粉2千克置于中草药闪式提取器的不锈钢提取容器中，加入16千克的质量百分比浓度为80％的甲醇(含体积分数0.5％的盐酸)，采用中草药闪式提取器在20000转/分钟下提取2分钟，抽滤后将滤渣再提取一次，按实施例一操作将所得浸膏上HP20柱，依次用10倍柱体积水、10倍柱体积质量百分比浓度为10％的甲醇、8倍柱体积质量百分比浓度为60％的甲醇溶液(含体积分数0.2％的冰乙酸)洗脱，收集第三洗脱组分在50℃下减压旋转蒸发回收溶剂，浸膏用氯仿溶解，再上中性氧化铝柱层析(50×2.6cm i.d.，填料为200-300目层析用中性氧化铝粉末)，其余操作同实施例一，得到玛咖咪唑生物碱组合物1.010克，总玛咖咪唑生物碱纯度达到90.0％。取0.2克玛咖咪唑生物碱组合物粉末按照实施例二操作进一步纯化和结晶，其中固相萃取柱选用硅胶上键合辛烷的Cctyl(C8)填料，
孔径，45微米粒径，洗脱采用甲醇∶四氢呋喃∶20毫摩尔/升的乙酸铵溶液(19∶1∶80v/v)，通过收集玛咖咪唑生物碱单体成分、60℃下减压旋转蒸发回收溶剂并结晶、干燥后收获Lepidiline A为0.0568克(纯度99.5％)，Lepidiline B为0.0574克(纯度98.7％)，0.0297克(纯度97.2％)，0.0089克(纯度96.3％)。
实施例五 玛咖咪唑生物碱组合物及其四种单体的降血压作用 按实施例四制备玛咖咪唑生物碱组合物和四种咪唑生物碱单体适量，分别用生理盐水溶液配制成1.5毫克/毫升待测液，另配卡托普利(常用的降血压药物)溶液0.5毫克/毫升作为阳性对照，生理盐水作为空白。
取雄性Wister大鼠120只(220～250克)，注射戊巴比妥钠(50毫克/千克)，麻醉后手术结扎左肾动脉，选取两周后血压(收缩压)升高到150毫米汞柱的大鼠用于试验，共选84只，分为7组，每组12只，以2毫升/100克的容量灌胃，连续14天，采用大鼠尾压心率测定仪观察给药期间各组大鼠的血压变化。停止给药以后，继续观察各组大鼠的血压变化(收缩压)7天。记录结果见表2和图1 表2玛咖咪唑生物碱对肾型高血压大鼠降血压效果的影响(X±SD，n＝10)
图1玛咖咪唑生物碱对肾型高血压模型大鼠的降血压疗效 与空白组相比，给药7天、14天记录到各玛咖咪唑生物碱组均能极显著降低肾型高血压大鼠的血压(p＜0.01)，尤其是Lepidiline D组，其降血压效果与阳性对照卡托普利组作用相当，而且停药后7天血压反弹还弱于卡托普利组，Lepidilines组也有同样的血压反弹不明显的现象。这说明本发明提供的玛咖咪唑生物碱组合物及其单体的降血压效果确切，而且在停药血压反弹方面的副作用更小一些，具有开发优良降血压药物的用途。
实施例六 玛咖咪唑生物碱组合物及其四种单体的抗心律失常作用 按实施例四制备玛咖咪唑生物碱组合物和四种咪唑生物碱单体适量，分别用生理盐水溶液配制成五种1.5毫克/毫升待测液，另配0.7毫克/毫升奎尼丁(常用的抗心律失常药物)溶液作为阳性对照，生理盐水作为空白。取Wister大鼠84只(雌雄各半，220～250克)，分为7组，每组12只(雌雄各半)，以2毫升/100克的容量灌胃，连续5天，最后一次灌胃给药后30分钟，用1.2克/千克的乌拉坦麻醉大鼠并仰位固定，用BL-420F生物机能实验系统观察并记录II导ECG。5秒内静脉注射乌头碱30微克/千克体重(乌头碱配制成10微克/毫升)，记录35分钟内室性早搏(早搏)、室性心动过速(室速)、心室纤颤(室颤)、心脏停搏(停搏)的出现时间。记录结果见表3 表3玛咖咪唑生物碱对乌头碱引发心律失常的影响(X±SD，n＝10)
含有玛咖咪唑生物碱的各种待测液与对照组相比，均能显著延长大鼠室性早搏、室性心动过速等各类心律失常症状的出现时间(P＜0.01)，其中以Lepidiline B和Lepidiline D的作用最为显著，Lepidiline D与奎尼丁阳性对照组作用相当。可见本发明中制备获得的玛咖咪唑生物碱具有良好的抗乌头碱诱发的心律失常症状，可预期开发医药产品用于治疗心律失常疾病。
实施例七 玛咖咪唑生物碱组合物降血压和抗心律失常的剂量关系 按实施例四制备玛咖咪唑生物碱组合物适量，配制成1.5毫克/毫升、0.5毫克/毫升、0.15毫克/毫升高、中、低三个剂量组，按照实施例五、六的药理试验方法研究不同剂量的玛咖咪唑生物碱组合物对大鼠高血压、心律失常的治疗作用。结果见表4、5 表4玛咖咪唑生物碱组合物降血压的量效关系(X±SD，n＝10)
通过表4可见不同剂量的Lepidilines对高血压大鼠均有一定的降血压效果，同时存在明显的剂量效应，高剂量组的Lepidilines(灌胃量相同，浓度最高)在给药第7天和14天的数据分析表明具有极显著的降血压效果(p＜0.01)，中剂量组的Lepidilines也具有显著降血压效果(0.05＜p＜0.01)，低剂量组的Lepidilines则仅从数据上看有较弱的降血压作用，但效果不显著(p＞0.05)。因此在降血压药物设计中足够剂量的玛咖咪唑生物碱对药效的发挥是重要的，但也并不表示低剂量的玛咖咪唑生物碱不能应用于降血压药物。
表5玛咖咪唑生物碱组合物抗心律失常的量效关系(X±SD，n＝10)
通过表5可见不同剂量的Lepidilines对乌头碱诱发的心律失常症状出现均较为显著的延迟作用，其中三种剂量对早搏、室速症状的延迟均有显著疗效，中剂量组对停搏症状有一定作用，但效果不显著，低剂量组对室颤、停搏影响不显著。可见玛咖咪唑生物碱在抗心律失常病症上也表现出剂量关系，而且低剂量的玛咖咪唑生物碱组合物在抗心律失常方面也具有一定疗效。
使用本发明中所述玛咖咪唑生物碱组合物治疗心血管疾病时，可制成胶囊或片剂，服用前3天，成人每人每日30毫克，可分3次饭后服用，之后可视疗效增大服用量到成人每人每日120毫克。
为了确保长期用药的安全性，本发明按国家医药食品监督管理局、国家I类新药慢性毒性试验标准，对本发明中所述玛咖咪唑生物碱组合物进行安全性综合评价。玛咖咪唑生物碱组合物按临床用量的10、50、100倍的不同剂量给大鼠连续灌胃3个月、6个月及7个月恢复期对大鼠体重改变、进食情况以及行为活动等无显著影响，对大鼠的血液学、血液生化学及心电图等各项指标亦无明显的不利影响，22种脏器与组织的病理组织学观察与空白对照比较均未见异常。结果表明，玛咖咪唑生物碱组合物长期大剂量口服用药，对动物无明显损害，未发现因蓄积而对机体产生的毒性反应，是一种安全可靠的药物。
权利要求
1.一种玛咖咪唑生物碱的用途，其特征在于玛咖咪唑生物碱在制备心血管药物中的应用，玛咖咪唑生物碱的活性成分全部或主要是通过具有下列化学结构式的化合物单独或混合构成
其中R1为H或CH3，R2为H或OCH3。
2.权利要求1中所述的玛咖咪唑生物碱的用途，其特征在于玛咖咪唑生物碱的活性成分全部或主要是通过具有下列化学结构式的化合物单独或混合构成
其中R1为H或CH3，R2～R7为H、CH3、CH3O、OH、CHO、COOH、Cl、I、F、S、P、NO3、NO2或NH2，R2～R7相同或不同。
3.权利要求1或2中所述的玛咖咪唑生物碱的用途，其特征在于玛咖咪唑生物碱在制备抗心律失常药物中的应用。
4.权利要求1或2中所述的玛咖咪唑生物碱的用途，其特征在于玛咖咪唑生物碱在制备降血压药物中的应用。
5.权利要求1中所述的玛咖咪唑生物碱的用途，其特征在于玛咖咪唑生物碱从天然植物玛咖(Lepidium meyenii Walper，还常见其同种异名称谓Lepidium peruvianum Chacon sp.)中分离获得，其过程为
第1步将干燥玛咖根粉碎至40～200目，将玛咖干粉置于中草药闪式提取器的不锈钢提取容器中，按照料液重量比为1∶8～1∶15加入有机溶剂，有机溶剂为质量百分比浓度为80％～100％的乙醇或质量百分比浓度为80％～100％的甲醇，或者含有体积分数0.5％盐酸的所述有机溶剂，在8000～20000转/分钟下提取2～5分钟，提取液用400目滤布抽滤后，将滤渣再按上法提取一次，将滤液合并，在50℃～60℃减压旋转蒸发下回收提取液，得到提取浸膏；
第2步提取浸膏加入等体积的质量百分比浓度20％甲醇混合均匀，缓慢加入大孔吸附树脂柱中，填料为聚苯乙烯型弱极性大孔吸附树脂，依次用5～10倍柱体积的水、质量百分比浓度为10％甲醇、质量百分比浓度为40％～80％的甲醇、甲醇洗脱，收集第三洗脱组分，在50℃～60℃减压旋转蒸发回收溶剂，得到玛咖咪唑生物碱粗浸膏；其中40％～80％的甲醇中含有体积分数0.2％～0.8％的冰乙酸溶液；
第3步将玛咖咪唑生物碱粗浸膏用氯仿溶解，再上正相柱层析，正相柱层析为中性氧化铝柱层析或正相硅胶柱层析，依次采用5～10倍柱体积的氯仿、氯仿∶甲醇(16∶1，v/v)、氯仿∶甲醇(9∶1，v/v)、氯仿∶甲醇(7∶3，v/v)、甲醇洗脱，收集第三、四洗脱组分，50℃～60℃减压旋转蒸发回收溶剂，浸膏用甲醇溶解后上C18反相硅胶柱进行层析，首先用5～10倍柱体积的水，然后再依次利用质量百分比浓度为10％甲醇、20％甲醇、40％甲醇、甲醇洗脱，收集第二、三、四洗脱组分中含有玛咖咪唑生物碱部分，合并后在50℃～60℃减压旋转蒸发回收溶剂，得到玛咖咪唑生物碱组合物，通过高效液相色谱检测，含有权利要求1中所述全部四种玛咖咪唑生物碱单体；
第4步玛咖咪唑生物碱组合物用甲醇溶解后，通过固相萃取柱进一步纯化，固相萃取柱填料为C18或C8硅胶填料，洗脱采用甲醇∶四氢呋喃∶20毫摩尔/升的乙酸铵溶液(19∶1∶80v/v)，按照第3步的高效液相色谱检测监控方式对四种玛咖咪唑生物碱分别进行收集合并，50℃～60℃减压旋转蒸发下回收溶剂后，依次采用丙酮、丙酮∶甲醇(9∶1v/v)、四氢呋喃、四氢呋喃∶石油醚(9∶1v/v)结晶，即得到四种玛咖咪唑生物碱单体。
全文摘要
本发明公开了一种玛咖咪唑生物碱的用途，它在制备心血管药物中的应用，其成分全部或主要是通过具有下列化学结构式的化合物单独或混合构成，如式(I)，其中R1可以为H或CH3，R2为H或OCH3。本发明首次发现了这些物质在降血压、抗心律失常方面的显著药用活性。因此通过本发明所述的新工艺制备获得的玛咖咪唑生物碱不仅具有开发抗肿瘤药物的用途，而且可以预期作为治疗相应的心血管疾病的药物。式(I)
文档编号A61K31/4164GK101756965SQ20101010462
公开日2010年6月30日 申请日期2010年1月29日 优先权日2010年1月29日
发明者金文闻, 余龙江, 敖明章 申请人:华中科技大学