Cpg寡核苷酸在治疗丙型肝炎病毒感染中的应用的制作方法

专利名称：Cpg寡核苷酸在治疗丙型肝炎病毒感染中的应用的制作方法
技术领域：
本发明提供了治疗丙型肝炎病毒慢性感染的受试体的方法和产品。
背景技术：
丙型肝炎病毒(HCV)是黄病毒家族的正链RNA病毒，能感染人和一些其它灵长动 物的肝细胞。首次发现是在1989年(1)，HCV具有9. 5kb的基因组，编码三个结构基因核 和两个包被蛋白(El和E2)，以及几个涉及病毒复制和与宿主相互作用的非结构(NS)蛋白。HCV严重关系到公共健康，它引起>90%的肠胃外非甲非乙型肝炎(1)。世界人口 有0. 4到1. 5%被传染(3，4)，包括大约300，000加拿大人(加拿大卫生署)。由于急性感 染中的绝大部分都是无临床症状的，因此难于进行流行病学统计；然而估计有50-80%的 HCV感染个体不能清除病毒，其中大部分变成终生携带者。大约50%的携带者发展成慢性 肝炎，其中20%发展成肝硬化，其中一些继续发展成肝细胞性肝癌(5-9)。在美国估计丙型 肝炎每年引起8，000到10，000人死亡。在美国和加拿大，治疗丙型肝炎有两种不同的方法单独用α干扰素治疗以及用 α干扰素和病毒唑组合治疗。组合治疗虽然较昂贵并且具有更多的副作用，但是通常比单 独治疗产生持续反应的几率较高。干扰素具有几种形式(α -2a, α -2b,以及复合干扰素(Alfacon))，这些干扰素一 般是每周皮下给药三次。聚乙二醇化干扰素，即加上聚乙二醇进行修饰以增加其在循环系 统中的保持时间的α干扰素，是另一种干扰素，每周只给药一次。相反，病毒唑是一种口服 抗病毒制剂，以200mg的胶囊每天给药两次。干扰素的副作用包括疲劳，肌肉疼痛，头疼，恶心和呕吐，注射部位有皮肤刺激， 低烧，体重降低，烦躁，沮丧，自杀，轻微骨髓抑制和脱发(可恢复的)。对于病毒唑副作用包 括贫血性疲劳和烦躁，搔痒，皮疹，鼻子不通气，窦炎和咳嗽。单独用干扰素治疗或者干扰素和病毒唑组合治疗会使50-75%的受试体血清ALT 水平快速升高，会使30-50%的受试体血清中可检测到的HCV RNA消失。只有当HCV RNA在 治疗中消失并且在治疗结束后至少6个月都检测不到才可认为肝病有了长期好转。组合治 疗会使得HCV RNA在治疗中更快地消失，在治疗结束后复发的几率更低。但是，治疗结果也 强烈依赖于病毒的基因型，基因型2和3得到的结果较好(用聚乙二醇化干扰素-α和病 毒唑治疗1年后为90% )，而基因型IHCV的结果较差(大约40%保持反应)。目前在北美 大部分HCV慢性携带者都是基因型1。治疗的最佳持续时间随使用的是干扰素单独治疗还是组合治疗，以及HCV基因型 的不同而不同，典型地，持续时间是6到12个月。目前还没有HCV的疫苗，对于慢性感染也没有显著有效的治疗方法。因此迫切需 要能用于治疗慢性携带者的有效治疗方法。
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发明简述本发明部分基于几个令人惊讶的发现，包括CpG免疫刺激核酸可用于治疗乙型肝 炎病毒(HCV)慢性感染的并且对于以前的非CpG疗法没有反应的受试体。本发明进一步部 分基于发现了在组合使用了 CpG免疫刺激核酸和抗病毒试剂例如IFN-α的受试体中发现 有协同反应。在一方面，本发明提供了一种治疗具有HCV感染并且用以前的非CpG疗法不能成 功治疗的受试体的方法，包括给需要治疗的受试体施用有效量的能治疗所述感染的CpG免 疫刺激核酸。在一个实施方案中，所述非CpG疗法包括干扰素-α。在一个相关的实施方案中， 所述干扰素_ α是干扰素_ α _2b，干扰素_ α -2a或复合干扰素_ α。在另一个实施方案中， 所述非-CpG疗法包括干扰素-α和病毒唑，或干扰素-α和病毒唑和emantidine。在一些 重要的实施方案中，所述非CpG疗法包括聚乙二醇化的干扰素-α和抗病毒剂例如病毒唑。在一个实施方案中，CpG免疫刺激核酸是A类CpG免疫刺激核酸。在另一个实施 方案中，所述CpG免疫刺激核酸是B类CpG免疫刺激核酸。在另一个实施方案中，所述CpG免疫刺激核酸是C类CpG免疫刺激核酸。所述方法任选地包括将抗病毒剂例如干扰素_ α与所述CpG免疫刺激核酸一起给 药。所述干扰素-α可以是干扰素-a_2b，干扰素-a-2a或复合干扰素-α，但不限于此。 在一个实施方案中，所述抗病毒剂基本上与所述CpG免疫刺激核酸同时给药。在一个实施方案中，所述CpG免疫刺激核酸包括骨架修饰。在一个相关的实施方 案中，所述骨架修饰是硫代磷酸酯骨架修饰。在一些重要的实施方案中，所述CpG免疫刺激 核酸包括半柔性骨架。在其它重要的实施方案中，所述CpG免疫刺激核酸是具有半柔性骨 架的C类CpG免疫刺激核酸。因此，在另一个方面，提供了一种治疗具有HCV感染并且用以前的非CpG疗法不能 成功治疗的受试体的方法，包括给需要治疗的受试体施用有效量的能治疗所述感染的具有 半柔性骨架的C类CpG免疫刺激核酸。在另一个方面，提供了一种治疗具有HCV感染并且用以前的非-CpG疗法不能成功 治疗的受试体的方法，包括使需要治疗的受试体的外周血单核细胞与有效量的能刺激免疫 反应的CpG免疫刺激核酸接触，并将这些细胞重新输入到受试体体内。在一个实施方案中，外周血单核细胞包括树突状细胞。在另一个实施方案中，树突 状细胞包括类浆细胞的树突状细胞。在一个实施方案中，所述CpG免疫刺激核酸是C类CpG 免疫刺激核酸。在一个相关的实施方案中，所述C类CpG免疫刺激核酸具有半柔性骨架。在另一方面，本发明提供了一种治疗具有HCV感染并且可能对非CpG疗法没有反 应的受试体的方法，包括给需要治疗的受试体施用有效量的能治疗所述感染的CpG免疫刺 激核酸。在一个实施方案中，所述方法进一步包括鉴别可能对非CpG疗法没有反应的受试 体。在一个实施方案中，所述受试体是通过检测每个树突状细胞产生的干扰素-α鉴别为 可能没有反应。在另一个实施方案中，所述受试体是根据HCV基因型鉴别为可能没有反应。在一个实施方案中，所述非CpG疗法包括IFN-α。在一个相关的实施方案中，所述 非CpG疗法包括干扰素-α和病毒唑。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括给受试体施用抗病毒试剂。在重要的 实施方案中，所述抗病毒试剂是干扰素-α。所述干扰素-α可以是干扰素-α-2b，干扰 素-α-2a或复合干扰素-α，但不限于此。在一个实施方案中，所述干扰素_ α以低剂量施 用，任选地组合使用CpG免疫刺激核酸和干扰素-α可产生协同作用。在一个实施方案中，用于治疗受试体的CpG免疫刺激核酸是A类CpG免疫刺激核 酸或B类CpG免疫刺激核酸，或C类CpG免疫刺激核酸。在一个实施方案中，用于鉴别受试体是否是可能对非CpG疗法没有反应的CpG免 疫刺激核酸是A类CpG免疫刺激核酸或B类CpG免疫刺激核酸，或C类CpG免疫刺激核酸。在一个实施方案中，所述抗病毒剂基本上与所述CpG免疫刺激核酸同时给药。在 其它实施方案中，干扰素- α在用所述CpG免疫刺激核酸治疗之前一段时间施用。在特定的实施方案中，所述CpG免疫刺激核酸包括骨架修饰。在相关的实施方案 中，所述骨架修饰是硫代磷酸酯骨架修饰。在一些优选的实施方案中，所述CpG免疫刺激核 酸包括半柔性骨架。在其它更优选的实施方案中，所述CpG免疫刺激核酸是具有半柔性骨 架的C类CpG免疫刺激核酸。在另一个方面，提供了一种治疗具有HCV感染并且可能对非CpG疗法没有反应的 受试体的方法，包括给需要治疗的受试体施用有效量的能治疗所述感染的具有半柔性骨架 的C类CpG免疫刺激核酸。在另一个方面，本发明提供了一种筛选可用于治疗慢性丙型肝炎病毒感染的CpG 免疫刺激核酸的方法。所述方法包括使具有慢性丙型肝炎病毒感染的受试体的外周血单核 细胞与一种CpG免疫刺激核酸接触，在接触以后测量血单核细胞的检测反应。用于获取外 周血单核细胞的受试体用以前的治疗方法不能成功治疗。在一个实施方案中，所述检测反应选自B细胞刺激，IL-6的分泌，IL-10的分泌， IL-12的分泌，干扰素-γ的分泌，1型干扰素(α+β)的分泌，IP-IO的分泌，NK活性，⑶80 的表达，⑶86的表达，⑶83的表达，II类MHC表达的正调控。在另一个实施方案中，所述外周血单核细胞包括树突状细胞。在相关的实施方案 中，所述树突状细胞包括类浆细胞的树突状细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是树突状 细胞，所述检测反应选自IL-12的分泌，1型干扰素的分泌，⑶80的表达，⑶86的表达，⑶83 的表达，和II类MHC表达的正调控。在一个实施方案中，所述接触是在体外。在另一个实施方案中，所述外周血单核细 胞是培养的。在另一个实施方案中，将所述CpG免疫刺激核酸加入到培养的外周血单核细 胞中。在一个实施方案中，以前的治疗是一种非CpG疗法。在另一个实施方案中，所述非 CpG疗法包括干扰素-α。在另一个实施方案中，所述非CpG疗法进一步包括病毒唑。在其 它的实施方案中，所述干扰素-α是聚乙二醇化的IFN-α。在一个实施方案中，以前的治疗 是用具有不同序列或不同类的CpG核酸进行的治疗。在其它实施方案中，所述方法进一步包括检测所述CpG免疫刺激核酸刺激来自正 常受试体的外周血单核细胞的对照反应的能力。所述方法进一步包括使外周血单核细胞与干扰素_ α和所述CpG免疫刺激核酸基 本上同时接触。
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在一个实施方案中，所述CpG免疫刺激核酸包括骨架修饰。在一个相关的实施方 案中，所述骨架修饰是硫代磷酸酯骨架修饰。在重要的实施方案中，所述CpG免疫刺激核酸 包括半柔性骨架。所述CpG免疫刺激核酸可以是A类CpG免疫刺激核酸，B类CpG免疫刺 激核酸，或C类CpG免疫刺激核酸。在一些实施方案中，所述CpG免疫刺激核酸是C类CpG 免疫刺激核酸，在其它实施方案中，所述CpG免疫刺激核酸是具有半柔性骨架的C类CpG免 疫刺激核酸。在另一个方面，本发明提供了一种鉴别具有HCV感染并且可能对非CpG疗法没有 反应的受试体的方法。所述方法包括使从具有丙型肝炎病毒感染的受试体收集到的外周血 单核细胞暴露于CpG免疫刺激核酸中，检测这些细胞产生的干扰素_ α，并测定每个树突状 细胞产生的干扰素- α的量，其中该量小于1. Opg/ml则表示受试体可能对非CpG疗法没有 反应。在一个实施方案中，该量小于0. 5pg/ml表示受试体可能对非CpG疗法没有反应。在一个实施方案中，所述非CpG疗法包括干扰素-α。在另一个实施方案中，所述 非CpG疗法包括病毒唑。在其它的实施方案中，所述干扰素-α是聚乙二醇化的IFN-a。在一些重要的实施方案中，所述CpG免疫刺激核酸是A类或C类CpG免疫刺激核 酸。在其它实施方案中，将所述外周血单核细胞进一步暴露于抗病毒试剂和CpG免疫 刺激核酸中。所述抗病毒试剂可以是干扰素_α，但不限于此。在一个实施方案中，所述干 扰素_ α是干扰素_ α _2b，干扰素_ α -2a或复合干扰素_ α。在一个实施方案中，所述外周血单核细胞包括树突状细胞。在另一个实施方案，所 述树突状细胞是类浆细胞的树突状细胞。在另一个实施方案中，所述丙型肝炎病毒感染是急性丙型肝炎病毒感染。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括确定HCV的基因型。在另一个方面，提供了一种鉴别具有HCV感染并且可能对非CpG疗法没有反应的 受试体的方法，包括使从具有丙型肝炎病毒感染的受试体收集到的外周血单核细胞暴露于 A类或C类CpG免疫刺激核酸中，测定这些细胞产生的干扰素_ α，并测定每个树突状细胞 产生的干扰素-α的量，其中该量小于1. Opg/ml则表示受试体可能对非CpG疗法没有反 应。在另一个方面，本发明提供了一种治疗具有丙型肝炎病毒感染的受试体的方法， 包括给根据上述方法鉴别的受试体施用有效量的能治疗所述感染的CpG免疫刺激核酸。在一个实施方案中，所述方法进一步包括给所述受试体施用干扰素-α。在一个实 施方案中，所述干扰素_ α是干扰素_ α _2b，干扰素_ α -2a或复合干扰素_ α。在一个实施方案中，用于治疗所述受试体的CpG免疫刺激核酸是A类CpG免疫刺 激核酸，B类CpG免疫刺激核酸，或C类CpG免疫刺激核酸。在另一个实施方案中，所述CpG免疫刺激核酸包括骨架修饰。在一个相关的实施 方案中，所述骨架修饰是硫代磷酸酯骨架修饰。在另一个实施方案中，所述CpG免疫刺激核 酸包括半柔性骨架。在一个实施方案中，所述丙型肝炎病毒感染是慢性丙型肝炎病毒感染。在另一个 实施方案中，所述丙型肝炎病毒感染是急性丙型肝炎病毒感染。本发明的每一个限定都包括本发明的不同的实施方案。因此本发明的涉及任何一个要素或要素组合的每一个限定都包括在本发明的每一个方面中。本发明的这些方面和其它方面将在下面更详细描述。附图简述

图1显示了 HCV感染和正常的PBMC在受到3类CpG刺激以后对IFN- α的诱导。 将正常的或HCV感染的受试体的PBMC与不同类的CpG —起培育48小时。收集细胞上清， 用商业ELISA试剂盒检测IFN- α分泌。黑色条显示出了 10个正常受试体和10个HCV感 染的受试体的平均IFN-α分泌。图2显示了从慢性HCV携带者和正常受试体新鲜分离的PBMC的流式细胞分析。 从HCV感染受试体和正常健康供体的血液中分离PBMC并用荧光标记的抗类浆细胞的树突 细胞(PDC)抗体进行免疫染色。用流式细胞仪对细胞进行分析，将结果与相同受试体受到 CpG刺激的IFN-α分泌进行比较。图3显示了用C类和柔性C类寡核苷酸刺激PBMC对IFN-α的诱导。将来自正 常的或HCV感染受试体的PBMC与不同类的CpG —起培育48小时。收集细胞上清，用商业 ELISA试剂盒检测IFN-α分泌。黑色条显示出了 10个正常受试体和10个HCV感染的受试 体的平均IFN-α分泌。图4显示了用一组半柔性C类CpG刺激以后对IFN- α的诱导。将分离自5个HCV 感染受试体的PBMC与一组半柔性C类CpG —起培育48小时。收集细胞上清，用商业ELISA 试剂盒检测IFN- α分泌。黑色条显示出了 5个HCV感染受试体的平均IFN- α分泌。图5显示了用三类CpG刺激以后的IFN-Y分泌。将来自正常或HCV感染受试体的 PBMC与不同类的CpG —起培育48小时。收集细胞上清，用商业ELISA试剂盒检测IFN-γ 分泌。黑色条显示出了 10个正常受试体和10个HCV感染的受试体的平均IFN- γ分泌。图6显示了用一组半柔性C类CpG刺激以后对IFN- γ的诱导。将分离自5个HCV 感染受试体的PBMC与一组半柔性C类CpG —起培育48小时。收集细胞上清，用商业ELISA 试剂盒检测IFN-Y分泌。黑色条显示出了 5个HCV感染受试体的平均IFN-Y分泌。图7显示了用三类CpG刺激以后的ΙΡ-10分泌。将来自正常或HCV感染受试体的 PBMC与不同类的CpG —起培育48小时。收集细胞上清，用商业ELISA试剂盒检测ΙΡ-10分 泌。黑色条显示出了 10个正常受试体和10个HCV感染的受试体的平均ΙΡ-10分泌。图8显示了 CpG对于B细胞增殖的作用，将来自HCV感染的或正常的供体的PBMC 与A类、B类或C类CpG —起培育5天。然后用3H-胸苷脉冲标记16到18小时，然后测定 放射活性。将其值表示成与培养基对照相比的刺激指数(Si =与CpG —起培育的cpm/与 培养基单独培育的细胞的cpm)。图9显示了半柔性C类CpG对于B细胞增殖的作用。将来自5个HCV感染受试体 的PBMC与A、B、C和半柔性C类CpG —起培育5天。然后用3H-胸苷脉冲标记16到18小 时，然后测定放射活性。将其值表示成与培养基对照相比的刺激指数(Si =与CpG—起培 育的cpm/与培养基单独培育的细胞的cpm)。图10显示了用三类CpG刺激以后的IL-10分泌。将来自正常或HCV感染受试体 的PBMC与不同类的CpG —起培育48小时。收集细胞上清，用商业ELISA试剂盒检测IL-10 分泌。黑色条显示出了 10个正常受试体和10个HCV感染的受试体的平均IL-10分泌。图11显示了病毒唑和CpG单独使用或与内含子A(IntronA)组合使用刺激HCV感
7染细胞以后的IFN-α分泌。将来自10个HCV感染受试体和10个正常健康供体的PBMC与内 含子A(Intr0n Α)，单独的以及加入或不加内含子A(Intron Α)(—种纯化的外源IFN-α ) 的病毒唑或C类CpG —起培育48小时。收集细胞上清，用商业ELISA试剂盒检测IFN-α 分泌。将每个受试体单独使用内含子A (Intron A)时检测到的IFN-α量设置为背景，从相 同受试体的内含子A(Intron A)，病毒唑+内含子A (Intron A)和C类+内含子A (Intron A)的数据中减去该背景然后绘图。正常受试体和HCV受试体的平均值分别用黑色和白色条 框表示。图12显示了 CpG和内含子A(Intron A) 一起对HCV感染细胞的IFN- α分泌的协 同作用。将来自15个HCV感染受试体的PBMC与单独使用的或与内含子A (Intron A)( — 种纯化的外源IFN-α) —起使用的C类CpG培育48小时。收集细胞上清，用商业ELISA试 剂盒检测IFN-α分泌。检测每个受试体单独使用内含子A (Intron A)时的IFN-α量，从 相同受试体的CpG+内含子Adntron A)数据中减去该值，然后绘图。应当了解这些附图并不是实施所要求保护的发明所必需的。发明详述根据本发明，发现CpG寡核苷酸可以以激活健康受试体PBMC的类似的方式激活 来自HCV慢性感染的受试体，包括那些用以前的干扰素-α (IFN-α)治疗失败的受试体的 PBMC0发现内源IFN-α分泌受到类浆细胞的树突细胞(PDC)的强烈诱导，认为这是由于 HCV感染导致其丧失功能以及对其它刺激反应的能力降低。在一些实例中，发现能在健康志 愿者的PBMC中诱导高水平IFN- α的A和C类CpG能够在pDC中诱导最高水平的IFN- a。 进一步发现半柔性C类CpG ODN在这种作用中特别有效。在一些实施方案中这些ODN是优 选的，这是因为它们不会在肾脏中积累，可以重复给药。根据本发明进一步发现外源IFN-a (内含子Adntron A))和病毒唑单独使用或 组合使用时，对正常受试体或HCV慢性携带者都没有可检测到的直接免疫刺激效果。但是， 当内含子A(Intron A)和CpG ODN(例如B类或C类)一起使用的时候，在IFN-α的产生 上观察到强烈的协同作用。这些结果表明CpG ODN单独使用或者和IFN- α 一起使用都可有效治疗慢性HCV 感染。基于这些发现，本发明提供了用于预防和治疗HCV感染的方法和产品。慢性感染至少部分是由于HCV的快速突变，这导致产生了类物种，避开了免疫监 测(10，11)。在慢性感染的个体中可以同时检测到体液和细胞介导的免疫(CMI)反应。虽 然中和抗体对于保护防止感染是非常重要的，但是当感染发生以后，细胞介导的免疫(CMI) 在病毒清除中具有主要作用。在一个方面，本发明提供了一种治疗受到丙型肝炎病毒(HCV)感染的并且用以前 的非CpG疗法不能成功治疗的受试体的方法。所述方法包括给需要这种治疗的没有反应的 受试体施用有效量的能抑制所述感染的CpG免疫刺激核酸。这里所说的非CpG疗法是一种用非CpG免疫刺激核酸的活性或者非活性的化合物 进行的治疗。在不同的实施方案中，所述非CpG疗法包括干扰素-a。通常是将聚乙二醇化 的IFN- α给HCV受试体(例如人HCV受试体)施用，优选与病毒唑和任选的金刚胺组合使 用。所述干扰素-α可以是干扰素-a_2b，干扰素-a-2a或复合干扰素-a。所有上述干扰素-α治疗都包括在非CpG疗法的定义中。用以前的非CpG疗法不能成功治疗的受试体是指虽然事先进行了治疗但是在治 疗停止后6个月在他们的血管中还具有可检测到的病毒的受试体。这些受试体包括那么对 事先的非CpG疗法有反应，但是不能控制感染和后来的复发，还可以检测到病毒的受试体。 为了简便起见，这里所说的这些受试体称为“无反应者”，但是应当理解此术语是在本文中 定义的，并不是临床术语。换句话说，虽然在临床术语中“无反应者”仅仅是指狭义的对治 疗没有任何反应的受试体，但在本发明中是广义的，指虽然对或许事先的治疗具有一定水 平的反应，但是不能成功治疗的受试体。成功治疗的受试体是指在治疗停止后6个月在其 血管中没有可检测到的病毒的受试体。成功治疗是指该治疗能够使得在治疗停止后至少6 个月在血管中都不能检测到病毒。应当理解这里所述的无反应者隐含的也指受到HCV的慢 性感染。当用CpG核酸进行治疗的时候，所述方法可成功治疗受试体。用CpG成功治疗受 试体定义为在停止治疗后6个月将血管中的病毒减少到检测不到的水平。有趣的是，在CpG 治疗期间或刚结束时都观察不到病毒的减少，只是在治疗以后随着时间的推移才减少，最 终的结果是在治疗停止后6个月这些受试体的血管中没有可检测到的病毒。因此治疗感 染是指将受试体血管中的病毒减少到检测不到的水平，并使此水平在治疗停止后维持6个 月。因此施用有效量的试剂以达到此最终效果。在一些实施方案中，可以按预期的鉴别可能的无反应者(即在用非CpG疗法进行 体内治疗之前)，并且本发明提供了不仅用于鉴别这些受试体而且用于治疗他们的方法。可 以通过评估他们对CpG免疫刺激核酸，特别是A类和C类发生反应的能力来鉴别可能的无 反应者。对CpG免疫刺激核酸反应的能力可以通过在HCV感染受试体中每个pDC产生的 干扰素-α的量来评估。根据本发明，发现可以在接受治疗之前鉴别可能对非CpG疗法例 如IFN-α治疗没有反应的HCV感染受试体。在体内治疗之前鉴别这种受试体的可能性避 免了非必需的治疗，使受试体处于治疗上有利的境况，用单独使用的或与其它包括但不限 于IFN-α的抗HCV治疗一起使用的本发明的CpG免疫刺激核酸治疗。由于不用经受不成 功的治疗，这些受试体受到的细胞毒性效果较少，病毒生长的时间也减少。每个PDC诱导的 IFN-α在合理水平以下的受试体可能无法用IFN-α成功治疗，因此可用本文提供的方法 治疗。对IFN-α的诱导和pDC数目的测定在实施例中将更详细描述。应当理解可成功用本文所述的任何治疗试剂和方法进行治疗的HCV感染受试体 可能在其体内还有病毒。但是即使受试体不能完全消除病毒，也能够控制病毒(至检测不 到的水平)。虽然不希望受到任何特定理论的限制，在受试体中维持检测不到的病毒水平涉 及到能控制病毒复制和传播的免疫系统。根据本文的教导本领域普通技术人员能够确定受试体对于IFN-α治疗是否是 “无反应者”。在一个实施例中，如果在实施例所述的培养条件下用A类核酸例如SEQ ID NO 1的核酸诱导IFN-α，那么具有正常反应表示对IFN-α治疗的反应能力至少是lpg/ml每 PDC0少于此量则表示一些pDC丧失功能。少于0. 5pg/ml每pDC的量表示对IFN- α治疗 没有反应的可能性较高。本领域普通技术人员能够确定检测中使用的特定类型核酸的分界 值，因而能够(至少)在实际治疗受试体之前鉴别用IFN-α治疗不能成功治疗的受试体。在其它的实施方案中，鉴别可能对于非CpG疗法(例如IFN-α治疗)没有反应法进一步包括鉴别他/她所感染的HCV的基因型。例如，很可能感染基因型 1的HCV的受试体用IFN-α治疗不能成功治疗。因此，除了评价受试体中每个DC产生的 IFN-α，还可以确定他们的HCV基因型(用本领域已知的方法)，这些信息组合起来可用于 鉴别可能对于IFN-α治疗没有反应的受试体。进一步应当了解在一些方面，本发明提供了一种鉴别可能用非CpG疗法不能成功 治疗(实际上并没有用非CpG疗法来治疗受试体)的受试体，然后用单独使用的或者与抗 病毒试剂例如但不限于IFN-α组合使用的CpG免疫刺激核酸治疗所述受试体。上述方法还可以用于检测受试体对于特定CpG免疫刺激核酸的反应性。在其它实施方案中，所述方法进一步可以包括鉴别曾经接受过非CpG疗法但没有 成功的受试体的步骤。根据本文给出的教导，本领域普通技术人员能够鉴别这些受试体。在 一个实施例中，这种受试体在治疗停止之后6个月血管中还具有可检测到的病毒。在一些 实施方案中，还可以证明这些受试体在治疗刚刚结束的时候病毒减少，但是不能维持这种 减少。本发明涉及用单独使用的或者与其它活性试剂例如曾经描述过的用于HCV感染 的试剂组合使用的CpG免疫刺激核酸治疗那些用以前的非CpG疗法不能成功治疗的受试 体。从广义上来讲，CpG免疫刺激核酸是指具有至少一个CpG 二核苷酸基序的核酸，其中 至少所述二核苷酸的C是未甲基化的。CpG免疫刺激核酸包括但不限于A类，B类和C类 CpG免疫刺激核酸，如本文中以及在本文所引用的并引入作为参考的专利和专利申请中所 述的。这些类的CpG免疫刺激核酸具有不同的性质和活化模式。在重要的实施方案中，所述CpG免疫刺激核酸是C类免疫刺激核酸。根据本发明， 令人惊讶地发现，虽然这类核酸的性质在A类和B类之间，但C类免疫刺激核酸在一些实施 方案中是优选的。本文提供的实施例证明了虽然用以前非CpG疗法不能成功治疗的慢性感 染受试体的PDC本身感染了 HCV因而在某些方面丧失了功能，但是将这些细胞暴露于CpG 免疫刺激核酸，特别是C类免疫刺激核酸中，能保留其功能。在一些实施方案中，优选所述 C类免疫刺激核酸是“柔性”或“半柔性”变体，本文中将会有详细描述。在一些优选的实施 方案中，所述CpG免疫刺激核酸是半柔性C类免疫刺激核酸。在其它方面，所述CpG免疫刺激核酸可与活性试剂组合使用，所述活性试剂优选 包括那些曾经描述过的用于HCV治疗的。CpG免疫刺激核酸与干扰素-α (例如内含子 Adntron A))的一起使用具有特别重要的意义。可以与本发明的CpG免疫刺激核酸组合使 用的干扰素包括但不限于干扰素-a _2b，干扰素-a _2a或复合干扰素-α。其它抗病毒剂 如本文所述。这些组合中可以使用任何类型的CpG。在一个实施例中，根据本发明，出人意 料地发现虽然外源给予干扰素_ α不能成功治疗这些受试体，但是当其与CpG免疫刺激核 酸一起使用的时候，却能有效治疗。在一些实施方案中，所述CpG免疫刺激核酸是C类免疫 刺激核酸。在一些优选的实施方案中，其是半柔性C类核酸。所述CpG核酸和抗病毒试剂(例如干扰素_ α )的给药时间随受试体和感染的严 重性而不同。所述CpG核酸可以与所述CpG免疫刺激核酸基本上同时给药。这意味着这两 种制剂可以在给药前混和，或者可以在给药过程中混和(例如都递送到受试体的静脉中)， 或者它们可以分别给药但是在可以进行两次给药的时间内操作(例如给受试体注射两次 的时间)。不管所述制剂是基本上同时给药还是以间隔方式给药，顺序都可以变化。相应
10地，在一些实施方案中，所述CpG免疫刺激核酸可以在抗病毒试剂例如IFN-α之前给药，而 在另一些实施方案中可以在抗病毒试剂之后给药。当CpG核酸和其它抗病毒剂(例如IFN-α) —起使用的时候，这些化合物可以以 治疗有效的组合量给药。因此每种化合物的量都可以是低剂量的或超剂量的(即在单独给 药的治疗有效量之下或之上)。另外，所述化合物每种都可以以治疗有效量给药，而这些制 剂的组合会产生治疗上的好处，例如减少副作用。在优选的实施方案中，如果抗病毒剂是 IFN-α，其以治疗有效量给药。不管实际给药的量是多少，制剂的组合都具有协同作用。协 同反应是指比制剂的组合所能预期的附加作用还要大的作用。在其它方面，与上述描述一致，本发明提供了检测CpG核酸刺激分离自慢性感染 HCV并且用非CpG疗法不能成功治疗或者对于非CpG疗法是无反应者的受试体的免疫细胞 的能力。这种检测方法通常是在体外操作，使外周血单核细胞(PBMC)与有效量的能刺激免 疫反应的CpG免疫刺激核酸接触。所述免疫反应可以通过许多标记检测，例如IFN-α的产 生，B细胞刺激，细胞因子例如IL-6，IL-10, IL-12，干扰素-γ，1类干扰素(α + β )的分泌， 趋化因子的分泌例如IP-10，NK活性，共刺激分子(例如CD80，CD 86)以及成熟分子(例如 ⑶83)的表达以及II类MHC表达的正调控。在一些重要的实施方案中，所述免疫细胞是树突状细胞，优选是类浆细胞的树突 状细胞(PDC)，所述免疫反应标记对这些细胞类型是特异的。其包括但不限于共刺激分子 (例如⑶80和⑶86)的表达，成熟分子(例如⑶83)的表达，IL-12和1类干扰素(α + β ) 的表达和/或分泌，以及II类MHC表的的正调控。应当理解这些体外检测和树突状细胞例 如pDC与PBMC其余部分的分离没有关系。甚至所述检测也可以在均质的PBMC群体中进行。在另一个方面，本发明提供了一种鉴别具有丙型肝炎病毒感染的受试体的方法， 以用CpG免疫刺激核酸进行治疗。所述方法包括使从具有丙型肝炎病毒感染的受试体中收 集的外周血单核细胞暴露于i) 一种CpG免疫刺激核酸，和ii) 一种CpG免疫刺激核酸和一 种抗病毒剂(例如干扰素-α)中，并测定外周血单核细胞的反应。对CpG免疫刺激核酸产 生反应表明可以在非CpG疗法之后对受试体进行CpG免疫刺激核酸治疗或者取代之(如上 所述，但只是在鉴别了对非CpG疗法可能没有反应的受试体之后)。对CpG免疫刺激核酸 和抗病毒剂(例如干扰素-α)的组合的反应比对单独的CpG免疫刺激核酸的反应大表示 受试体应当用这种组合治疗。如本文所述的，所述抗病毒试剂可以是干扰素_α，包括但不 限于干扰素-a _2b，干扰素-a _2a或复合干扰素-α。优选所述外周血单核细胞包括树突 状细胞例如类浆细胞的树突状细胞。本发明进一步包括用单独的CpG免疫刺激核酸或其与 抗病毒试剂(例如干扰素-α)的组合对如上所述鉴别的受试体的治疗，这取决于检测的结 果。临床策略包括将这些核酸进行局部的和系统的体内给药，或者离体策略，其中分离自没 有反应的HCV感染受试体的pDC在体外用免疫刺激核酸激活，然后重新局部地或系统地输 入到受试体中。这些治疗策略可以包括与其它生长因子(IL-3，GM-CSF，flt3-配体等)，或 者与其它刺激源(超抗原，病毒产物)的组合。由于天然干扰素-α是一个家族，具有多于 一打的单独的基因产物，其中每个产物都具有独特的活性模式，天然干扰素的临床使用优 选与衍生自单一的重组IFN-α基因的重组IFN-α相比较。本发明进一步提供了一种激活来自丙型肝炎感染受试体的pDC的方法。所述方法 包括分离需要治疗的受试体的PDC，体外培养所述分离的pDC，使所述pDC在体外与有效量
11的分离的免疫刺激核酸接触，使接触过的细胞返回到受试体体内。所述细胞还可以在体外 与生长因子或细胞因子接触。根据本发明的这个方面，用IFN-α进行治疗所需的免疫刺激 核酸和条件如上所述。IFN-α本身代表了一个家族，包括多于一打的相关的同源蛋白(异构体，参 见下述表1)，其中每一个都由不同的基因编码，每一个都显示出独特的活性模式。不 同种类的α-干扰素对于病毒的活性可能会差20倍或更多。用于临床使用的IFN-a 产物是重组蛋白或高度纯化的单纯异构体的天然蛋白。在美国可以获得的IFN-α是 重组人IFN- α 2a (R0FER0N-A)，重组人IFN- α 2b (内含子A (INTRON A)),以及纯化 的天然IFN- α n3 (ALFERON N)。在美国之外，还可以得到的IFN- α是纯化的天然 IFN- αnl(WELLFERON)。表1.人 IFN-α 家族
权利要求
免疫刺激核酸，其包含以下序列TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG(SEQ ID NO13)。
2.权利要求1的免疫刺激核酸，其中所述免疫刺激核酸包含硫代磷酸酯骨架修饰。
3.权利要求2的免疫刺激核酸，其中所述核酸具有以下序列TCGTCGTTTTAC_GGC_GCC_ GTGCCG(SEQ ID NO 13)，其中“_”表示磷酸二酯核苷酸间连接，所有其它核苷酸间连接是硫 代磷酸酯。
4.权利要求2的免疫刺激核酸，其中所述核酸具有以下序列TCGTCG_TTTTAC_GGCGCC_ GTGCCG(SEQ ID NO 14)，其中“_”表示磷酸二酯核苷酸间连接，所有其它核苷酸间连接是硫 代磷酸酯。
5.权利要求2的免疫刺激核酸，其中所述核酸具有以下序列TCGTC_GTTTTAC_GGCGCC_ GTGCCG(SEQ ID NO 15)，其中“_”表示磷酸二酯核苷酸间连接，所有其它核苷酸间连接是硫 代磷酸酯。
6.组合物，其包含处于药学可接受的溶液或载体中的权利要求1至5任一项的免疫刺激核酸。
7.权利要求1至5任一项的免疫刺激核酸，用于治疗患有慢性HCV感染的受试者。
全文摘要
本发明提供了鉴别和治疗具有丙型肝炎感染的受试体的方法。在一些实施例中，受试体是对非CpG疗法没有反应的受试体。优选地，所述受试体用具有半柔性骨架的C类CpG免疫刺激核酸治疗。
文档编号A61K38/21GK101948835SQ20101026269
公开日2011年1月19日 申请日期2003年10月29日 优先权日2002年10月29日
发明者乔格·沃尔默, 内维内特·K·阿洛阿莱, 苏珊·M·埃弗利, 赫西·L·戴维斯 申请人:科勒制药集团股份有限公司;科勒制药股份公司