新型肿瘤靶向造影剂的制作方法

专利名称：新型肿瘤靶向造影剂的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体而言本发明提供了一种新型的肿瘤靶向分子，它是由M个蛋白亚基分子组装而成的铁蛋白，该蛋白亚基分子是人源铁蛋白的重链和轻链。它们可以按各种分子比组装而成的M个亚基的笼状空腔结构，其中至少含有重链亚基。本发明还提供该肿瘤靶向分子能特异识别并结合肝癌肿瘤；黑色素肿瘤；肺癌肿瘤；乳腺癌肿瘤；结/直肠癌肿瘤；胰腺癌肿瘤；胃癌肿瘤；卵巢癌，神经胶质瘤等恶性肿瘤组织， 本发明还提供药物组合物，其包含所述肿瘤靶向分子；本发明还提供超声成像诊断和磁共振成像诊断的造影剂，其包含所述肿瘤靶向分子。
背景技术：
随着生活水平的提高和人类平均寿命的增长，以及现代社会生活节奏的加快、生活方式的改变、环境的污染等诸多因素，癌症已经成为危害人类健康的主要杀手。我国恶性肿瘤发病情况也呈现出三个重要变化趋势，一是发病人数逐年增多明显，发病率已经较20 年前增加了 1倍以上，这种情况与某些地区环境污染日趋严重有关；二是患者人群出现两个极端，即年龄小的人群和老年人群罹患癌症人数增长最快；三是所有恶性肿瘤中，结/直肠癌在人群中发病率激增，专家指出，这与公众饮食结构的变化有关。肿瘤的靶向诊断和治疗已经成为肿瘤的诊疗领域的最重要的研究方向之一，目前常用的是靶向分子主要是利用肿瘤细胞表面特异分子的配基或者抗体作为肿瘤靶向分子， 通过基因工程或化学修饰手段将配基或抗体与其他功能分子进行偶联，从而发挥其肿瘤靶向的诊断或者治疗功能。如RGD-4C(CDCRGDCFC)多肽，该多肽可以选择性靶向结合在快速分化细胞中上调表达的integrin分子，利用integrin在肿瘤新生血管中的上调表达， RGD-4C多肽就可以作为一个肿瘤靶向配基，不少数据报道，RGD-4C多肽偶联到小的热休克蛋白或者量子点，或者偶联抗肿瘤试剂，均可以表现出肿瘤细胞靶向的特异性而发挥功能。本发明提供了一种新型肿瘤靶向分子，它就是铁蛋白(ferritin)，确切地，是必须含有铁蛋白重链亚基的铁蛋白。在进行铁蛋白作为造影剂的载体实验过程中，专利申请者发现，即使铁蛋白的外表面没有修饰携带肿瘤靶向的配基，内部腔体含有磁性氧化铁颗粒的铁蛋白照样可以迅速的靶向富集在肿瘤组织，并可以在核磁共振成像实验中将肿瘤组织清晰成像出来。这说明铁蛋白可以独立地作为肿瘤靶向分子！这种肿瘤靶向分子可以用于肝癌肿瘤、黑色素肿瘤、肺癌肿瘤、乳腺癌肿瘤、结/直肠癌肿瘤、胰腺癌肿瘤、胃癌肿瘤、卵巢癌、头颈癌、神经胶质瘤等恶性肿瘤组织的靶向诊断或治疗。铁蛋白于1937年由Laufberge从马的脾脏中分离纯化出来，具有耐稀酸 pH=2. 1、耐稀碱pH=12. 1和耐较高温度70 75°C不变性等特性。铁蛋白是由M个亚基组成高度对称性的笼状空腔结构，其分子质量450 kD，厚度约2 2. 5 nm，外径11 13 nm, 内径8 9 nm。铁核位于蛋白壳中心，由数千氢氧化铁分子和数百磷酸盐分子组成非均勻的结构，直径约7 8 nm。植物、原核生物以及非脊椎肝铁蛋白由相同亚基组成，而哺乳动物铁蛋白由重链(heavy chain, H)和轻链(light chain, L)两种亚基以不同比例组成，H亚基铁氧化酶催化活性，它能催化狗(II)氧化为!^(111)，而L链不具有这个催化活性。在铁蛋白中，由于I^e(II)氧化为!^e(III)，导致氧化铁转化为不溶性的!^e(III)核。动物铁蛋白大部分分布在肝、脾、骨髓、骨骼肌和肠粘膜中。铁蛋白的主要功能之一是调节铁代谢平衡，此外，铁蛋白在抗氧化胁迫和消除部分重金属以及一些有毒分子的毒害方面具有重要作用。现在生物技术的运用，已经将铁蛋白开发成一个可以携带各种功能分子的载体试剂， 如Masaki Uchida等通过遗传工程手段，在铁蛋白外表面连接一个RGD-4C多肽，在没有破坏铁蛋白的笼状空腔体结构基础上，铁蛋白可以在RGD-4C多肽的导向下，特异定位于肿瘤组织。本发明提供了一种新型造影剂，它突出的特点是将人源铁蛋白，特别是由含有重链亚基组装而成的人源铁蛋白，作为肿瘤靶向分子；同时由于人源铁蛋白的笼状空腔结构特点，它可以用作造影剂的载体，将造影剂包裹其中，并靶向富集到肿瘤组织。这种造影剂的特点就是几乎无毒性、低成本、颗粒小，水溶性好，高弛豫速率、靶向性强、半衰期长，体内稳定性好。这种新型造影剂可以用于肝癌肿瘤；黑色素肿瘤；肺癌肿瘤；乳腺癌肿瘤；结/ 直肠癌肿瘤；胰腺癌肿瘤；胃癌肿瘤；卵巢癌，神经胶质瘤等恶性肿瘤组织的核磁共振成像诊断。目前肿瘤的诊断方法主要包括酶学检查，免疫学检查，内窥镜检查，影像学检查等，其中影像学检查又包括X线透视、摄片、核磁共振成像、断层扫描，超声波检查，放射性核素扫描以及选择性血管造影等等，这些方法各有优势，互为补充。核磁共振(MR I)又叫核磁共振成像技术，是继CT后医学影像学的又一重大进步。自20世纪80年代应用以来， 它以极快的速度得到发展。其基本原理是将人体置于特殊的磁场中用无线电射频脉冲激发人体内氢原子核，引起氢原子核共振，并吸收能量。在停止射频脉冲后，氢原子核按特定频率发出射电信号，并将吸收的能量释放出来，被体外的接受器收录，经电子计算机处理获得图像，这就叫做核磁共振成像。在MR I发展的早期，一般认为无需使用造影剂即可完成 MR I检查诊断。随着临床上MR I的广泛应用，人们希望它能提高对软组织的分辨率，以显示一些较小的病变，使一部分疑难病变得以确诊。这就需要造影剂进一步提高磁共振影像的对比度。在临床检查时，为了提高MR I影像的分辨率和对比度，一方面力求选择适当的脉冲系列与时间参数，以更好地反映病变组织的实际大小、程度及病变特征；另一方面则致力于改变组织的MR特征参数，这方面的努力主要集中在通过使用弛豫试剂以缩短弛豫时间Tl和T2，加速弛豫速率(r)。这一类弛豫试剂就是造影剂，它能够改变体内局部组织中水质子的弛豫速率，提高正常部位与患病部位的成像对比度，从而显示体内器官的功能状态。自1983年使用Gd2DTPA进行临床试验以来，为提高造影剂的灵敏度和靶向性，降低其毒性，人们对MR I造影剂进行了大量的研发。临床应用的MR I造影剂必须满足以下几方面的基本要求(1)低毒。目前用作MR I造影剂所选用的稀土和过渡金属等顺磁性离子钆、锰、铁等，在其能改变核磁弛豫速率的浓度范围内，均有一定毒性( 高弛豫效能。 (3)靶向性强。(4)水溶性好，一般应大于0.5M，渗透压和黏度等应尽可能与血浆的相近， 因此非离子型造影剂的开发与应用具有非常重要的意义。(5)在体内稳定，易于排出体外。 在使用造影剂后的一定时间内能排出体外，不至于在人体内积累。根据磁性中心的不同， MRI造影剂可分为顺磁性物质、超顺磁性物质和铁磁性物质三大类。根据磁性物质的分子大小和颗粒形状不同，又分为小分子顺磁性造影剂、大分子顺磁性造影剂、超顺磁性粒子和铁磁性粒子、纳米结构造影剂等几类。目前临床应用的造影剂主要存在用药剂量大、肿瘤靶向性低，有一定的毒副作用等问题。随着MR新成像技术(如MR血管造影、灌注MR、扩散加权MR I等)的迅速发展及其在临床诊断中应用的普及，用于肿瘤诊断的造影剂也越来越受到重视。研制低毒性、低成本、高弛豫速率、靶向性强、体内稳定性好的造影剂是未来的发展趋势。本发明提供的新型肿瘤靶向造影剂是利用铁蛋白既作为肿瘤靶向分子又作为造影剂的载体，可以有效克服以上各种造影剂的不足。不引入其他多肽或非人源蛋白的情况下，人源铁蛋白作为人体天然存在的蛋白，将其作为造影剂不存在生物相容性问题，几乎无毒性；铁蛋白可以靶向结合到肿瘤组织，使得造影剂的用量非常少；同时铁蛋白在人体内的半衰期长，稳定性好；由于铁蛋白水溶性好，颗粒尺寸小且均勻，不团聚，而单位蛋白分子可以含有高达3000-5000磁性氧化铁分子，弛豫速率高，造影增强效果好。本发明还提供了一种肿瘤靶向药物，它突出的特点是将人源铁蛋白，特别是由含有重链亚基组装而成的人源铁蛋白，作为肿瘤靶向分子；同时由于人源铁蛋白的笼状空腔结构特点，它可以用作抗肿瘤药物的载体，将药物包裹其中，并靶向富集到肿瘤组织而发挥抗肿瘤治疗效果。这种肿瘤靶向药物的特点是肿瘤靶向性好，用量少，无或低副作用，体内稳定性好等。这种肿瘤靶向药物可以用于肝癌肿瘤；黑色素肿瘤；肺癌肿瘤；乳腺癌肿瘤； 结/直肠癌肿瘤；胰腺癌肿瘤；胃癌肿瘤；卵巢癌，神经胶质瘤等恶性肿瘤组织的靶向治疗。显而易见，铁蛋白存在于几乎所有物种中，不少物种(如大多数哺乳动物)的铁蛋白与人源铁蛋白的序列很相近，将这些来源的铁蛋白作为靶向肿瘤的分子并组装成前述造影剂或药物，也可能会具有人源铁蛋白一样或相似的功能或使用范围，只要铁蛋白的肿瘤靶向能力还在，且实践中该铁蛋白的肿瘤靶向功能被实际利用，那均是本发明专利的涵盖范畴。显而易见，利用常规的基因工程手段，可以分别表达生产人源铁蛋白的H和L亚基，并可以使用单独的H或L亚基组装成完整的含M个亚基的铁蛋白，也可以按任意比例将H和L亚基组装成完整的含M个亚基的铁蛋白。本发明的重要特点是，这些组装的铁蛋白都具备肿瘤靶向能力，均可作为肿瘤靶向分子；且随着组装的铁蛋白中重链亚基的含量越高，肿瘤靶向性越好。这类铁蛋白均可以利用于制造肿瘤靶向造影剂或肿瘤靶向药物，只要铁蛋白的肿瘤靶向能力还在，且实践中该铁蛋白的肿瘤靶向功能被实际利用，那均是本发明专利的涵盖范畴。显而易见，利用基因工程手段，如点突变，截短或连接表达其他氨基酸或多肽等等，均可以改造铁蛋白的H和L亚基，使得铁蛋白可以携带不同种类的造影剂分子或抗肿瘤分子。但只要铁蛋白的主体结构还在，其肿瘤靶向能力还在，且实践中该改造的铁蛋白的肿瘤靶向功能被实际利用，那均是本发明专利的涵盖范畴。显而易见，利用一些生物化学等手段可以将前述的各种形式的铁蛋白进行不同形式不同手段的修饰或改造，如进行PEG包裹等，其目的可以是降低免疫原性，也可以是提高其在体内的半衰期，也可以是携带各种可用于肿瘤造影或肿瘤治疗的试剂或药物，不管出于什么目的，只要那些形式的铁蛋白的肿瘤靶向能力还在，且实践中该修饰或改造后的铁蛋白的肿瘤靶向功能被实际利用，那均是本发明专利的涵盖范畴。
此外，随着科学研究的深入，铁蛋白靶向肿瘤细胞或组织的机理将会逐步阐明，最为可能的机理是肿瘤细胞表明存在特异的铁蛋白的受体蛋白，也可能是其他非受体蛋白或分子的存在，导致铁蛋白可以特异结合在肿瘤细胞或组织，可以预见，这种特异结合铁蛋白的受体蛋白或者非受体蛋白，也完全可能作为一个肿瘤标志分子，成为诊断和治疗肿瘤的靶点分子，从而设计出更新更好的肿瘤靶向造影剂或抗肿瘤药物。总之，本发明提供了一种新型肿瘤靶向分子，它就是铁蛋白，特别是人源铁蛋白。 这种肿瘤靶向分子的特点是肿瘤特异性高，广谱地适用于多种肿瘤。同时本发明还提供了含有该肿瘤靶向分子的肿瘤诊断造影剂或治疗药物，这种造影剂或治疗药物具有无或低毒性、肿瘤靶向性好、特异性强、用量少、体内稳定性高等特点，特别适用于肝癌肿瘤、黑色素肿瘤、肺癌肿瘤、乳腺癌肿瘤、结/直肠癌肿瘤、胰腺癌肿瘤、胃癌肿瘤、卵巢癌、头颈癌、神经胶质瘤等恶性肿瘤组织的靶向诊断或治疗。

发明内容
本发明的目的是提供一种肿瘤靶向分子，所述肿瘤靶向分子可与肿瘤细胞或组织特异性结合，从而可以用于制备诊断治疗肿瘤的造影剂和治疗肿瘤的药物，具体地，本发明提供以下
1. 一种肿瘤靶向分子，其特征在于，它是由M个蛋白亚基组装成的笼状空腔结构的铁蛋白，该铁蛋白可以特异靶向结合于肿瘤细胞或肿瘤组织，其结合特异性高，速度快。2.如1所述的肿瘤靶向分子，其特征在于，所述的蛋白亚基是人源铁蛋白的重链或者是人源铁蛋白的重链的基因工程改型分子。3.如1所述的肿瘤靶向分子，其特征在于，所述的单体蛋白是人源铁蛋白的轻链或者是人源铁蛋白的轻链的基因工程改型分子。4.如以上1-3所述的肿瘤靶向分子，其特征在于，所述的铁蛋白是人源铁蛋白的重链和人源铁蛋白的轻链按任意的数量比例配比组装而成的人源铁蛋白。5.如以上1-4所述的肿瘤靶向分子，其特征在于所述的铁蛋白是人源铁蛋白；所述的铁蛋白的重链是人源铁蛋白的重链；所述的铁蛋白的轻链是人源铁蛋白的轻链。6. 一种肿瘤的成像造影剂，其特征在于，它含有以上1-4项所述的肿瘤靶向分子； 以及药学上可接受的造影增强剂或缓冲液或添加剂或赋形剂，并用于肝癌肿瘤；黑色素肿瘤；肺癌肿瘤；乳腺癌肿瘤；结/直肠癌肿瘤；胰腺癌肿瘤；胃癌肿瘤；卵巢癌，神经胶质瘤等恶性肿瘤组织的超声成像诊断和核磁共振成像诊断。7. 一种药物组合物，其特征在于，它含有以上1-4项所述的肿瘤靶向分子；以及药学上可接受的抗肿瘤药物或缓冲液或添加剂或赋形剂，并应用于治疗各种肿瘤，这些肿瘤包括肝癌肿瘤；黑色素肿瘤；肺癌肿瘤；乳腺癌肿瘤；结/直肠癌肿瘤；胰腺癌肿瘤 ’胃癌肿瘤；卵巢癌，神经胶质瘤等恶性肿瘤。附图表说明


图1.人源铁蛋白重链cDNA的PCR扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳鉴定=Lanel是分子量标准，lane2 和 3 是 580bp 的 HFn cDNA
图2.纯化的人源铁蛋白重链的12% SDS-PAGE检测lanel是蛋白分子量标准，lane2-4是经纯化得到的分子量为21kDa的HFn蛋白，其上样量分别为1. 25ug，2. 5ug和5ug。
图3.肿瘤靶向造影剂在荷人肺癌肿瘤裸鼠模型的核磁共振扫描成像图从左往右分别是注射含氧化铁核的人HFn铁蛋白后0分钟，30分钟和60分钟的MRI扫描图像。
图4.肿瘤靶向造影剂在荷人肝癌肿瘤裸鼠模型的核磁共振扫描成像图从左往右分别是注射含氧化铁核的人HFn铁蛋白后0分钟，30分钟和60分钟的MRI扫描图像。
图5.肿瘤靶向造影剂在荷人黑色素癌肿瘤裸鼠模型的核磁共振扫描成像图从左往右分别是注射含氧化铁核的人HFn铁蛋白后0分钟，30分钟和60分钟的MRI扫描图像。
具体实施例为了更全面地理解和应用本发明，提供下列实施例，需要说明的是，实施例只是举例说明本发明的部分特色，而不是意图限制本发明的范围，而本发明的权利要求包括实施例但不限于实施例
实施例一、重组人重链铁蛋白(Human H chain Ferritin. !Fn)的制备重组人源铁蛋白的制备方法主要是参考文献(Masaki U., Michelle L. F.，Mark Α., Deborah Α. W. , Bridgid Ε. C. , Susan B., Ann F. W. , Larissa J. , Mark J. , Mark J. Y. and Trevor D. , J. AM. Chem. Soc. 2006, 128，16626)所描述的方法进行。具体实施如下，从正常人骨骼肌cDNA中设计引物用PCR方法扩增获得人源铁蛋白重链基因，上游引物为:5，-A GTC GCC CAT ATG ACG ACC GCG TCC ；下游引物为5 GCC GGATCC TTA GCT TTC ATT ATC AC。扩增得到的550-600bp附近大小的目的PCR片段经Ndel/BamHI双酶切回收后，连接到同样经Ndel/BamHI双酶切回收后的pET39b载体(Novagen)片段上，HFn基因经测序鉴定为正确。所得到的表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。从含卡那霉素的LB-琼脂平板上挑取阳性单克隆到IOOm新鲜的LB液体(含50ug/ ml卡那霉素)中，37°C摇床培养过夜；取过夜培养物按1 :20比例稀释到IL含50ug/ml卡那霉素的新鲜LB培养基中，37°C继续培养至OD值0. 8 ；加入终浓度为0. 5mM的IPTG诱导HFn 的重组高效表达，37°C诱导表达4小时后；4000rpm离心收集细菌沉淀。收集的细菌沉淀用45ml裂解缓冲液(IOOmM H印es，50mM NaCl，pH8)重悬；加入终浓度分别为50ug/ml，60ug/ml和100ug/ml的溶菌酶，DNAse和RNAse，室温放置半小时后，超声破碎细菌，20000rpm离心30分钟去除沉淀；上清于72°C加热10分钟，20000rpm离心30分钟去除沉淀；所得上清用superose 6分子筛进行分离纯化得到高纯度的!Fn蛋白， HFn自动折叠组装为对聚体的铁蛋白。280nm测定蛋白浓度，分装后-80°C保存备用。实施例二、含氧化铁核的人源铁蛋白的制备
本制备过程始终处于队环境中进行。将脱气处理的8ml含IOOmM NaCl的溶液加入N2 保护的密闭容器中，再加入2ml浓度为lmg/ml的HFn共^iig样品(同样溶解于IOOmM NaCl 的溶液中)，在循环水保持65°C环境温度下，用50mM NaOH将体系pH滴定为8. 5 ；按一个笼状蛋白空腔含有3000个铁原子的摩尔比加入浓度为12. 5 mM的(NH4) 2Fe (S04) 2，同时按 H2O2 = Fe(II)为1:3的摩尔比加入浓度为4. 17mM的新鲜制备的脱气H2R ；Fe (II)和H2R按固定的31. 3ul/min的速率加入反应体系中，同时随时用50mM NaOH将体系pH滴定稳定在 8.5。反应结束后加入200ul的300mM柠檬酸钠螯合多余的自由的铁离子，用superose 6 分子筛分离得到含氧化铁核的人源铁蛋白，保存备用。
实施例三、肿瘤靶向造影剂在荷人瘤棵鼠樽型的核磁共振扫描成像
以人肺癌细胞株SPCAl接种裸鼠皮下(IO7细胞/只)，制作荷人肺癌裸鼠模型共10只。 分为两组，每组5只，分别为观察组和对照组。当肿瘤长至1-1. 5cm大小时对所有裸鼠分别进行MRI平扫，测定肿瘤病灶MRI信号强度为278，观察组裸鼠尾静脉按5mg Fe/kg体重的比例注射含氧化铁核的人HFn铁蛋白，对照组裸鼠尾静脉按5mg Fe/kg体重的比例注射直径为50nm的!^e3O4磁纳米颗粒，半小时后进行MRI增强扫描，测定观察组肿瘤病灶MRI信号强度为451，而对照组肿瘤病灶MRI信号强度为325。以人肝癌细胞株heplBb接种裸鼠皮下(107细胞/只)，制作荷人肝癌裸鼠模型共 10只。分为两组，每组5只，分别为观察组和对照组。当肿瘤长至1-1. 5cm大小时对所有裸鼠分别进行MRI平扫，测定肿瘤病灶MRI信号强度为沈9，观察组裸鼠尾静脉按5mg Fe/ kg体重的比例注射含氧化铁核的人HFn铁蛋白，对照组裸鼠尾静脉按5mg Fe/kg体重的比例注射直径为50nm的Fe304纳米颗粒，半小时后进行MRI增强扫描，测定观察组肿瘤病灶 MRI信号强度为468，而对照组肿瘤病灶MRI信号强度为372。
权利要求
1.一种新型肿瘤靶向造影剂，其特征在于它是由笼状蛋白空腔包裹核磁共振成像造影增强剂而成的复合物，该复合物可以特异地靶向结合于肿瘤细胞或肿瘤组织。
2.如权利要求书1所述的肿瘤靶向造影剂，其特征在于所述的笼状蛋白空腔是脱铁铁蛋白；所述的核磁共振成像造影增强剂是药学上可接受的核磁共振成像造影增强剂，且该核磁共振成像造影增强剂被所述的笼状蛋白空腔所包裹，从而形成如权利要求书1所述的复合物，该复合物适用于肿瘤靶向造影。
3.如权利要求书2所述的肿瘤靶向造影剂，其特征在于所述的脱铁铁蛋白是由铁蛋白的重链亚基组装而成。
4.如权利要求书1-3所述的肿瘤靶向造影剂，其特征在于所述的笼状蛋白空腔是脱铁铁蛋白，它是由铁蛋白的重链亚基组装而成，最常见的形式是由M个铁蛋白的重链亚基组装而成的笼状蛋白空腔。
5.如权利要求书1-4所述的肿瘤靶向造影剂，其特征在于所述的铁蛋白是人源铁蛋白；所述的铁蛋白的重链亚基是人源铁蛋白的重链亚基。
6.一种肿瘤靶向的核磁共振成像造影剂，其特征在于，它含有如权利要求书1-5所述的肿瘤靶向造影剂；以及药学上可接受的缓冲液或添加剂或赋形剂，并用于肝癌肿瘤、黑色素肿瘤、肺癌肿瘤、乳腺癌肿瘤、结/直肠癌肿瘤、胰腺癌肿瘤、胃癌肿瘤、卵巢癌、头颈癌、 神经胶质瘤等肿瘤组织的核磁共振成像诊断。
全文摘要
本发明提供一种新型肿瘤靶向造影剂，它是由人源铁蛋白的重链组装而成的脱铁铁蛋白笼状空腔外壳，以及将药学上可接受的核磁共振成像造影增强剂包裹于该脱铁铁蛋白笼状空腔中，所形成的复合物是一种具有肿瘤特异靶向功能的新型MRI肿瘤成像造影剂。本发明造影剂具有无或低毒性、肿瘤靶向性好、特异性强、用量少、体内稳定性高等特点，特别适用于肝癌肿瘤、黑色素肿瘤、肺癌肿瘤、乳腺癌肿瘤、结/直肠癌肿瘤、胰腺癌肿瘤、胃癌肿瘤、卵巢癌、头颈癌、神经胶质瘤等肿瘤组织的核磁共振成像造影。
文档编号A61K49/22GK102462847SQ20101054265
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月15日 优先权日2010年11月15日
发明者杨静雯 申请人:杨静雯