专利名称：蜈蚣毒素抗肿瘤活性多肽的制作方法
技术领域：
本发明属生物化学中的多肽药物技术领域。
背景技术：
蜈蚣为节肢动物门唇足纲整形目蜈蚣科动物，蜈蚣药用在中国已有2000多年的 历史，始载于《神农本草经》，具有熄风止痉、解毒散结、通络止痛的作用，主治中风、惊痫、破 伤风、百日咳、结核、烫伤、疮疡肿毒等。现在药理研究，蜈蚣还具有抗肿瘤作用、止痉作用、 抗真菌和治疗糖尿病的作用。蜈蚣的分布范围虽广，但对蜈蚣毒的研究远远落后于蛇、蝎等其它有毒动物的毒 液，有关蜈蚣毒素方面的报道也较少。蜈蚣毒素中包含5-羟色胺，组胺，酸性和碱性磷酸 酶，心脏毒蛋白以及神经递质释放物等物质。据报道蜈蚣全虫水提物具有明显抑瘤活性。但 迄今为止，对蜈蚣抑瘤成分的研究多停留在蜈蚣粗提物的水平，对蜈蚣中的单一组分的研 究较少。原发肿瘤的生长和转移都依赖于既存血管的新生血管生成，越来越多的研究证明 血管生成对实体瘤的生长和转移至关重要，肿瘤转移前血管生成明显增强，其血管生成的 增强程度和肿瘤转移能力呈正相关，这表明肿瘤组织必须从宿主中获取营养才能在局部生 长.因此阻断肿瘤血管生成，切断肿瘤组织获得营养途径已经成为新的抗肿瘤治疗靶点， 而且也成为抗肿瘤治疗中热门的研究内容.大量实验已证实，许多肽类可影响血管生成的开关，使其激活开放或抑制关闭，这 些多肽称为血管生成调节因子，并可分为血管生成因子和血管生成抑制因子两类.正常情 况下二者平衡，血管处于静止状态，在肿瘤细胞恶性转化过程中，因微环境改变，则启动肿 瘤细胞的血管生成开关，激活血管生成因子，促使内皮细胞迁移，增殖，形成血管芽及微血 管，同时亦激活基质金属蛋白酶活性，使细胞外基质降解利于血管形成，伸延及肿瘤生长， 浸润和转移.一些具有抗肿瘤活性的多肽就是通过抑制血管内皮细胞生长从而抑制肿瘤生长 的。本发明基于上述研究，从蜈蚣毒素中分离纯化出一个由十二个氨基酸组成的多 肽，通过测定其对人脐静脉内皮细胞的作用来确定其抗肿瘤活性。
发明内容
本发明涉及一种对人脐静脉内皮细胞有抑制作用，从而抗肿瘤的多肽，该多肽 是蜈蚣毒素来源的，用电刺激法取得蜈蚣毒素，冻干后溶于PBS溶液中，用超滤管超滤、 RP-HPLC分离纯化后得峰7，命名为re-12。本发明所提供的蜈蚣毒素抗肿瘤多肽是利用Edman降解法测得其氨基酸序列的， 序列为 Phe-Thr-Gly-Gly-Asp-Glu-Ser-Arg-Ile-Gln-Glu-Gly。本发明所提供的蜈蚣毒素抗肿瘤多肽，经质谱测定其分子量为1296Da。
本发明所提供的多肽，经测试具有抗肿瘤活性在给药剂量为2.25X10_8mol/L到 2. 80X10_9mol/L范围内可抑制人脐静脉内皮细胞的生长，且呈现量效关系。
具体实施例方式1.蜈蚣毒素抗肿瘤活性多肽的制备a.取1000条蜈蚣，产地安徽滁州，用电刺激法取毒，冻干。称取0.4g蜈蚣毒素，溶 于 20ml PBS 溶液中，10000r/min 离心 5min。b.上述溶液用IOOOODa超滤管超滤，7000r/min离心15min。c.收集滤过液，用C18-HPLC柱分离纯化，柱高25cm，直径0. 46cm。用5%乙腈(含0.05% TFA) 20ml平衡后，500μ 1滤过液上样，先用5%乙睛(含 0. 05% TFA) 20ml洗脱，然后用95%乙腈(含0.05% TFA) 30ml进行0-60%梯度洗脱，流速 为lml/min，收集活性峰7，冷冻干燥。下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的 本发明发明范围。
图1为经RP-HPLC分离纯化的色谱图活性峰为峰7，命名为TO-122.蜈蚣毒素抗肿瘤多肽的测序本发明所提供的蜈蚣毒素抗肿瘤多肽用Edman降解法进行测序。Eadam降解法是一种对蛋白质进行测序的化学方法，是从多肽链游离的N末端测 定氨基酸残基序列的过程。N末端氨基酸残基被苯异硫氰酸酯修饰，然后从多肽链上切下修饰的残基，再经层 析鉴定，余下的多肽链(少了一个残基)被回收再进行下一轮降解循环。Edman降解测序主要涉及耦联、水解、萃取和转换等4个过程。首先使用苯异硫氰 酸酯(PITC)在PH9.0的碱性条件下对蛋白质或多肽进行处理，PITC与肽链的N-端的氨基 酸残基反应，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物，即PTC-肽。然后PTC-肽用三氟乙酸处理， N-端氨基酸残基肽键被有选择地切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接下 来将该衍生物用氯丁烷从反应液中萃取出来，而去掉了一个N-端氨基酸残基的肽仍留在 溶液中。萃取出来的噻唑啉酮苯胺衍生物不稳定，经酸作用，再进一步环化，形成一个稳定 的苯乙内酰硫脲(PTH)衍生物，即PTH-氨基酸。留在溶液中的减少了一个氨基酸残基的肽 再重复进行上述反应过程。整个测序过程现在都是通过测序仪自动进行。每一循环都获得一个PTH-氨基酸， 经HPLC可以鉴定出是那一种氨基酸。本发明所提供的多肽经Edman降解法测序，序列为Phe-Thr-Gly-Gly-Asp-Glu-Se r—Arg-IIe-Gln-Glu-Glyο3.蜈蚣毒素抗肿瘤多肽对肿瘤细胞的抑制作用a.细胞培养人脐静脉内皮细胞用含10%小牛血清(FCS)、100U/ml青霉素及100U/ml链霉素的 DMEM培养基，在37°C、5% CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养，2 3天传代1次，取对数生 长期细胞用于实验。b. MTT比色法测定蜈蚣毒素抗肿瘤多肽对人脐静脉内皮细胞增殖的影响
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取对数生长期细胞，以每空1 X IO4个细胞接种于96孔培养板中，每孔加入细胞悬 液180 μ 1，在细胞培养箱中培养4h，待细胞贴壁后加入20 μ 1不同浓度的肽，使其终浓度 分别为 2. 25 X IO"8,1. 52 X IO"8,1. 12 X IO"8, 5. 60 X IO"9, 2. 80 X 1(Γ9Μ，负对照组加入相同体 积PBS，每组设3个副孔，分别处理48h。培养结束前4h于96孔培养板中每孔吸出培养基 120 μ 1，并加入5g/L的MTT液20 μ 1，置培养箱中继续培养4h后轻轻吸去培养基，然后每孔 加入DMSO 150 μ 1，震荡IOmin使紫蓝色沉淀充分溶解；用酶标仪570nm和630nm双波长测 定吸光度(A值)。对该多肽进行抗肿瘤活性测试，经MTT检测，蜈蚣毒素抗肿瘤多肽能抑制人脐静 脉内皮细胞的生长，且呈量效关系，其结果如下蜈蚣毒素抗肿瘤多肽对人脐静脉内皮细胞的抑制作用 从以上结果可以看出，蜈蚣毒素抗肿瘤多肽对于人脐静脉内皮细胞有抑制作用， 且有量效关系。
权利要求
一种蜈蚣毒素抗肿瘤多肽，其特征在于以蜈蚣毒素为原材料提取，由Phe Thr Gly Gly Asp Glu Ser Arg Ile Gln Glu Gly组成的十二肽，分子量为1296.05Da。
2.根据权利要求1所述抗蜈蚣毒素肿瘤多肽的应用，其特征在于该多肽具有抗肿瘤作 用，对人脐静脉内皮细胞的增殖和生长具抑制作用，可作为在制备抗肿瘤药中的应用。
全文摘要
本发明公布从蜈蚣毒素中分离出的多肽，并对其抗肿瘤活性进行测定。应用超滤及反相色谱等分离方法从蜈蚣毒素中分离纯化出一个由十二个氨基酸组成的多肽，应用Edman降解法测得其序列为Phe-Thr-Gly-Gly-Asp-Glu-Ser-Arg-Ile-Gln-Glu-Gly，质谱法测得分子量为1296.05Da。并用MTT法测定该多肽的抗癌细胞活性。本发明中的多肽具有抗肿瘤活性，对人脐静脉内皮细胞的增殖和生长都具有抑制作用，且呈现量效关系，可用于各种癌症的治疗及辅助治疗。
文档编号A61P35/00GK101899095SQ20101010480
公开日2010年12月1日 申请日期2010年2月3日 优先权日2010年2月3日
发明者孔毅, 惠晶, 曹艳华, 杨天雨, 赖伊丽, 邵妤 申请人:中国药科大学