专利名称：基于四醚脂质的蛋白或核酸药物脂质体制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物大分子药物技术领域的药物制剂及其制备方法，具体是
一种基于四醚脂质的蛋白或核酸药物脂质体制剂及其制备方法。
背景技术：
生物大分子药物如蛋白，核酸等的口服给药效果很不理想，其原因之一在于多肽及核酸等分子在胃肠道不稳定，很容易被胃肠道的酸性环境，表面活性剂，以及各种蛋白酶所降解。为了避免多肽或核酸药物遭受胃肠中苛刻环境的影响，研究人员选择适宜的载体来保护这些疫苗或多肽药物。脂质体制剂由于生物相容性好，而且大小、表面电荷以及膜流动性可控，作为口服载体的研究备受关注。 经过对现有技术的检索，如Kisel等人的论文《PE脂质体作为胰岛素口服制剂载体的研究》(Int J Pharm 2001 ;216(1-2) :105-14。)中公开了以酯键构成的磷脂制备得到的普通脂质体，能够装载抗原或多肽药物，并对它们具有一定保护作用。又如Lasic DD在综述论文《脂质体的新应用》Trends in Biotechnology (1998 ; 16 (7) :307-21。)中也公开了普通脂质体作为疫苗口服输送载体的应用，但仍然面临的主要障碍之一就是普通磷脂脂质体在肠道中胆汁盐的影响下极不稳定。因此，现阶段急需一种更加稳定的载体系统以保护这些生物活性药物。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种基于四醚脂质的蛋白或核酸药物脂质体制剂及其制备方法，由四醚脂质为主要脂质成分，制备脂质体，其外膜由多个具有单分子层跨度的醚脂分子组成，内部包裹生物大分子药物，如多肽，蛋白，和核酸分子等。
本发明是通过以下技术方案实现的 本发明涉及一种基于四醚脂质的蛋白或核酸药物脂质体制剂，其粒径大小在0. l-10微米之间，该脂质体膜包括四醚脂质的单分子层，其中四醚脂质占总脂质质量的50-100 % ，蛋白或核酸药物溶解在脂质体膜内部的水溶液相中。 本发明涉及上述基于四醚脂质的蛋白或核酸药物脂质体制剂的制备方法，以四醚脂质为原料与含有蛋白或核酸药物的水性缓冲溶液水合，反复冻融并经带孔薄膜挤出，制得包裹蛋白药物的四醚脂质体。 所述的以四醚脂质为原料是指将古细菌菌液经低温萃取并纯化后制备获得四醚脂质； 所述的古细菌(Archaea)又称古菌、太古菌或太古生物，是一类生活在类远古生态环境中的微生物。 所述的含有蛋白或核酸药物的水性缓冲溶液，是通过物理包封的方法被包含在四醚脂质体的内水相中，其中的蛋白药物和核酸药物浓度，可根据具体药物的有效浓度决定。
所述的反复冻融并经带孔薄膜挤出，是指在-70 3(TC下反复冻融3-10次，并
3经lOOnm-lOOOnm孔径的薄膜挤出。 本发明提出基于四醚脂质的应用方法可以作为各种多肽，蛋白，寡核苷酸，基因等药物的口服载体，保护其在胃肠道的稳定性，提高生物利用度和药效。由于其中的蛋白和基因药物是通过物理包封的形式被包含在四醚脂质体内水相中的，所以其具体结构和功能的变化不影响本发明的执行，本发明可以普遍适用于各种不同结构不同适应症的蛋白和基因药物，其中蛋白药物包括但不限定为胰岛素，人白细胞集落生长因子，红细胞生成素，人生长因子，降钙素，艾赛纳肽，肠肽激素，胸腺肽，蛋白疫苗抗原包括但不限定为肝炎病毒抗原，疱疹病毒抗原，人乳头状病毒抗原，天花病毒抗原，爱滋病毒抗原，肿瘤相关抗原，核酸药物包括但不限定为各种基因的质粒，带有各种基因序列的寡核苷酸分子及其化学修饰结构。
图1为实施例四醚脂质结构图。 图2为实施例四醚脂质体的原子力显微镜示意图。 图3为实施例血糖时间变化图。 图4为实施例四醚脂质体的稳定性示意图。 图5为实施例IgG抗体时间变化图。
具体实施例方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 实施例1 古细菌的培养和四醚脂质的提取和纯化 将古细菌S. acidocaldarius接种在的ATCC1733培养液中，pH 2.5，置于65t:细菌培养箱内，通过紫外分光光度计分别在420nm和540nm监控古细菌的生长情况，当古细菌生长至对数期时，通过离心收集(8800rpm， 10min)，收集的菌液在-70 3(TC下反复冻融3次为四醚脂质的提取备用。
将提取的脂质以氯仿甲醇水=i : 2 : o. 8混悬12hr后，加入适量氯仿至混
悬液中使氯仿甲醇水的比例调至为2 : 2 : O. 8，继续混悬12h后通过离心(1800rpm，6min)得到含有脂质的有机相，经过过滤去除杂质后用甲醇水(1 : l)超声溶解后上样
于预先制备好的反相ci8柱(3xi0cm);接着依次以甲醇水=i : i，氯仿甲醇水=o. 8 : 2 : o. 8以及氯仿甲醇水=65 : 25 : 4洗脱；最终收集、浓縮氯仿甲醇水
=0. 8 : 2 : 0. 8洗脱的下来的样品；浓縮液进一步通过TLC硅胶板纯化(20X20cm)，以
氯仿甲醇水=65 : 25 : 4作为展开剂，刮下Rf " o. 2处的硅胶带；以氯仿甲醇
水=1 : 2 : 0.8的溶液把含有PLFE的脂质从硅胶洗脱下来，并浓縮。最后以冷甲醇沉淀PLFE三次。 如图l所示，为本实施例制备所得，其中图1A为glycerol dialkyl calditoltetraether (GDNT)禾口 (B) glycerol dialkyl glycerol tetraether (GDGT) 。 Rl代表肌醇磷
4酸，R2代表13 -D-半乳糖-13 -D-吡喃葡萄糖，R3代表13 -D-吡喃葡萄糖。 实施例2 空白四醚脂质体的制备 取PLFE的储备液适量，加入50mL梨形瓶中，再加入6mL氯仿/甲醇(2 : 1)混合均匀，真空泵抽真空之压力达到0. lMpa，水温设为50°C， 120rpm，旋转蒸发60min，在瓶壁形成均匀透明的脂膜，充氮气使氯仿和甲醇充分挥干。按照适量的脂质浓度在梨形瓶中加入PBS水溶液水合，超声得到的脂质体通过Zetasizer 3000HS激光衍射粒度分析仪(PCS)测定粒径分布、平均粒径以及Zeta电位。结果表明空白四醚脂质体粒径大小为235. 6±12. 3nm，分布均匀，多聚分布系数(polyindex) < 0. 3 ;表面电荷约_35. lmV。
四醚脂质体的稳定性分析 以PLFE为脂质原料，以含有钙黄绿素(80mM)的缓冲盐溶液水合制备的脂质体粒径为230nm左右。以含胆汁盐的溶液(pH 6. 2)模拟肠道环境。试验时，lyL脂质体加入到装有1. 5mL的反应缓冲液的荧光管中，37t:下不断搅拌反应，并于2min，20min，60min和90min取出荧光管置于荧光分光光度计下检测钙黄绿素的荧光信号，以确定从脂质体释放的钙黄绿素。反应结束后，向反应管中加入10% (W/V)的OBG(octyl-P-D-glucopyranoside) 60 ii L并于37t:下孵育30min完全裂解脂质体，测定包裹在脂质体内部所有钙黄绿素的荧光。最后计算每个时间点释放的钙黄绿素的百分比。 稳定结果表明，普通脂质体是极不稳定的，仅在反应初2min，几乎释放出所有包裹的钙黄绿素；而稳定性明显的提高来自粒径大小相当的四醚脂质体，在同样的条件下反应90min内释放不足30X的钙黄绿素，横坐标为口服后的时间(小时)；纵坐标为血糖水平百分比(％)，如图2所示。
实施例3 胰岛素四醚脂质体制剂的口服给药效果 PLFE为脂质原料，以含有胰岛素(insulin, 17. 5IU/mL)的PBS水溶液水合，制得包含蛋白药物的四醚脂质体，其的粒径大小为268. 9±4. 8nm，分布均匀，polyindex < 0. 5，包封率为20%左右。取糖尿病模型小鼠20只，禁食12h，随机分成4组第一组灌胃给予溶于磷酸盐缓冲液的胰岛素溶液(insulin, ig);第二组腹腔注射胰岛素溶液(insulin, ip);第三组灌胃给予普通脂质体包裹的胰岛素溶液(Conventional liposomes, ig);第四组灌胃给予四醚脂质体包裹的胰岛素溶液(Archaeosomes，ig) 。 口服和腹腔注射的胰岛素浓度分别为350IU/Kg和50IU/Kg。分别在0、 1、2、4、6、8和12h，于小鼠眼底静脉丛取血0。 lmL，离心，取20ii L血清，以零时为100%，计算各时间点血糖的百分率。 糖尿病小鼠通过口服途径给药后的血糖随时间的变化情况如图4所示，横坐标为孵育时间(分钟)；纵坐标为包裹的荧光分子的百分比(％)。 结果表明口服装载胰岛素的四醚脂质体可以使糖尿病小鼠在口服后4小时内维持20%以上的降血糖作用，以及在口服后的1小时到4小时达到最大降血糖效果(约为28% )。而普通脂质体载体系统和胰岛素溶液系统，口服后却没有明显的降糖效果。
实施例4 疫苗抗原OVA的四醚脂质体制剂的口服免疫效果 PLFE为脂质原料，以含有卵清白蛋白(OVA， 4mg/mL)的PBS水溶液水合，制得包括
5蛋白抗原的四醚脂质体，再经-70 3(TC下反复冻融3次，平均粒径约可达500nm以上。用装载OVA的四醚脂质体免疫小鼠，免疫时间分别为0、2和28天各一次，免疫剂量为8mg。免疫后每周眼眶后静脉丛取血，存样。另外，初次免疫后第6周，切除从十二指肠顶端到回肠末端约15cm的小肠部分，去除肠系膜，用灌肠洗脱液清洗。通过ELISA来定量测量血浆中IgG或者肠灌洗收集液中IgA的量。口服四醚脂质体包裹OVA的疫苗，血浆中产生了明显(p<0。 01)的0VA特异性的IgG抗体，如图5中的a、b、c所示，横坐标为口服后的时间(天数)；纵坐标为是每个样测定的IgG抗体水平与在第O天的抗体水平的比例。同时，小鼠肠道洗脱液中测得的OVA特异性的IgA抗体水平也比普通脂质体作为载体产生的水平明显提高(P < 0。 05)，如图3、4所示。
实施例5 : CpG序列分子的四醚脂质体制剂的稳定性 将CpG序列分子TCCATGACGTTCCTGACGTT混合protamine分子包裹在四醚脂质体中，得到包裹效率超过80%的载体制剂，在模拟肠道环境的缓冲液中放置120分钟，凝胶色谱分析其稳定性，可以看到70%以上的寡核苷酸分子没有被降解。而对照的普通脂质体制剂则已经没有任何检测得到的寡核苷酸分子了。 上述实施例成功的从古细菌S. acidocaldarius中提取四醚脂质(PLFE)以制备四醚脂质体。并对其粒径，表面电荷以及形态特征等方面进行了表征，结果表明由PLFE组成的四醚脂质体表面高的负电荷导致粒径分散指数好，不容易聚集。而在模拟肠道环境的缓冲液中，四醚脂质体是相当稳定的。在应用效果方面，首先作为多肽药物的口服载体，四醚脂质体包裹的胰岛素对糖尿病小鼠具有明显的降血糖作用。其次作为模型抗原OVA的口服疫苗载体，四醚脂质体不但能诱导小鼠产生持久增强的、特异的系统免疫反应，而且也有利于产生增强特异的黏膜免疫反应。
权利要求
一种基于四醚脂质的蛋白或核酸药物脂质体制剂，其特征在于，该脂质体膜包括四醚脂质的单分子层，其中四醚脂质占总脂质质量的50-100％，蛋白药物或核酸药物溶解在脂质体膜内部的水溶液相中。
2. 根据权利要求1所述的基于四醚脂质的蛋白或核酸药物脂质体制剂，其特征是，所述的四醚脂质是指将古细菌菌液经低温萃取并纯化后制备获得。
3. 根据权利要求1所述的基于四醚脂质的蛋白或核酸药物脂质体制剂，其特征是，所 述四醚脂质来自于S. Acidacaldarius古生菌。
4. 根据权利要求1所述的基于四醚脂质的蛋白或核酸药物脂质体制剂，其特征是，所 述的蛋白药物为多肽药物。
5. 根据权利要求1所述的基于四醚脂质的蛋白或核酸药物脂质体制剂，其特征是，所 述的蛋白药物为胰岛素。
6. 根据权利要求1所述的基于四醚脂质的蛋白或核酸药物脂质体制剂，其特征是，所 述的蛋白药物为疫苗抗原。
7. 根据权利要求1所述的基于四醚脂质的蛋白或核酸药物脂质体制剂，其特征是，所 述的核酸药物为聚合聚核苷酸结构和寡聚核苷酸结构的分子。
8. —种基于四醚脂质的蛋白或核酸药物脂质体制剂及其制备方法，其特征在于，将四 醚脂质与蛋白或核酸药物的水性缓冲溶液混合，再经反复冻融和特定粒径的薄膜挤出，得 到所述的四醚脂质体制剂。
全文摘要
一种生物大分子药物技术领域的基于四醚脂质的蛋白或核酸药物脂质体制剂及其制备方法，该脂质体膜包括四醚脂质的单分子层，其中四醚脂质占总脂质质量的50-100％，蛋白药物或核酸药物溶解在脂质体膜内部的水溶液相中。本发明可以作为各种多肽，蛋白，寡核苷酸，基因等药物的口服载体，保护其在胃肠道的稳定性，提高生物利用度和药效，其中的多肽和蛋白药物包括胰岛素，人白细胞集落生长因子，红细胞生成素，人生长因子，降钙素，艾赛纳肽，肠肽激素，胸腺肽等；疫苗抗原包括各种肝炎病毒，艾滋病毒，人乳头病毒，疱疹病毒的抗原等；核酸药物包括各种基因的质粒，带有各种基因序列的寡核苷酸分子及其化学修饰结构。
文档编号A61K38/00GK101744768SQ201010128338
公开日2010年6月23日 申请日期2010年3月19日 优先权日2010年3月19日
发明者徐宇虹, 李正荣 申请人:上海交通大学