专利名称：王不留行中抑制血管生成的一种低毒的有效部位的制备和应用的制作方法
技术领域：
王不留行中抑制血管生成的有效部位的制备工艺和应用。本发明涉及从中药王不 留行中提取、分离得到的一种低毒有效部位，具有抑制血管生成的活性。阐明了其制备方 法，及其在医药、食品、化妆品方面的新用途。
背景技术：
恶性肿瘤直径大于1毫米呈肿瘤转移趋势时，必需先形成新的肿瘤血管。抑制肿 瘤内部和周围新血管形成便可有效减少，甚至消除肿瘤。近年来，肿瘤血管生成已成为肿 瘤治疗中一个很有吸引力的热点。目前开发出许多血管生成抑制剂在进行I III期临 床试验研究，例如血管生成抑素(Angiostatin)、内皮抑素(Endostatin)、烟曲霉素类似物 及金属蛋白酶抑制因子和尿激酶、白介素-12、血小板因子、Bufotanine等20多种。美国 Genentech 公司以血管内皮生长因子(vessel endothelial growth factor，VEGF)为靴 标的抗新生血管形成药Avastin近年用于治疗晚期转移的直肠癌和乳腺癌等，延长病人生 命4-6个月。2007年Avastin的年销售量已超过24. 5亿美元，2009年销售额达到59亿美 元。Avasitin成为近年抗癌新药的一枝独秀。此外，几种针对不同靶标的抗新生血管形成 的药物已进入 II、III 期临床试验[1. Ellis L M, HicklinD J. VEGF-targeted therapy mechanisms of anti-tumour activity. Nat Rev Cancer. 2008,8 :579_591]。但目前上市的抑制肿瘤血管新生的药物只能静脉给药，且用药剂量较大、治疗时 间长。因此开发口服、高效低毒、价廉的血管生成抑制剂成为该领域的热点。“多成分、多靶点、多途径”是中药治疗疾病的特点，发挥祖国医学特色，从多途径、 多层次、多环节，研究中药直接地或间接地影响血管新生，有着重要的临床意义和应用前 景。通过建立体内、体外血管生成筛选模型，寻找到目的中药王不留行等，并对其进行提取 分离，获得若干有效部位。进一步通过药效与毒性评价，得到一高效低毒有效部位。王不留行为麦蓝菜[Vaccaria segetalis (Neck. ) Garcke]的干燥成熟种子。它的 异名为不留行，王不流行，禁宫花，剪金花，金剪刀草，金盏银台，麦蓝子。它资源丰富，主产 于河北、山东、辽宁、黑龙江等地，以河北产量最大。[2.国家药典委员会.中华人民共和国 药典[S]. —部.北京中国医药科技出版社，2010:药材及饮片49-50]。王不留行中主要含 有三萜皂苷，黄酮苷，环肽，类脂和脂肪酸，单糖等。该植物苦，平；入肝，胃经。对行血通经， 催生下乳，消肿敛疮；妇女闭经，乳汁不通，难产，血淋，痈肿，金疮出血等有很大效用[3.桑 圣民，劳爱娜，王洪诚.王不留行成分的研究[J].天然产物研究与开发，1998，10:1]。王 不留行水提物有抑制血管生成的作用，经分离纯化的有效组分有抑制HMEC-I增殖、迁移、 粘附的作用[4.夏明星，张莲芬，王一君，等.王不留行提取物对内皮细胞增殖、迁移及其黏 附的作用评价[J].中国药理学通报，2009，25 (6) 817-8195.夏明星，冯磊，张莲芬，等.王 不留行中抗人微血管内皮细胞增殖的有效组分的分离和纯化[J].生物技术通报.2009，2 93-97]。CN 102068481 A
说明书
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发明内容
本发明的目的是提供一种从王不留行中提取分离得到的低毒的有效部位，具有抑 制血管生成的作用。本发明的技术方案一种用于抑制血管生成的低毒的王不留行有效部位。所述有效部位的制备方法，用75%乙醇对王不留行加热提取，并将提取液过滤、浓 缩成浸膏。所得的浸膏依次经石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取后用水饱和正丁醇萃取，收 集正丁醇萃取相，回收溶剂成浸膏，冷冻干燥制成干粉。所述有效部位，体内、体外均有抑制血管生成的作用。所述有效部位经Molish反应、Libermann-Buchard反应、三氯化锑反应均呈阳性， 说明上述这些有效部位均含有至少一种以上苷类成分。所述王不留行有效部位在制备抑制血管生成药物中的应用，其特征是该抑制血管 生成药物中含有几种有效剂量的王不留行有效部位，以及常规药用载体和/或赋形剂。所述王不留行有效部位在制成抑制血管生成药物时，可以加入一种或多种药学上 可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂，赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩 解齐 、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、乳化剂、渗透压调节剂，必要时还可以加 入香味剂、甜味剂等。所述王不留行有效部位在制成抑制血管生成药物时，可以按常规的制剂工艺，单 独使用或与其它药物配合制备成在临床上可以使用的各种不同剂型的药物，例如注射液、 片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂或乳剂等多种形式。所述的应用，为所述有效部位是用于预防和/或治疗至少一种选自下述之一的疾 病癌症和/或癌症转移，血管瘤，血管纤维瘤，新生血管性青光眼，糖尿病视网膜病变，早 熟视网膜病及视网膜静脉闭塞，视网膜变性，晶体合纤维组织增生，颗粒性结膜炎，血管生 成引起的角膜疾病，更年期黄斑和黄斑变性，牛皮癣，老年盘状斑变性及风湿性关节炎，银 屑病，毛细管扩张，脓性肉芽肿，伤口愈合中抑制斑痕形成，动脉粥样硬化，脂溢性皮炎和痤 疮。所述的应用，为所述有效部位有抗肿瘤血管生成及其它与血管生成有关疾病治 疗、预防的用途。所述的应用，为所述有效部位还有用于肿瘤化疗和/或辅助化疗的用途。所述有效部位在制备抑制血管生成的保健食品中的应用，是上述有效部位用于抑 制血管生成的保健食品组合物。所述有效部位在制备抑制血管生成的化妆品中的应用，是上述有效部位用于抑制 血管生成的化妆品组合物。本发明的有益效果本发明以血管生成作为治疗疾病的靶点，首次明确王不留行中具有抑制血管生成 活性的低毒有效部位的制备工艺方法，并将其作为用于肿瘤血管生成及其它与血管生成有 关的疾病预防、治疗的药物，其特点是疗效高，副作用小。且以血管生成理论为研究背景，为 今后阐述中药有效部位的作用机制，发展中医药理论新的方向，发现新的药物作用靶点提供重要的科学依据。
图1王不留行有效部位对HMEC细胞体外增殖的抑制作用图2王不留行有效部位对体外HMEC细胞迁移的抑制作用图3王不留行有效部位对小鼠H22体内肿瘤的抑制作用图4王不留行有效部位对小鼠H22实体瘤的病理改变图5致毒剂量王不留行有效部位对小鼠主要脏器的损伤 图注A、C、Ε、G、I分别为对照组的脑，肺，肝，心，肾
B、D、F、H、J分别为给药组的脑，肺，肝，心，肾
具体实施例方式实施例1 王不留行的有效部位提取分离工艺与理化性质的鉴定王不留行50g，10倍量75%乙醇加热连续回流提取2次，合并提取液，减压回收溶 剂，冷冻干燥后得总提取物。取乙醇回流提取物500mg加水混悬依次用石油醚部分、二氯甲 烷、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取。所得正丁醇组分旋转蒸发至浸膏状，水复溶，冷冻干燥， 得率为原药材的1. 26%。有效部位的Molish反应呈紫红色，Libermarm-Buchard反应呈紫 红色，三氯化锑显色为红色。此结果说明这一有效部位含有至少一种以上苷类化合物。实施例2 王不留行的有效部位对HMEC细胞增殖的抑制作用将HMEC用含lmmol/L谷氨酰胺、lmg/L氢化可的松、10 μ g/L EGF和150mL/L小牛 血清的MCDB-131培养液，于37°C，50mL/L CO2培养箱中传代培养。取对数生长期HMEC细 胞，按每孔8000个细胞接种于96孔板中，放置于37°C、50mL/L CO2的培养箱中培养24h，加 入不同浓度药物作用时间48h，以不加药组为阴性对照组，每组同时设3个复孔，每批样品 重复3次试验。加药后培养至72h，去上清液，每孔轻轻加入100g/L三氯醋酸100 μ L固定， 静置5min后移到4°C再放置至40min，倾掉固定液，用去离子水洗5遍，空气干燥。每孔加 入4g/L SRB 10(^1^室温放置3011^11，用10111171醋酸液洗5遍，加入15(^1^ l(kimol/L Tris 碱液(pH 10.5)溶解，用MK3型酶标仪在波长A54tl处测定每孔A值。计算抑制率(％)，求 出半数细胞抑制浓度(IC5(I)。抑制率=[(对照组的A值-药物组的A值)/(对照组的A 值-空白组的A值)]X 100%。根据所得的结果计算，对HEMC细胞半数抑制量IC5tl为6. 44士0.2 μ g/mL。图1所示。实施例3 王不留行的有效部位对体外HMEC迁移的抑制作用用划线灼伤法研究细胞迁移[6.乔洪旺，康鹏程，田墨涵等.血管生成抑素对胃癌 细胞的影响[J]·解剖科学进展，2010，16 (34) :315-318]，将常规培养的HMEC细胞消化悬 浮，以每孔IOXlO4个/mL细胞加到24孔板中，每孔ImL,置37°C,5% CO2及饱和湿度的培 养箱中孵育24h，待细胞贴壁后用移液塑料枪头于每孔中心位置划一条约Imm宽的灼伤带， 然后用PBS洗去脱落细胞，并加入10 μ g/mL药物浓度的细胞培养基，对照组加入等量的完 全培养基。然后在100X显微镜下拍照，此刻为Oh细胞迁移图，培养12、24h时分别于同一 视野处拍，所得图片用Image-pro plus 6软件测量灼伤带距离，每个视野随机取6个位点，所得数据进行统计处理。结果见图2。实施例4 王不留行的有效部位对小鼠体内H22实体瘤的抑制作用取对数生长期H22细胞，消化，用0. 9%生理盐水稀释调整浓度至镜下瘤细胞 1 X IO7个/mL，将细胞悬液置于冰上，用ImL无菌注射器分别于每只小鼠右腋皮下接种 0.2mL，整个过程在半小时内完成。动物造模右前肢腋下接种作为实体瘤小鼠。接种后的 实体瘤小鼠随机分为四组，模型组及给药高剂量组5mg/kg、中剂量组2. 5mg/kg、低剂量组 1.25mg/kg三个剂量组，每组各10只。于24小时后准时给药，灌胃1次/日，连续10大。 结果表明各剂量组对肿瘤生长的抑制率在30-70%之间，有明显的量效关系。HE染色病理 镜下观治疗组新生血管密度减少，有不同程度的坏死区。图3、4所示。实施例5 王不留行有效部位小鼠急性毒性ICR小鼠，雌雄各半，体重18_25g。禁食4h后一次性灌胃给药，给药后再禁食2h， 连续观察14d。5. 1近似致死量和最小致毒量的探究以临床人用原药的最大剂量为依据，折算有效部位含量，折算合相当于小鼠用量 2mg/kg，并以此量(2mg/kg)高于其 10 倍(20mg/kg)、20 倍(40mg/kg)、40 倍(80mg/kg)、50 倍(100mg/kg)、100 倍(200mg/kg)、500 倍(1000mg/kg)、1000 倍(2000mg/kg)剂量分组给 药，每组动物3只，同时发生理盐水对照组。随剂量增至100mg/kg时，出现毒性反应。其一 般表现为轻度饮食减少、体重减轻。病理报告肝、肾均有轻度变性样损伤。2000mg/kg时 出现小鼠死亡，尸解情况心、肺、肝、脾均有明显淤血征，心肌松弛，肺片状出血，肝质脆、边 缘变钝、表面颗粒粗大，胃内少量软食糜，膀胱无充盈，其余肉眼观无明显异常。病理报告 心肌大片变性坏死灶，肝弥漫性损伤，肾小管上皮细胞变性坏死，部分肠粘膜脱落。5. 2重要脏器形态学观察小鼠灌胃14天时，脱颈致死，速取心、脑、肺、肝、脾、肾新鲜组织，于10%福尔马林 固定，常规浸蜡包埋，5 μ m切片。切片脱水脱蜡，苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosir^HE)染 色。脑组织出现细胞核固缩，胶质结节，血管有坏死迹象。肺泡壁明显增厚，甚至出现区域 实变。肝细胞出现核固缩，中央静脉内壁不完整。心肌脏组织细胞疏松仅剩残留肌膜。肾 小管异常，肾小球未见显著变化。图5所示。本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领 域技术人员能领会在公开的实施例中作许多改变也可获得相同或类似的结果，而不超出本 发明的构思、精神和范围。更具体地说，显然有些化学和生理性的相关试剂可替代本文所公 开的试剂而得到相同或类似的结果。所有类似的取代和修饰对本领域技术人员来说，显然 都认为是本发明的精神、范围和构思及权利要求范围内的，即所有上述这些等价形式都同 样落于本发明的权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种权利要求王不留行中具有抑制血管生成作用的一种低毒有效部位。
2.根据权利要求1所述的有效部位，其特征是所述有效部位来源于王不留行Vaccaria segetalis0
3.权利要求1或2所述有效部位的提取方法，其特征是，用有机溶剂、含水有机溶剂或 水来提取王不留行的种子，并将提取液过滤、浓缩成浸膏。
4.权利要求1或2所述有效部位的制备方法，其特征是将权利要求3所得的浸膏经水 饱和正丁醇萃取，收集有效部位，同收溶剂成浸膏，冷冻干燥制成干粉。
5.一种权利要求3，4所述的有效部位在制备抑制血管生成药物中的应用，其特征是该 抑制血管生成药物中含有有效剂量的几种王不留行有效部位和/或有效成分，以及常规药 用载体和/或赋形剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述药物被制成注射液、片剂、粉剂、颗粒 剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂或乳剂等剂型。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述药物是用于预防和/或治疗至少一 种选自下述之一的疾病癌症和/或癌症转移，血管瘤，血管纤维瘤，新生血管性青光眼，糖 尿病视网膜病变，早熟视网膜病及视网膜静脉闭塞，视网膜变性，晶体后纤维组织增生，颗 粒性结膜炎，血管生成引起的角膜疾病，更年期黄斑和黄斑变性，牛皮癣，老年盘状斑变性 及风湿性关节炎，银屑病，毛细管扩张，脓性肉芽肿，伤口愈合中抑制斑痕形成，动脉粥样硬 化，脂溢性皮炎和痤疮。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征是该药物有抗肿瘤新生血管生成及其它与血管 生成有关疾病治疗、预防的用途。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征是该药用组合物还有用于肿瘤化疗和/或辅助 化疗的用途。
10.一种权利要求3，4所述的一种有效部位体在制备抑制血管生成的保健食品中的应 用，其特征是该有效部位用于抑制血管生成的保健食品组合物。
全文摘要
本发明涉及王不留行中抑制血管生成的有效部位的制备方法及应用。其制备方法用75％乙醇对王不留行加热提取，提取物依次经石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，得到王不留行中抑制血管生成的有效部位。本发明以血管生成作为治疗疾病的靶点，研究并阐明王不留行有效部位的药用疗效和机制，为其新用途开发和发现药物作用新的靶点提供科学依据和重要信息。本发明的有效部位可与药学上适用载体混合制成各种制剂。它可用于治疗或预防与血管生成相关的疾病，还可用于肿瘤化疗和/或辅助化疗方面的治疗。
文档编号A61P19/02GK102068481SQ20101057782
公开日2011年5月25日 申请日期2010年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者冯磊, 杜芳芳, 邱丽颖, 金坚, 高越颖 申请人:江南大学