专利名称：含苄基黄酮木脂素用于制备治疗乙肝药物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及式(1)所示的黄酮木脂素或其 可药用盐用于制备清除乙肝e抗原、抑制HBVDNA复制、治疗乙型病毒性肝炎药物之用途，该 黄酮木脂素经药效学测试发现具有强效抑制乙肝e抗原活性，且其抑制强度在低浓度20微 克/毫升下便远高于阳性对照一线用药拉米呋啶和_干扰素，同时20微克/毫升时该化合 物还对HBV DNA显示出大于50%的抑制率，从而可预期发展成为降低乙肝e抗原药物、抑制 HBV DNA复制或治疗乙肝病毒感染疾病的药物。
背景技术：
乙型肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒HBV引起的传染病。HBV是嗜肝DNA病毒科 hepadnaviridae的一员，其形状为直径42纳米的球形颗粒。HBV是奇特的病毒，在其它动 物中较少有传染性，唯有在人体或者灵长类动物黑猩猩体内才能得以复制。该病毒通过乙 肝病毒携带者和乙肝病人的血液、唾液、精液、阴道分泌物进行传播，具有慢性携带状态。本 病在我国广泛流行，因其有垂直传播、水平传播、家庭内传播、医源性传播和性传播等多种 方式，对人群感染率高，在某些地区感染率达到35%以上。据有关资料，肝炎检测阳性的患 者已经达到1.89亿，而应就诊未就诊人数(携带者)将近4亿，是当前危害人民健康最严 重的传染病之一。乙肝临床表现多样化，易发展为慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化，少数病人 可转变为原发性肝癌。乙肝e抗原HBeAg是乙肝病毒HBV内核的结构蛋白，在乙肝病毒繁殖时大量产生。 乙肝病毒HBV具有所有已知DNA病毒中最小的基因组(仅3. 2kb)，其基因主要编码五种蛋 白(S、C、E、P、X)，其中C蛋白为病毒核心蛋白，而E蛋白是C蛋白的一部分，成为乙肝e抗 原(HBeAg)，其是已经编码好但未组装到病毒颗粒中的蛋白，在病毒复制时会分泌到患者血 液中去。临床上，通常将血清HBeAg作为HBV复制、传染性、病情严重程度以及对其治疗应 答进行评价的重要标志物。该抗原与HBV DNA密切相关，是临床上表达病毒复制非常实用 的血清标志物。血清标志物HBeAg阳性患者说明其体内有HBV复制，故而有较高的传染性， 患者HBeAg表达越高说明该患者传染性越强。同理，抑制HBeAg的分泌和复制也是研发抗 乙肝病毒药物中的一个重要靶标和检测标的。HBeAg清除说明体内有着持续的HBV抑制， ALT正常，组织炎症坏死减轻，肝硬化发生的几率降低。因此，血清HBeAg被认为能够反映更 为稳定的治疗效果，HBeAg血清清除标志着患者免疫系统开始发挥作用。2002年，在《新英 格兰医学杂志》发表研究结果之研究者认为对于CHB患者，如在肝硬化前获HBeAg清除， 则其肝硬化和肝细胞癌发生率将降低10倍。美国肝病研究协会AASLD、亚太肝脏研究协会 APASL和欧洲肝脏研究协会EASL的指南中均将HBeAg血清清除作为治疗终点判定标准之 一。所以，能够抑制、降低HBeAg活性或表达的药物也即属于治疗乙肝病毒感染疾病的有效 药物。目前，对乙肝患者的用药主要分为保肝降酶、抗病毒、抗肝纤维化和调节免疫 等数个大类。近些年来取得进展的还是在于抗病毒药物治疗方面的研究。抗病毒是根本方法，而保肝降酶只是辅助治疗，多治标而鲜见治本。然而，目前对于病毒性乙肝临 床上抗病毒的治疗方案只能达到抑制HBV复制和继发感染，最主要药物仍是核苷类药物 如拉米呋啶(3-TC)、恩替卡韦、阿德福韦(ADV)、替比夫定等，还有处于临床试验期中的 emtricitabine、tenofovir、clevuding等。在我国，拉米呋啶已经成为医保用药，应用于大 批HBV患者。核苷类药物部分优点为生物利用度高，口服较安全。然而，它们虽然能有效地 控制病情，但一则售价昂贵；二则长期使用均可出现耐药性，以及停药后出现HBV DNA、ALT 及肝组织学的不同程度的反弹；三是长期使用核苷类药物出现的较为明显的不良作用，例 如肾脏损伤、婴儿致畸等。最为头痛的是病毒耐药的出现大大降低了治愈率，因为核苷类 药物对病毒复制是可逆的，所以对大部分患者若欲达到最大疗效，疗程必须在一年以上，如 此其耐药性随之出现，就达不到预期之效果。此外，核苷类药物还有难以清除cccDNA、治疗 一年后HBsAg难以阴转等不足之处。干扰素(α、β _干扰素)以及重组干扰素类等来源于人白细胞的生物工程类抗病 毒药物近期成为研究和治疗慢性乙肝CHB热点药物，其具有抗病毒和免疫调节双重作用。 其既可通过抗病毒作用抑制病毒复制从而减轻肝脏细胞炎症反应，减少肝细胞损害，延缓 病情发展从而起到改善病人临床症状和肝脏生理功能；又可以增强免疫作用，通过加强体 内自然杀伤细胞和辅助性T细胞的作用，尤其是可以促进杀伤T细胞去杀伤被病毒感染细 胞，因此间接起到抗病毒作用。干扰素治疗CHB患者获得的HBeAg血清学转换比拉米呋啶更 为持久，2003年《消化道》杂志上一项研究显示干扰素治疗组HBeAg的3年复发率显著低 于拉米呋啶组；且长效干扰素可以每周使用一次，较为方便。因此，干扰素日渐成为临床上 用于治疗慢性乙肝病毒的首选药物之一，但其副作用和不良反应报道较多，总有效率不高， 价格昂贵，患者经济负担大，因而造成临床上难以广泛使用。抑制乙肝病毒在体内增殖的另外一个根本环节在于抑制HBVDNA的复制。HBV DNA 水平的降低或者低于检测水平是检验抗病毒药物的另外一把金钥匙。所以，亚太肝脏研究 学会和欧洲肝脏研究学会均将HBV DNA检测不到作为乙型肝炎病毒患者治疗终点之一。我 国新药开发指南中也将受测化合物对于HBV DNA的抑制强度视为必须完成的测试项目之 一。拉米呋啶之所以能够成为首选核苷类药物便是因为其具有强效的抑制HBV DNA复制之 活性。因此，既能抑制HBV DNA复制又能抑制HBeAg的化合物将更有希望成为治疗乙肝的 创新性药物。必须说明的是目前使用的抗病毒药物其实只是病毒复制的抑制剂，并不能直接 杀灭病毒或破坏病毒体，否则就会损伤宿主细胞。这些抗病毒药物(多为核苷类药物)还 存在上述毒副作用大、易引起病毒基因突变、停药后易反跳等缺点。因此，开发新型抗病毒 药物是当今药物研发领域的当务之急，其对于治疗我国大量的乙肝患者和病毒携带者、控 制传染源等都有着极其重要的社会意义和经济意义。所以，从民族民间长期使用的天然药 物中发现新的非核苷类乙肝病毒抑制剂及此类能够降低HBeAg和/或抑制HBV DNA复制的 先导化合物有着很大的指导性意义，并有着辽阔的发展前景。基于此目的，发明人以前曾完成多项抗乙肝病毒天然产物及其结构改造衍生物 的专利和文章，发现了多种抑制乙肝病毒e抗原HBeAg活性、或抑制HBV DNA复制的化合 物，从而说明从天然产物及其合成衍生物中筛选出抑制乙肝e抗原、防治乙肝病毒感染的 创新性药物是可行的[参见“一类对映桉烷醇类倍半萜抑制乙肝病毒的医药用途”(赵
4昱、刘光明、于荣敏、李海波等；ZL 200610053827. 4) ；“2 β -羟基冬青酸抑制乙肝病毒的医 药用途”(李校堃、赵昱、黄可新、李海波等；ZL 200610053749. 8) ；“2 α，3 β - 二羟基-5， 11 (13)-二烯桉烷-12-酸抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、张礼和、孙汉董、李海波等； ZL 200610053601.4)；“艾里莫芬烷内酯抑制乙肝病毒的用途及其药物组合物”(赵昱、李 海波、杨雷香、周长新等；ZL03153691. 3)；“一种艾里莫芬内酯酸天然产物及其应用”(赵 昱、周长新、施树云、王晓雨等；ZL 200610053575. 5)；“一种桉烷型倍半萜酸及其用途”(赵 昱、刘光明、李海波、巫秀美等；ZL200610053579. 3)；“六棱菊属植物提取物抑制单纯疱疹 病毒及乙肝病毒的用途”(赵昱、周长新、于荣敏、白骅；CN 1989989Α) ；“1β-氧代_5， 11(13) - 二烯桉烷-12-酸抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、李校堃、黄可新、李海波等；CN 1927197Α) ；“1 β -羟基冬青酸抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、李校堃、黄可新、巫秀美 等；CN1935131Α)；“对映艾里莫芬烷酸及其抑制乙肝表面抗原的医药用途”(黄可 新、李校堃、...王晓雨、赵昱等；CN 101239054) ； “ 1_氧-取代苯甲酰奎尼酸化合物 及其抑制乙肝病毒用途”(李校堃、胡利红、...巫秀美、赵昱等；CN 101293836)；发明 人已发表之抑制HBeAg和HBV DNA等活性文章参见“In Vitro Antiviral Activity ofThree Enantiomeric Sesquiterpene Lactones from Senecio SpeciesAgainst Hepatitis B Virus”，Haibo Li (李海波)，Changxin Zhou(周长新)，...Xiumei Wu(巫 ff _ )， Yu Zhao*( MS), Antiviral Chemistry&ChemotherEipy，2005，16，277—282 ； "Evaluation of Antiviral Activityof Compounds Isolated from Ranunculus sieboldii Miq. and Ranunculussceleratus L，，,Haibo Li (李海波)，Changxin Zhou (周长 新)，· · · XiumeiWu (巫秀美)，Yu Zhao* (赵昱)，Planta Medica，2005，71 (12)，1128-1133 ； "Application of high-speed counter-current chromatographyfor the isolation of antiviral eremophilenolides from Lihulariaatroviοlacea", Shi, Shu-Yun(施 W S ) Hai-Bo (李海'波)，..· Zhao, Yu ( M S ), Biomedical Chromatography, 2008, 22 (9),985-991 ；"Purification and identification of antiviral components from Laggerapterodonta by high-speed counter-current chromatography", Shuyun Shi (施 树云)，...Yu Zhao ( MS )等，Journal of Chromatography B，2007，859，119-124]。毋 庸置疑，继续从天然产物及其结构改造衍生物中寻找能够清除HBeAg或抑制HBV DNA复制 的先导化合物是非常有必要性和紧迫性的，也因此被国家科技部列为新药研制重大专项之在上述治疗CHB药物中，还有一类作为辅助药物的是保肝类药物，其临床大量使 用之典型为存在于菊科植物水飞蓟的种子中的水飞蓟素。水飞蓟已在临床上广泛应用，在 市场上其商品名为Legalon 利肝隆或Flavobion 。该药作用主要有以下几点(一)抗自 由基活性水飞蓟素对于由四氯化碳、半乳糖胺、醇类和其他肝毒素造成的肝损害具有保护 作用。1990年Lotteron等人报道了在小鼠肝微粒体内，水飞蓟素能减少由四氯化碳代谢弓I 起的体外脂质过氧化及由还原型辅酶单独引起的过氧化作用，这些都表明水飞蓟素为链中 断抗氧化剂或为自由基清除剂。(二)保护肝细胞膜通过抗脂质过氧化反应维持细胞膜 的流动性，保护肝细胞膜。还能阻断真菌毒素鬼笔毒环肽和α-鹅膏蕈碱等与肝细胞上特 异受体的结合，抑制其对肝细胞的攻击及跨膜转运，中断其肝肠循环，从而增强肝细胞膜对于多种损害因素的抵抗力。(三)促进肝细胞的修复和再生水飞蓟宾进入细胞后可以与 雌二醇受体结合，并使之激活，活化的受体可以增强肝细胞核内RNA聚合酶1的活性，使RNA 转录增强，促进酶及蛋白质的合成，并间接促进DNA的合成，有利于肝细胞的修复和再生。 (四)抗肿瘤作用各种活性氧能氧化鸟嘌呤形成8-羟基鸟嘌呤，造成DNA损伤，进而引起 肿瘤，水飞蓟宾作为一个有效的抗自由基物质也显示了预防和治疗肿瘤的作用。三十多年 的临床实验证明该药具有确切的疗效和低毒性(参阅Flora，K.等，Am. J. Gastroenterol, 1998,93,139-143 ；Sailer R. Drugs, 2001,61 (14), 2035-2063 ； Gazak5 R.等，Curr·
Med. Chem. 2007，14，315-338 ； Svagera, Ζ.等，Phytother. Res. 2003，17，524-530 ； Gazak, R.等，Bioorg. Med. Chem. 2004,12, 5677-5687 ；Varga, Ζ.等，Phytothe. Res. 2001,15, 608-612. Singh, R. P.等，Curr. Cancer Drug Tar. 2004，4，1-11)。水飞蓟中黄酮木脂素水飞 蓟宾含量最多，活性也最高。黄酮木脂素化合物属于杂木质素类，是由一分子苯丙素和一分 子黄酮结合而成的一类天然产物。因此，以水飞蓟宾为代表的黄酮木脂素类化合物引起了 越来越多的关注，如发明人于2006-2009年间制备并报道的多个系列水飞蓟宾类衍生物也 具有H著的抗氧化 舌t生(杨Il香，赵§等，"Design，synthesis andexamination of neuron protective properties of alkenylated and amidateddehydro-silybin derivatives", Journal of Medicinal Chemistry，2009，52 (23)，7732-7752 ；汪峰，赵昱等，“Pr印aration ofC-23esterified silybinderivatives and evaluation of their lipid peroxidation inhibitory and DNAprotective properties", Bioorganic&Medicinal Chemistry,2009, 17(17) ,6380-6389 ；杨雷香，赵昱等，“Synthesis and Antioxidant PropertiesEvaluation of Novel Si lybin Analogues，，，Journal of Enzyme Inhibitionand Medicinal Chemistry, 2006，21(4), 399-404 ；等等)。在发明人报道的这些文章中，经发明人设计并合 成出的多个系列之A环、B环、E环和23位取代的黄酮木脂素类化合物都显示出强效捕获 DPPH自由基和超氧阴离子自由基的活性、抗氧化活性、以及保护PC12细胞的活性。但是上 述研究仅限于研究水飞蓟宾类黄酮木脂素的抗氧化作用和细胞保护作用。以水飞蓟宾为代表的黄酮木脂素化合物虽然具有以上所述之抗氧化疗效，然而其 抗病毒治疗方面几乎未见报道，黄酮木脂素类化合物治疗DNA类病毒感染尤其是其用于抗 乙肝病毒方面(包括抑制乙肝e抗原HBeAg或抑制HBV DNA复制)的新用途尚未得到有效 开发。近期(2006年)，谢军报道了联合应用具有抗病毒和免疫调节双重作用的干扰素和 保肝护肝的水飞蓟宾磷脂复合物治疗慢性乙肝的结果，发现联合用药对患者体内ALT、AST 值降低比单独用干扰素效果明显，说明水飞蓟宾磷脂复合物能加强干扰素的治疗慢性乙肝 之作用。但是，类似的治疗方案仍是将水飞蓟宾等黄酮木脂素作为辅助用药，且主要是用 于保护肝细胞膜而非直接用其实施抗病毒作用。左国营等(左国营，刘树玲，徐贵丽，世界 华人消化杂志，2006年14卷13期，1241-1246页)综述了近20年来药用植物成分体外抗 HBV活性的研究进展，文中论及多种天然产物，其中并没有报道任何黄酮木脂素类化合物具 有抗HBV活性的相关记录。尤其是水飞蓟宾类天然产物及其衍生物，国内几乎无人涉及，而 本发明对其进行了前人未加注意的结构改造和抗HBV活性研究。我们的目的之一是希望 发现能降低HBeAg或抑制HBV DNA复制的黄酮木脂素先导化合物，从而将其进一步开发成 具有能清除HBeAg、或抑制HBV DNA复制治疗CHB的创新性药物。综上，从黄酮木脂素中寻找抗乙肝病毒领域的活性化合物、也即将黄酮木脂素结构改造使其具有抗DNA类病毒活性是一个崭新的领域。从其中发现抑制HBeAg或抑制HBV DNA复制的先导化合物更是前人所未尝试过的挑战。为了探索这个领域，我们制备了与水飞 蓟宾结构有所差异的一种新的黄酮木脂素衍生物，也即在E环引入新的苄氧基取代基来取 代已有的甲氧基，形成了 E环上新型取代结构的木质素二氢黄酮醇类化合物(新型黄酮木 脂素化合物)，以期发现超乎寻常的抑制乙肝病毒e抗原或抑制HBV DNA复制的活性乃至 先导化合物。经本发明人详细的文献查阅，到目前为止，尚无有关本发明涉及的式(1)化合 物治疗乙肝病毒感染性疾病和制备抗乙肝病毒药物的报道。黄酮木脂素式(1)化合物对于 HBeAg和HBV DNA强效抑制均属于意想不到的发现，有着极为显著地原创性，据此完成本发 明。
发明内容
本发明的目的是提供了式(1)所示的黄酮木脂素或其可药用盐用于制备降低乙 肝e抗原或抑制HBV DNA复制的治疗乙型病毒性肝炎药物中之新用途。 式(1)化合物的名称为(士)-2-[2，3_ 二氢-3-(3_苄氧基-4-羟基苯基)-2_羟 甲基-1,4-苯并二氧六环-6]-2, 3- 二氢-3,5,7-三羟基-4H-1-苯并吡喃_4_酮。式(1)化合物可以由化学合成方法得到。本发明的另一个目的是提供了一种用于降低乙肝e抗原或抑制HBV DNA复制、治 疗乙型病毒性肝炎的药物组合物，其特征为由含有治疗有效量的作为活性成分的式(1)化 合物或者它的可药用盐和可药用辅料组成的混合物。其药物剂型可以是片剂、胶囊剂、注射 剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、贴片剂、皮下植埋剂、外用搽剂、口服液或软膏剂，还可以采 用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。本发明的黄酮木脂素化合物(1)与天然产物水飞蓟宾相比较，具有诸多结构和物 化性质上差异化的特征，包括其疏水性、芳香性、吉布斯自由能、氢键受体、电性、分子间范 德华力、以及3D构象等特质均与水飞蓟宾有着明显不同；且化合物(1)分子量比水飞蓟宾 增大了 76个质量单位。上述特征都决定了式(1)所示之化合物三维构象与HBeAg或HBV DNA之3D空间结构相结合之配体-受体结合复合物形态和结合方式都可能产生较大的差 别，其结合位点和结合模式、其结合自由能等均会产生较大的改变，因而可能在抑制HBeAg 或抑制HBV DNA复制方面有着意想不到的效果。式(1)所示的黄酮木脂素既有结构上的独特性，又有抗病毒作用方面研究的新颖 性，并在抗乙肝病毒活性测试中发现了超乎寻常的抑制乙肝e抗原的活性，有望成为降低 HBeAg或抑制HBV DNA复制及治疗CHB之先导化合物。我们测试了该化合物对H印G2. 2. 15细胞的生长抑制作用，同时测试了其对 H印G2. 2. 15细胞分泌的乙型肝炎e抗原HBeAg及对HBV
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DNA复制的抑制活性。试验结果发现本发明中合成得到的木质素二氢黄酮醇类 化合物即(士)-2- [2，3- 二氢-3- (3-苄氧基-4-羟基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六 环-6] -2，3- 二氢-3,5,7-三羟基-4H-1-苯并吡喃_4_酮对H印G2. 2. 15细胞分泌的乙型 肝炎e抗原HBeAg具有极为显著的强效抑制活性，其活性远超过阳性对照(也是临床治疗 乙肝病毒患者一线用药)拉米夫啶和α-干扰素；此外，药效学测试结果还显示式(1)所 示之黄酮木脂素化合物对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)的复制具有相当强的抑 制作用，其在较低剂量(20微克/毫升)时对乙肝病毒HBV DNA的复制抑制活性就已经超 过50%。属于强效非核苷类抑制乙肝病毒天然产物；以上均说明式(1)化合物有着非常显 著的抗HBV效果，从而可以预期作为降低乙肝e抗原或抑制HBVDNA复制、治疗乙型病毒性 肝炎之先导化合物继续开发。本发明有益之处在于制备了 E环上苄氧基代替甲氧基取代的水飞蓟宾类黄酮木 脂素类醚，并首次发现此醚具有降低乙肝e抗原、抑制HBV DNA复制、防治乙肝病毒方面的 成药潜力，为开发治疗乙肝病毒创新药物、开发降低乙型肝炎e抗原HBeAg或抑制HBV DNA 复制之创新药物提供了新的物质基础，具有潜在巨大的社会效益和经济效益。本发明再一 特点为本发明之合成起始物来源方便，合成方便。其制备方法简单易行，原料来源方便易 得，成本低，污染小，利于节能减排条件下的大规模生产，产业化前景十分明确。
具体实施例方式本发明人通过化学合成，并通过层析手段得到该既能有效抑制乙肝e抗原 (HBeAg)的分泌又能有效抑制HBV DNA复制的一个黄酮木脂素类活性化合物，又经质谱和 核磁共振波谱等综合解析推导出其化学结构。本发明人发现，式(1)化合物对IfepG2.2. 15 细胞的生长无明显抑制作用，而对H印G2. 2. 15细胞分泌的乙肝e抗原(HBeAg)的分泌和 HBV DNA的复制具有显著的抑制作用，提示该化合物具有用药安全、降低乙肝病毒e抗原及 抑制HBV DNA复制高效的特点。因此，根据本发明人的研究，本发明的式(1)所示之黄酮木 脂素化合物可以用于制备治疗乙肝病毒感染性疾病的药物。为了更好地理解本发明的实质，下面分别用式(1)化合物的制备及其对 H印G2. 2. 15细胞生长抑制作用以及对H印G2. 2. 15细胞分泌的HBeAg及HBV DNA复制之抑 制作用的试验结果，说明其在制药领域中的新用途。实施例给出了式(1)化合物的部分合 成、结构鉴定和活性数据。必须说明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的 限制，根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。实施例1 式⑴化合物(士)-2-[2，3_ 二氢-3-(3_苄氧基-4-羟基苯基)-2_羟 甲基-1，4-苯并二氧六环-6] -2，3- 二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃_4_酮的制备本发明用从头合成法制备了式(1)所示之黄酮木脂素化合物，除此方法之外，还 可以用市售黄杉素和苄氧基取代之松柏醇直接进行氧化偶联反应，一步生成式(1)化合 物。所用仪器与试剂包括紫外光谱用Shimadzu UV-240紫外分光光度计测定；核磁共振 氢谱1H-NMR由INOVA型超导核磁共振波谱仪(VARIAN IN0VA-400MHz)测定(四甲基硅 醚TMS为内标)；电喷雾质谱ESI-MS由BrukerEsquire 3000+质谱仪测定，柱层析用硅 胶(100-200，200-300和300-400目)以及薄层层析用硅胶GF254 (10-40目)均由青岛海 洋化工厂生产；所用试剂均为分析纯，其中石油醚沸程为60-90°C ；薄层制备层析(PTLC)用Merck公司的铝箔硅胶板；柱色谱用葡聚糖凝胶S印hadex LH-20采用瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB 公司产品；反相硅胶 RP-18 采用日本 Fuji Silysia Chemical 公司 的Chromatorex产品；MCI为日本三菱化工公司产品，薄板(TLC)检测用254nm和365nm的 紫外灯；显色剂用碘蒸气、10%硫酸-乙醇以及磷钼酸溶液。1.1化合物2即3，4，2' ,4'， 6' _五甲氧甲氧基查尔酮的制备 8. 4克氢氧化钾溶于100毫升无水甲醇中，搅拌降至室温后加入溶解有3克2，4， 6_三甲氧甲氧基苯乙酮和2. 3克3，4_ 二甲氧甲氧基苯甲醛的20毫升甲醇溶液，于室温 搅拌10小时，减压蒸去溶剂，残留物中加入50毫升水，醋酸乙酯提取，合并有机相，饱和食 盐水洗涤，无水硫酸钠Na2SO4干燥，过滤，浓缩得棕色残留物，经柱层析得黄色油状物3. 8 克。收率77% ;Rf(石油醚/醋酸乙酯=3/1) :0. 10 ；核磁共振氢谱1H NMR (400MHz，氘代 氯仿，δ in ppm) δ :3· 36 (单峰，6Η, OCH3)，3· 47 (单峰，9Η, OCH3)，5· 14 (单峰，4Η, OCH2O)， 5. 22 (单峰，2Η, OCH2O)，5. 25 (单峰，4Η, OCH2O)，6. 58 (单峰，2Η，Η-3 ‘，5 ‘ )，6. 83 (双峰， J = 16. 0Hz, 1Η, H- α ), 7. 16 (双峰，J = 8. OHz, 1Η, Η-5)，7. 24 (双双峰，J = 2. 0,8. OHz, 1Η，Η-6)，7. 26 (双峰，J = 16. OHz，1Η，H- β )，7. 45 (双峰，J = 2. OHz，1Η，Η-2)；电喷雾质谱 ESI-MS :m/z 507[M+H] +。1.2化合物3即3，4，2' ,4' ,6'-五甲氧甲氧基环氧查尔酮的制备 取1. 1步骤中得到的化合物2即3，4，2' ,4' ,6'-五甲氧甲氧基查尔酮2. 5克 溶解于60毫升甲醇中，于搅拌状态下加入2N氢氧化钠3毫升以及30%过氧化氢4毫升， 于室温搅拌5小时，取样做紫外分析，UV (MeOH) λ max nm 由209，330变为209，282，当330nm 的吸收峰完全消失后说明反应完全，减压蒸去溶剂，在残留物中加入50毫升水，醋酸乙酯 提取(3X30毫升)。合并有机相后用饱和食盐水(40毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤， 浓缩得黄色油状物2. 4克，收率88%。产物直接用于下一步反应。1.3化合物4即(士)-tranS-3，5，7，3'，4'-五羟基二氢黄酮醇的制备 取1.2步骤中得到的化合物3即3，4，2'，4'，6'-五甲氧甲氧基环氧查尔酮 2. 4克溶解于60毫升甲醇和20毫升四氢呋喃的混合溶剂中，向其中滴加3毫升浓盐酸， 于50-55°C搅拌15分钟，减压蒸去溶剂，醋酸乙酯提取(3X30毫升)，合并有机相后依次 用水，饱和食盐水(各40毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，浓缩，残留物用氯仿-甲醇 (10 1)作洗脱剂，经柱层析得到浅黄色固体1克，收率73% ;Rf (氯仿甲醇=10 1) 0. 30 ；核磁共振氢谱 1H NMR(400MHz，氘代丙酮，δ inppm) 4. 61 (双双峰，J = 4. 4，11. 6Hz， 1Η，Η-3)，4· 71 (双峰，J = 4. 4Hz, 1Η，3-0Η)，5. 02(双峰，J = 11. 6Ηζ, 1Η，Η_2)，5· 95(双峰， J = 2. 4Ηζ，Η-6)，5· 98 (双峰，J = 2. 4Hz, 1Η, Η_8)，6. 85-7. 07 (多重峰，3Η, Ar-H)，11· 71 (单 峰，1Η，5-0Η)；电喷雾质谱 ESI-MS :m/z 303[M_H] +。1. 4化合物(1)的制备 在干燥氮气保护的反应瓶中加入0.6克步骤1.3中得到的化合物4即 (±)-tranS-3，5，7，3' ,4'-五羟基二氢黄酮醇和3-苄氧基-4-羟基肉桂醇0. 75克，用 无水丙酮40毫升和无水苯120毫升溶解，于55-60°C搅拌20分钟，再加入1. 5克碳酸银，继 续搅拌12小时，过滤，母液浓缩，经柱层析得浅黄色粉末30. 8毫克，收率28%。化合物(1)即(士)-2-[2，3_ 二氢-3-(3_苄氧基-4-羟基苯基)-2_羟甲基-1， 4-苯并二氧六环-6]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4!1-1-苯并吡喃_4_酮浅黄色粉 末；C31H26Oltl ；Rf值(氯仿醋酸乙酯草酸=25 1 0. 25) :0. 15;核磁共振氢谱 1H-NMR(氘代丙酮，400MHz) δ 3. 50 (1Η，多重峰，H_23a)，3. 73 (1H，多重峰，H_23b)，4. 16 (1H, 多重峰，H-10) ,4. 68 (1H,双峰，J = 11. 6Hz, Η_3)，4· 98 (1Η,双峰，J = 8. OHz，H-11)， 5. 11(1H，双峰，J= 11.6Hz，H-2)，5. 19(2H，单峰，-CH2Bn)，5. 98(1H，单峰，H_6)，6. 00 (1Η, 单峰，Η-8)，6. 93-7. 51 (11Η,多重峰，Ar-H)，11. 71 (1Η,单峰，5-0Η)；电喷雾质谱 ESI-MS :m/ ζ 557[M-H]+。实施例2 化合物(1)对H印G2. 2. 15细胞分泌的乙型肝炎e抗原(HBeAg)的抑制 作用2. 1细胞培养将H印G2. 2. 15细胞培养于含10%灭活胎牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升 链霉素，100微克/毫升G418的DMEM培养基中，置37°C，5% C02，100%相对湿度的培养箱
中培养。2. 2采用MTT法测定式(1)化合物对H印G2. 2. 15细胞生长的抑制作用取对数生长期的H印G2. 2. 15细胞，用培养基将细胞稀释成1 X IO5个/毫升，接种 于96孔细胞培养板，每孔100微升，在37°C，5% CO2,100%相对湿度的培养箱中培养24小 时后加入用培养基稀释的化合物(1)，浓度分别为1000微克/毫升，200微克/毫升，40微 克/毫升和8微克/毫升，每孔200微升，每个浓度设三个复孔，置于37°C，5% CO2,100%相对湿度的培养箱中培养，培养72小时后，每孔加入MTT试剂10微升，继续培养4小时，弃 去培养基，每孔加入DMS0200微升，用振荡器振荡20分钟，在570nm波长下用酶标仪测定OD 值。以只加培养基的培养孔为对照孔。抑制率(％)=(对照孔OD值-实验组OD值)/对 照孔OD值X 100%。实验重复三次。测定化合物对乙型肝炎e抗原(HBeAg)的抑制作用取对数生长期的H印G2. 2. 15 细胞，用培养基将细胞稀释成ι χ IO5/毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100毫升，在 37°C,5% C02，100%相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的样品，浓度分 别为20微克/毫升、4微克/毫升和0. 8微克/毫升，每孔200微升，每个浓度设三个复孔， 置于37°C，5% C02，100%相对湿度的培养箱中培养，每4天换含相同浓度样品的培养基，将 同一样品同一浓度的换出的培养基等体积混勻，作为待测样品。用ELISA试剂盒测定培养 基中HBeAg浓度，以P/N表示；以拉米呋啶(3-TC)为阳性对照1 (注拉米夫啶测试浓度为 100微克/毫升、20微克/毫升和4微克/毫升)；以α -干扰素为阳性对照2 (注α -干 扰素测试浓度为10000单位/毫升、5000单位/毫升和1000单位/毫升)。2. 3实验结果实验结果如表1所示，式(1)化合物有显著的抑制乙型肝炎e抗原(HBeAg)的作 用。其对H印G2. 2. 15细胞的生长无明显抑制作用，但对H印G2. 2. 15细胞分泌的HBeAg在 第八天时抑制活性高达84. 1%，而阳性对照1拉米呋啶在最高浓度(100微克/毫升)时 对HBeAg抑制活性为零；阳性对照2即α-干扰素在第8天最高测试浓度(10000单位/毫 升)时对HBeAg仅有16. 9%的抑制活性，化合物(1)在20微克/毫升时对HBeAg抑制活性 高于α-干扰素将近400%。表1.样品第八天时对H印G2. 2. 15分泌的乙型肝炎e抗原抑制率 该实施例结果说明式⑴所示之黄酮木脂素化合物(士)-2-[2，3_ 二 氢-3- (3-苄氧基-4-羟基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6] -2，3- 二氢-3，5，7-三 羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮对H印G2. 2. 15细胞分泌的乙型肝炎e抗原(HBeAg)具有显 著的抑制作用，其在20微克/毫升时对HBeAg抑制活性即已经大于80 %，在此浓度下有84. 1 %的HBeAg活性被抑制，而阳性对照拉米呋啶在最大浓度100微克/毫升时对HBeAg 抑制活性仍为零；另外一个阳性对照一线用药α-干扰素在最高测试浓度(10000单位/毫 升)时第8天对HBeAg仅有16.9%的抑制活性，比化合物(1)低了 4倍左右。可见该黄酮 木脂素有极为显著的抑制乙肝病毒分泌乙肝e抗原活性，因而可预期发展为降低乙型肝炎 e抗原、控制病毒性乙型肝炎症状的药物。实施例3 式(1)化合物对H印G2. 2. 15细胞分泌的乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸 (HBV DNA)复制的抑制作用3.1细胞培养方法同实施例2。3. 2采用MTT法测定式(1)所示之黄酮木脂素化合物对H印G2. 2. 15细胞生长的抑 制作用方法同实施例2。3. 3测定式(1)所示之黄酮木脂素化合物对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV DNA)复制的抑制作用取对数生长期的H印G2. 2. 15细胞，用培养基将细胞稀释成1 X IO5个 /毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100微升，在37°C，5% CO2,100%相对湿度的培养箱 中培养24小时后加入用培养基稀释的式(1)所示之黄酮木脂素化合物，浓度分别为20微 克/毫升、4微克/毫升和0. 8微克/毫升，每孔200微升，每个浓度设三个复孔，置于37°C， 5% C02，100%相对湿度的培养箱中培养，每4天换含相同浓度样品的培养基，将同一样品同 一浓度的换出的培养基等体积混勻，作为待测样品。第8天时用HBV DNA定量PCR试剂盒 测定培养基中HBV DNA浓度。以拉米呋啶(3-TC)为阳性对照1 (测试浓度为100、20和4 微克/毫升)，以α-干扰素为阳性对照2 (测试浓度为10000、5000和1000单位/毫升)。3. 4实验结果实验结果如表2所示，从头合成的黄酮木脂素式(1)化合物具有强 效的抑制乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸复制的作用。表2样品第8天时对H印G2. 2. 15细胞的HBV DNA复制的抑制率 该实施例结果说明式(1)所示之黄酮木脂素化合物对乙型肝炎病毒脱氧核糖核 酸(HBV DNA)的复制具有相当强的抑制作用，其在较低剂量(20微克/毫升)时对HBV DNA 的复制抑制活性就已经超过50%。而阳性对照α-干扰素在第8天最高测试浓度(10000 单位/毫升)时对HBV DNA有38. 2 %的抑制活性，化合物(1)在20微克/毫升时对HBVDNA抑制活性高于10000单位/毫升浓度时的α _干扰素，属于强效非核苷类抑制乙肝病毒 天然产物，值得进一步关注和深入研究，并可预期优化发展为抑制HBV DNA复制的药物。
在上述说明书阐述本发明时，同时提供了实施例的目的是举例说明本发明的实际 操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时，本发明的实际应 用包括所有一般变化、配合，或改进。
权利要求
由式(1)所示的黄酮木脂素或其可药用盐用于制备治疗乙型病毒性肝炎药物之用途，其特征为式(1)化合物的名称为(±) 2 [2，3 二氢 3 (3 苄氧基 4 羟基苯基) 2 羟甲基 1，4 苯并二氧六环 6] 2，3 二氢 3，5，7 三羟基 4H 1 苯并吡喃 4 酮。FSA00000134429500011.tif
2.由式(1)所示的黄酮木脂素或其可药用盐用于制备清除乙肝e抗原HBeAg药物之用 途，其特征为 式(1)化合物的名称为(士)-2-[2，3-二氢-3-(3-苄氧基-4-羟基苯基)-2_羟甲 基-1，4-苯并二氧六环-6] -2，3- 二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃_4_酮。
3.由式(1)所示的黄酮木脂素或其可药用盐用于制备抑制乙型肝炎病 酸HBV DNA复制药物之用途，其特征为 式(1)化合物的名称为(士)-2-[2，3-二氢-3-(3-苄氧基-4-羟基苯基)-2_羟甲 基-1，4-苯并二氧六环-6] -2，3- 二氢-3，5，7-三羟基-4Η-1-苯并吡喃_4_酮。
全文摘要
本发明涉及含苄基黄酮木脂素用于制备治疗乙肝药物的用途，具体而言，本发明涉及一种黄酮木脂素或其可药用盐用于制备清除乙肝e抗原、抑制乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸HBV DNA复制、治疗乙型病毒性肝炎的药物之用途。该黄酮木脂素具有抑制乙肝病毒e抗原HBeAg活性，且其抑制强度在低浓度20微克/毫升下便远高于阳性对照一线用药拉米呋啶和-干扰素，同时20微克/毫升时该化合物还对HBV DNA显示出大于50％的抑制率，从而可预期用于制备清除乙肝e抗原药物和抑制HBV DNA复制的治疗乙型肝炎病毒感染疾病的药物的用途。
文档编号A61K31/357GK101912387SQ20101018182
公开日2010年12月15日 申请日期2010年5月25日 优先权日2010年5月25日
发明者冯玉冰, 姜皞, 巫秀美, 彭芳, 李峰, 蒋凌云, 赵昱, 郝小江 申请人:大理学院