专利名称：间充质干细胞的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及间充质干细胞的新用途。
背景技术：
间充质干细胞是一类最早在骨髓中被发现的干细胞，随后在全身多处组织中被分 离鉴定出来。间充质干细胞在体外可以大量扩增，在体内可以分化为多种组织细胞。另外， 间充质干细胞还能够支持造血和抑制免疫反应。基于以上优点，它已经成为组织工程、细胞 治疗和干细胞技术等方面的重要种子细胞，具有广阔的应用前景。目前，间充质干细胞已经 被用于治疗糖尿病，急性肾衰竭，脓毒血症，心肌梗塞，皮肤移植排异和肝衰竭等疾病。破骨细胞是一类起源于造血干细胞的成体细胞，它们大部分贴附于骨表面，可以 分泌多种酸和溶解酶来降解骨组织。破骨细胞的作用具有双面性在机体代谢稳定时，只有 少量的破骨细胞生成，进而与成骨细胞一起，参加骨组织的新陈代谢。当机体处于疾病状态 时，大量的破骨细胞生成，参与机体应激反应，炎性损伤以及肿瘤骨转移等病理过程。因此， 寻找调节破骨细胞的发育异常和功能紊乱的有效方法，是一项治疗相关疾病的重要策略。脂多糖炎性损伤小鼠是一种体内破骨细胞生成的动物模型。给予小鼠输注脂多 糖后，其体内各种免疫细胞(如淋巴细胞和巨噬细胞等)发生活化，相应炎性细胞因子如 TNF-α，IL-I β分泌增加，破骨细胞的生成显著活跃，骨质破坏作用增强。
发明内容
本发明的一个目的是提供间充质干细胞的一种新用途。本发明所提供的一种新用途是离体的间充质干细胞在制备具有抑制破骨细胞生 成功能的产品中的应用。上述应用中，所述间充质干细胞为骨实质来源的间充质干细胞。上述应用中，所述产品为药物。本发明所提供的另一种新用途是离体的间充质干细胞在制备具有治疗和/或预 防骨疾病功能的产品中的应用。上述应用中，所述间充质干细胞为骨实质来源的间充质干细胞。
上述应用中，所述骨疾病为骨质疏松症。上述应用中，所述产品为药物。上述任一所述的间充质干细胞可从商业途径得到，也可以自己分离制备，可为骨 髓来源的，也可以为骨实质来源的。本发明发明人基于对间充质干细胞特性的认识，选择了脂多糖炎性损伤小鼠来研 究间充质干细胞对于体内破骨细胞生成的调节作用。结果表明间充质干细胞可以抑制炎性 微环境中破骨细胞的生长。本发明拓展了间充质干细胞的用途，建立了一种利用间充质干 细胞调节体内破骨细胞活动的方法，在骨疾病预防和治疗领域将有广阔的应用前景。
图1为细胞免疫表型分析。图2为成骨分化鉴定结果。图3为成脂分化鉴定结果。图4为成软骨分化鉴定结果。图5为各组切片染色结果。图6为分别注射了磷酸盐缓冲液、脂多糖、脂多糖联合间充质干细胞的小鼠体内 破骨细胞数量的比较。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明所有动物实验严格尊重军事医学科学实验动物指南进行。实施例1、小鼠间充质干细胞的分离培养C57BL/6雌性小鼠购自军事医学科学院实验动物中心。二型胶原酶购自Sigma公 司。α -MEM培养基从Hyclone公司购得。谷氨酰胺从Sigma公司购得。取2周龄健康C57BL/6雌性小鼠，脱颈处死，75%酒精浸泡5分钟后，无菌条件下 分离小鼠股骨和胫骨，去净表面组织，以注射器吸取含10%体积胎牛血清(从Hyclone公 司购得)的磷酸盐缓冲液(氯化钠8g/L，磷酸氢二钠2. 9g/L，氯化钾0. 2g/L，磷酸二氢钾 0. 24g/L，溶剂为去离子水)冲净骨髓腔，小心剪碎为大小为2mm3细小骨片，置细胞培养基 I中[细胞培养基I由二型胶原酶、胎牛血清和α-MEM培养基组成，二型胶原酶在细胞培 养基I中的浓度为0.15% (质量百分比)，胎牛血清在细胞培养基I中的浓度为20% (体 积百分比)]，在37°C、5% C02条件下消化1小时后种骨片于细胞培养基II中[细胞培养 基II由谷氨酰胺、胎牛血清和α -MEM培养基组成，谷氨酰胺在细胞培养基II中的浓度为 2mmol/L,胎牛血清在细胞培养基中的浓度为10 % (体积百分比)]，在为37°C、5 % C02条件 下培养72小时后，首次换液(用细胞培养基II替换旧液)，去除悬浮细胞，保留骨片，从骨 片中生长出的细胞长满80%培养瓶面积后消化传代(用细胞培养基II传代培养)，连续传 代，取第4-6代细胞做体内注射用。间充质干细胞的鉴定按照文献方法(Zhu H，Guo ZK, Jiang XX，Li H，Wang XY, Yao HY, Zhang Y, Mao N. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cellsfrom mouse compact bone. Nature Protocols. 2010 ；5 (3) :550_560·)进行所得小鼠 间充质干细胞的鉴定。即(一)、MSCs的细胞免疫表型分析1、准备细胞以胰酶消化收获第四代细胞，制备成单细胞悬液，调整细胞数量至 1 X IO6细胞/EP管，洗净后重悬至100 μ LPBS/EP管。2、抗体标记按照说明书要求，如表1. 1所示，分别加入FITC标记的抗小鼠 CDllb, CD45 和 Sca-I，PE 标记的抗小鼠 CD29，CD31, CD34, CD44, CD86, CD105, Ia 和上述抗 体相对应的同型抗体。4°C避光孵育30分钟。同时避光染PI，15分钟。表1. 1 MSCs免疫表型分析相关抗体及应用
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对应缩写Armenian Hamster IgG = Armenian Hamster immunoglobulin G, 亚美尼亚仓鼠免疫球蛋白G ;CD = cluster of differentiation,分化群；FITC = fluorescein isothiocyanate,异硫氰酸焚光素；PE = phycoerythrin,藻红素；Rat IgG = rat immunoglobulin G,大鼠免疫球蛋白 G ;Sca_l = stem cell antigen-1,干细胞抗原 1 ；3、流式分析用PBS，4°C，300G，8分钟，洗细胞两遍后，上机分析。结果如图1所示。PI染色，用于流式分析的MSCs活细胞比率大于95%。利用流式 细胞术分析小鼠骨实质来源MSCs的免疫学表型，发现其具有经典的MSCs表型特点。高表 达干细胞标记Sca-I和⑶105 ；间质标记CD29和⑶44，低表达或者不表达造血标记⑶11b， ⑶34和⑶45 ；内皮标记⑶31 ；共刺激分子⑶86和la。从表型特点上判断，小鼠骨实质来源 的MSCs是一群非造血非内皮间质来源的干细胞。(二)、MSCs的多向诱导分化及鉴定1、成骨分化1)成骨诱导收获第四代MSCs，按照IXlO4/孔种于24孔培养板内，对照组培养 体系为α -MEMUO % FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素，诱导组培养体系为对照组体系 添加表1. 2中诱导剂。每2-3天换液。表1. 2成骨诱导体系
2)碱性磷酸酶染色诱导第14天，去除培养基；向培养板内加入固定液(柠檬酸 40 μ L+去离子水2mL+丙酮3mL)固定30秒；向培养板内加入染色液(坚牢兰RR 62. 5 μ L+ 去离子水3mL+As-MX 125 μ L)；避光反应30分钟；倒掉染液，加少量PBS，显微镜下照相。3) Von Kossa染色诱导第28天，去除培养基；加入4%多聚甲醛固定30分钟；洗 去固定液，加入5%硝酸银溶液，强光下反应30分钟；洗净后，加入5%硫代硫酸钠溶液，反 应5分钟；洗净后，显微镜下拍照。结果(图2a)成骨诱导14天，MSCs中的碱性磷酸酶活性显著上调，染色后成红 色；(图2b)继续成骨诱导到28天，有明显的骨结节形成(图中微标尺代表100 μ m)。2、成脂分化1)成脂诱导收获第四代MSCs，按照2X104/孔种于24孔培养板内，对照组培养 体系为α -MEM、10% FBS, 100U/mL青霉素、lOOU/mL链霉素，诱导组培养体系为对照组体系 添加表1. 3中诱导剂。每2-3天换液。表1. 3成脂诱导体系 2)油红O染色诱导第14天，去除培养基；向培养板内加入染色液(油红O粉剂 0. 5g+异丙醇IOOmL)；避光反应15分钟；倒掉染液，加少量PBS，显微镜下照相。结果油红O具有亲脂肪特性，(图3)诱导的第14天进行油红O染色，可见着色 的脂滴充满了胞质(图中微标尺代表100 μ m)。3、成软骨分化1)成软骨诱导收获第四代MSCs，按照IXlO6/管种于15mL塑料离心管内，对照 组培养体系为HG-DMEM、10% FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素，诱导组培养体系为对照 组体系添加表1. 4中诱导剂。在4°C，以300G离心6分钟。每2_3天换液。表1. 4成软骨诱导体系 2)甲苯胺蓝染色诱导第21天，去除培养基；取出软骨小球，10%福尔马林固定1 小时；常规蜡块包埋，做5μ M病理切片；切片脱蜡，复水；向切片上加入染色液(甲苯胺 蓝粉剂0. 5g+去离子水IOOmL)；反应15分钟；倒掉染液，去离子水洗净，显微镜下照相。结果(图4)对软骨小球进行切片染色，可以看到丰富的细胞外基质呈环形包裹 着细胞小球，甲苯胺蓝染色后阳性，基质中软骨细胞形态良好(图中微标尺代表200 μ m)。综合以上结果，证明分离得到的细胞就是骨实质来源的间充质干细胞。MSC鉴定所需试剂和设备如下1、MSCs免疫表型鉴定试剂抗体均为eBioscience公司产品-FITC-Iabeled anti-stem cell antigen-1(Sca_l)-FITC-Iabeled anti-CD lib-PE-Iabeled anti_CD29-PE-Iabeled anti_CD31-PE-Iabeled anti_CD34-PE-Iabeled anti_CD44-FITC-Iabeled anti_CD45-PE-Iabeled anti_CD86-PE-Iabeled anti_CD105-PE-Iabeled anti-la-FITC-Iabeled rat IgG2b isotype control-PE-labeled rat IgG2b isotype control-PE-labeled Armenian Hamster IgG isotype control-FITC-Iabeled rat IgG2a isotype control-PE-labeled rat IgG2a isotype control碘化丙啶(Propidiumiodide, PI)为 Sigma 公司产品。
2、MSCs诱导分化及鉴定试剂l)MSCs诱导分化试剂高糖-DMEM(HG-DMEM)培养基为Hyclone公司产品，地塞米松、维生素C磷酸盐、 β -磷酸甘油、IBMX、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠和丙酮酸盐为Sigma公司产品，TGF-β 3为 R&D公司产品。2)鉴定试剂油红0染液、碱性磷酸酶检测试剂盒、硝酸银、硫代硫酸钠和甲苯胺 蓝为Sigma公司产品。3、仪器设备25cm2/75cm2 培养瓶(corning-costar)，24 孔细胞培养板(Falcon， costar)，15mL塑料离心管(corning)，细胞培养箱(Thermo Forma)，流式细胞仪 (CoulterEPICS XL，BD)，生物净化工作台(北京中化生物技术研究所/伟达净化技术研 究所，X90-3)，倒置显微镜(Olympus)，DNA thermal cycler (Perkin-Elmer)，台式离心机 (Beckman)，低温高速离心机(GS-1 5R Beckman)，分光光度计(BIO-RAD)，解剖剪，解剖镊， 无菌纱布，0. 4mmlmL注射器，1. 5mL EP管，35mm和IOOmrn玻璃平皿。实施例2、构建体内破骨细胞生成的模型脂多糖购自Sigma公司，产品目录号为L2630;健康BALB/c小鼠购自军事医学科 学院实验动物中心；取6-8周健康BALB/c小鼠，把50 μ g脂多糖溶解于200 μ L磷酸盐缓冲液内，得 到脂多糖溶液；将脂多糖溶液经腹腔注射到小鼠体内，正常饲养1小时后，得到炎性损伤小 鼠；取实施例1中获得的第4-6代间充质干细胞，经尾静脉输入炎性损伤小鼠体内，正常饲 养5天后，检测小鼠体内破骨细胞的生成数量。试验分Α，B，C三组A组(PBS):单只小鼠注射200 μ L磷酸盐缓冲液，不注射间充质干细胞；B组(LPS)单只小鼠注射脂多糖溶液(注射剂量200 μ L/只)，不注射间充质干 细胞；C组(LPS+MSCs)单只小鼠注射脂多糖溶液(注射剂量200 μ L/只)，1个小时后， 注射间充质干细胞(注射剂量1XIO6个间充质干细胞/只)。检测小鼠体内破骨细胞的生成数量的方法如下(1)小鼠股骨切片的制备本发明所有动物实验严格遵守军事医学科学实验动物指南进行。间充质干细胞注 射5天后，将小鼠脱颈处死，75%酒精浸泡5分钟后，无菌条件下取出股骨和胫骨，以脱钙液 IOmL固定2天，石蜡包埋，切5 μ m厚的组织切片，脱蜡，复水。(2)抗酒石酸的酸性磷酸酶染色用抗酒石酸的酸性磷酸酶测定试剂盒(Sigma-Aldrich产品)对各组切片进行染 色，光学显微镜下观察破骨细胞形态拍照，对破骨细胞进行计数和统计学分析(T测验)。检 测细胞数量的方法1)、把切片放入固定液中作用30秒，(固定液=3mL丙酮+1. SmL去离 子水+0. 2mL柠檬酸)；2)、取出切片，加入去离子水洗三遍，空气中晾干；3)、把切片放入染 色液中，避光，37°C，染一小时(染色液=3. 9mL去离子水+0. 2mL酒石酸+0. 2mL萘酚磷酸 盐溶液+0. 2mL醋酸溶液+0. 5ml染色胶囊溶液)；4)、取出切片，加入去离子水洗三遍；5)、 切片中深酒红色的细胞判定为抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性，为破骨细胞。在显微镜下对贴附于骨小梁及骨内膜表面的破骨细胞进行拍照，计数。各组的切片染色结果如图5所示(图中微标尺代表100 μ m。)。结果采用间充 质干细胞能有效地抑制脂多糖炎性损伤小鼠体内的破骨细胞生成。破骨细胞数量统计学分析结果如图6所示ΓΡ < 0. 05，具有统计学意义)。结果 与没有给予间充质干细胞的脂多糖小鼠炎性损伤相比较，输入间充质干细胞的脂多糖炎性 损伤小鼠股骨切片上的破骨细胞显著减少，说明间充质干细胞显著的抑制了体内破骨细胞 的生成。PBS本身是一种不具有生物活性的缓冲液，在本发明中作为脂多糖的溶剂。正常小 鼠体内应该具有生理水平的少量的破骨细胞，接受脂多糖后，破骨细胞数量大量增加。设立 PBS组实际是更为严格的对照，比采用正常小鼠作为对照更为严格，排除了注射损伤本身等 因素对体内破骨细胞活动的影响。
权利要求
离体的间充质干细胞在制备具有抑制破骨细胞生成功能的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述间充质干细胞为骨实质来源的间充 质干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述产品为药物。
4.离体的间充质干细胞在制备具有治疗和/或预防骨疾病功能的产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述间充质干细胞为骨实质来源的间充 质干细胞。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于所述骨疾病为骨质疏松症。
7.根据权利要求4-6中任一所述的应用，其特征在于所述产品为药物。
全文摘要
本发明公开了间充质干细胞的新用途。该新用途是离体的间充质干细胞在制备具有抑制破骨细胞生成功能的产品中的应用。本发明拓展了间充质干细胞的用途，建立了一种利用间充质干细胞调节体内破骨细胞活动的方法，在骨疾病预防和治疗领域将有广阔的应用前景。
文档编号A61K35/32GK101919877SQ20101026257
公开日2010年12月22日 申请日期2010年8月24日 优先权日2010年7月30日
发明者张毅, 朱恒, 李红, 毛宁, 江小霞 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所