专利名称：hsa-miR-185的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及hsa-miR-185的新用途。
背景技术：
肿瘤是严重威胁人类生命健康的常见病、多发病，在许多国家和地区占疾病死亡 率的前三位，而且其发病率和病死率仍在逐年增高。目前主要的治疗方法包括手术、放疗和 化疗。1998年世界卫生组织(WHO)的资料显示，目前肿瘤的总治愈率约45%，其中80%患 者不同程度地接受了放射治疗，但肿瘤的辐射抗性严重地影响了放疗的治疗效果。放射治疗是非常重要的肿瘤治疗手段之一，但治愈率仍然偏低。另外，目前放射治 疗装置主要有Y射线、X射线等。这些常规射线与物质的作用机理决定了其对机体表面的 影响要强于对深层的影响，治疗时会对肿瘤周围正常组织造成严重损伤。开发肿瘤组织的 靶向辐射增敏剂，可以降低辐照剂量，在提高放疗疗效的同时更好地保护正常组织，因此， 具有极其重要的临床应用价值。同时，肿瘤基因治疗作为新兴治疗手段，引起医学界极大的关注。miRNA作为一类 新发现的基因，在肿瘤治疗方面受到关注。miRNA是一类广泛存在于生物体中、长度约21 25nt的非编码小分子RNA。它通过与靶基因mRNA序列互补性结合导致mRNA的降解或抑制 其翻译，从而在转录后水平调节基因的表达。最早发现的miRNA家族成员是Lin_4，是1993年Lee等人在秀丽线虫 (Caenorhabditis elegans)胚胎发育时间控制缺陷性遗传筛选实验中发现的(Lee，et al. The C. elegans heterochronic gene lin_4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell，1993，75 (5) :843_854)。在短短几年内，不同的研究小 组相继在线虫、果蝇、斑马鱼、拟南芥、水稻和人类细胞等多种真核模式生物的细胞中找到 上万种miRNAs。依据Sanger miRNA序列数据库(miRBase 14. 0版，2009. 09. 15)，目前共发 现miRNA发夹前体序列为10883条，成熟miRNA序列为10581条，涵盖115个物种，其中人 源miRNA共721条。miRNA基因约占人类基因的1 %，是最大的基因表达调控家族之一，却调控接近 30% 基因的表达(Lewis, et al. Prediction of mammalian microRNA targets. Cell, 2003，115 (7) =787-798) 0 miRNA表达的时空特性，调控方式的多样性、灵活性，使其成为信 使RNA强有力的调节子。miRNA与其靶分子组成一个复杂的精细调控网络，参与调控生物 体的生长、发育、细胞分化、细胞凋亡等一系列重要的生命进程。miRNA与肿瘤发生也密切 相关，有些miRNA基因具有抑癌基因的功能，例如，let-7参与乳腺癌干细胞的调控，调节 原癌基因 ras 的表达(Yu, et al. let-7 regulates self-renewal and tumorigenicity of breast cancer cells. Cell，2007，131 :1109_1123)，有些 miRNA 又类似于原癌基因 (EsqueIa-Kerscher and Slack. Oncomirs-microRNAs with a role in cancer[J]. Nat Rev Cancer，2006，6 (4) :259_269)，例如 miR-21 参与调节抑癌基因 PTEN 的表达(Meng， et al. MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene inhuman hepatocellular cancer. Gastroenterology, 2007,133 :647_58)。miRNA 基因多位 于肿瘤细胞染色体发生缺失、扩增、转位的高发区(Calin et a 1. Human microRNA genesare frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. PNAS, 2004，101 (9) =2999-3004)，表明miRNA在人类癌症的发病机理中发挥着十分重要的作用。肿瘤放疗中，辐射抗性问题是肿瘤放疗成败的关键。细胞受到辐照后，将启动复杂 的应激网络，将细胞周期阻滞在检测点上，启动DNA损伤修复。如损伤无法修复，细胞将进 入凋亡程序。ATR基因也是细胞DNA复制的关键监控蛋白。人源的ATR基因的核苷酸序列 如 SEQ ID NO 3 所示。miR-185家族仅存在于8种高等哺乳动物中(牛、狗、人、猕猴、蓝鲸、黑猩猩、鼠、 猪)，其前体碱基序列存在一定差异性，但成熟碱基序列完全一致，表明miR-185在进化上 高度保守。miR-185的成熟核苷酸序列为UGGAGAGAAAGGCA⑶UCCUGA (SEQ ID NO :1)。人类 的miR-185位于人类染色体组的22号染色体20，018，662-20，022，743区域。miR-185的功 能尚未明了。
发明内容
本发明的一个目的是提供如下1)、2)、3)、4)或5)所示的物质的新用途。本发明所提供的如下1)、2)、3)、4)或5)所示的物质的新用途为其在如下I、II或 III中的应用 1) SEQ ID NO 1 所示的 RNA 分子；2) SEQ ID NO 2 所示的 RNA 分子；3)编码1)所示分子的DNA或表达1)所示分子的载体；4)编码2)所示分子的DNA或表达2)所示分子的载体；5)由 Ambion 公司制造的产品，产品名称为 Pre-miR miRNAPrecursorhsa-miR-18 5，产品 Cat# :AM17100，产品 ID :PM12486，产品规格5nmol ；I、制备具有增强细胞和/或组织和/或机体对辐射敏感性功能的产品；II、制备具有治疗和/或预防肿瘤功能产品；III、制备抑制ATR基因激活或介导的信号通路的产品、制备抑制ATR蛋白激活或 介导的信号通路的产品、制备抑制ATR基因的产品、和/或制备抑制ATR蛋白的产品。ATR基因作为靶点在如下IV或V中的应用也属于本发明的保护范围。ATR蛋白作为靶点在如下IV或V中的应用也属于本发明的保护范围。ATR基因激活或介导的信号通路作为靶点在如下IV或V中的应用也属于本发明的 保护范围。ATR蛋白激活或介导的信号通路作为靶点在如下IV或V中的应用也属于本发明的 保护范围。IV、设计和/或筛选和/或制备具有治疗和/或预防肿瘤功能产品；V、设计和/或筛选和/或制备具有增强细胞和/或组织和/或机体对辐射敏感性 功能的产品。上述任一所述应用中，所述增强细胞和/或组织和/或机体对辐射敏感性功能为促进辐射后的细胞的凋亡；上述任一所述应用中，所述治疗和/或预防肿瘤为如下1)或2)或3)或4)所示 1)抑制肿瘤的生长；2)抑制肿瘤的成瘤能力；3)抑制肿瘤细胞的生长；4)辅助增强肿瘤的
辐射敏感性。上述任一所述应用中，所述增强细胞和/或组织和/或机体对辐射敏感性功能的 产品为辐射增敏剂。上述任一所述应用中，所述辐射为非电离辐射或电离辐射；所述非电离辐射为紫 外线，所述电离辐射为X射线；所述紫外线为UVA或UVB。上述任一所述应用中，所述增强细胞和/或组织和/或机体对辐射敏感性是通过 1)、2)、3)、4)或5)所示的物质抑制ATR基因激活或介导的信号通路、抑制ATR蛋白激活或 介导的信号通路、抑制ATR基因的表达或抑制ATR蛋白的表达实现的；上述任一所述应用中，所述治疗和/或预防肿瘤是通过1)、2)、3)、4)或5)所示的 物质抑制ATR基因激活或介导的信号通路、抑制ATR蛋白激活或介导的信号通路、抑制ATR 基因的表达或抑制ATR蛋白的表达实现的。 上述任一所述应用中，所述抑制ATR基因激活或介导的信号通路、抑制ATR蛋白激 活或介导的信号通路、抑制ATR基因的表达或抑制ATR蛋白的表达是通过如下方式实现的 所述1)、2)、3)、4)或5)所示的物质与所述ATR基因3’端非转录区域靶位点结合。上述任一所述应用中，所述与所述ATR基因3’端非转录区域靶位点结合为与 NM_001184. 3所示序列中第8165-8186位核苷酸结合或与SEQ ID NO :3所示序列中第 8165-8186位核苷酸结合。上述任一所述应用中，所述增强细胞和/或组织和/或机体对辐射敏感性中，所述 细胞为肿瘤细胞；所述肿瘤为肾癌、黑色素瘤、宫颈癌或胃癌。上述任一所述应用中，所述治疗和/或预防肿瘤中，所述肿瘤为肾癌、黑色素瘤、
宫颈癌或胃癌。上述任一所述应用中，所述增强细胞和/或组织和/或机体对辐射敏感性中，所述 肾癌的细胞为人肾透明细胞腺癌细胞786-0 ；所述黑色素瘤为小鼠黑色素瘤B16细胞；所述 宫颈癌的细胞为HeLa ；所述胃癌的细胞为BGC-823或MGC-803。上述任一所述应用中，所述治疗和/或预防肿瘤中，所述肾癌的细胞为人肾透明 细胞腺癌细胞786-0 ；所述黑色素瘤为小鼠黑色素瘤B16细胞；所述宫颈癌的细胞为HeLa ； 所述胃癌的细胞为BGC-823或MGC-803。实验证明，hsa-miR-185 (简称miR_185)可以直接抑制肿瘤生长和增强细胞对辐 射的敏感性。进一步实验证明，miR-185的上述功能是通过抑制细胞内ATR基因的表达实 现的。因此，将miR-185用于制备治疗肿瘤的药物及辐射增敏剂，将对肿瘤的治疗具有重要 意义，有广阔的应用前景。
图1 :miR-185试剂的转染效率检测及试剂功能有效性检测。图2 辐照后，miR-185在肾癌组织随着辐照剂量的增加，其表达量逐渐降低。图3 辐照后，miR-185在不同的组织、细胞系中的表达普遍下调。
图4 :miR-185促进辐照后细胞的凋亡。图5 :miR-185抑制辐照后细胞的克隆形成率。图6 :miR-185抑制小鼠体内移植瘤的生长。图7 :miR-185抑制ATR基因的表达。图8 :miR-185与ATR mRNA的3，UTR区域相结合的实验验证。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的试剂如无特殊说明，均可从商业途径购买得到。前体发卡型miR-185的序列如SEQ ID NO 2所示。http//www, mirbase. otr/CRi-bin/mirna entry, pi ？ acc = MI0000482 ；http//mirnamap. mbc. nctu. edu. tw/php/mirna entry.php？ acc = MI0000482ohsa-miR-185类似物、抑制剂及hsa-miRNA类似物、抑制剂的阴性对照试剂均购自 美国Ambion(ABI)公司，由上海吉泰生物科技有限公司代理出售，具体产品信息如下hsa-miR-185类似物试剂(即miR-185类似物)，在ABI的产品名称为 Pre-miR miRNAPrecursor hsa-miR-185，产品 Cat# :AM17100，产品 ID :PM12486，产品规格 5nmo1。miR-185类似物是前体发卡型miR-185，是化学修饰的双链RNA分子，其 模仿体内成熟的miR-185mRNA，在体内可被加工为成熟的miR-185序列发挥作用 (5' -uggagagaaaggcaguuccuga-3', SEQ ID NO 1) ( Ambion Pre-miR miRNA Precursor Molecules are small,chemically modified double-stranded RNA molecules designed to mimic endogenous mature miRNAs)。miR-185类似物阴性对照是核苷酸序列随机的类miRNA前体序列，在细 胞系和组织中的广泛实验验证，其成熟序列没有miRNA功能，仅起到阴性对照作用 (Pre-miRNegative Controls are random sequence Pre-miR molecules that have been extensively tested in human cell lines and tissues and validated to not produce identifiable effects on known miRNA function)。hsa-miRNA 类似物阴性对照试剂， 在 ABI 的产品名称为Anti-miR miRNA inhibitors-Netativecontrol#l,产品 Cat# AM17010，产品规格5nmol。miR-185抑制剂是小单链核酸分子，用于结合、抑制内生的成熟miR-185的表达 (Ambion Anti-miR miRNA Inhibitors are chemically modified, single stranded nucleic acids designed to specifically bind to and inhibit endogenous microRNA (miRNA)molecules)。hsa-miR-185 抑制剂试剂，在 ABI 的产品名称为Anti-miR miRNA inhibitor hsa-miR-185，产品 Cat# :AM17000，产品 ID :AM12486 ；产品规格5nmol。miR-185抑制剂阴性对照是随机的单链核酸序列分子，经广泛的细胞和组织实验 验证，该序列不和miR-185结合及抑制其功能，仅起到阴性对照功能。(Anti-miR Negative Control #1 is a random sequence Anti-miR molecule that has been extensively tested in human cell lines and tissues and validated to not produce identifiable effects on known miRNA function)。
Cy3标记的miRNA抑制剂阴性对照，无任何miRNA抑制剂的功能，仅起到阴性对 照功能，因该分子标记有Cy3荧光染料，可以在荧光显微镜下观察期miRNA试剂在特定细 胞中的转染效率，细胞内的定位情况。Cy 3 dye-labeled Anti-miR Negative Controls are also available for monitoring transfection efficiency in transfection experiments using Anti-miR miRNA Inhibitors.The fluorescent label enables direct observation ofthe cellular uptake,distribution, and localization of the control. These dye-labeled controls are labeled at their 5' end and have the same oligonucleotide sequence as unlabeled Negative Control#l.焚光染料 Cy3 标 记的hsa-miRNA抑制剂阴性对照试剂，在ABI的产品名称Cy 3 dye-labeled Anti-miR Negative Control#l ；产品 Cat# :AM17011，产品规格5nmol。人肾透明细胞腺癌细胞786-0，购自中国科学院细胞库；小鼠黑色素瘤B16细胞购 自购自中国科学院细胞库。采用Irwitrogen公司的lipo2000转染试剂。实施例1、细胞转染一、转染miR-185类似物、抑制剂及阴性对照于786_0细胞的制备和验证1、铺细胞将对数生长期的786-0细胞接种于12孔板，数目8X 105/well，第二天 转染。2、转染按照每孔1 μ L miR-185类似物(或miR-185抑制剂或miR-185类似物阴 性对照或miR-185抑制剂阴性对照)(浓度30 μ Μ)混于100 μ L不含血清的opti-ΜΕΜ培养 基，2 μ L Lipo2000混于100 μ L不含血清的opti-MEM培养基，室温孵育IOmin ；把上述预混 液混勻后于室温孵育15min ；弃孔板中细胞培养液，加入不含血清的Opti-MEM(GibiCO)培 养基，每孔加800 μ L，加入200 μ L的转染混合物，37°C、5% CO2细胞培养箱培养；4小时后 换1640培养液(10%血清)培养，于不同时间点观察细胞、提取蛋白或RNA样品。3、转染效率检测(Cy3荧光素标记、荧光显微镜检测)转染Cy3荧光素标记miRNA抑制剂阴性对照后24小时，荧光显微镜下观察细胞中 Cy3荧光染料的情况(图1A)。4、检测细胞内miR-185的表达量(qRT_PCR检测)Trizol 试剂购 自 Invitrogen ；TaqMan Gene Expression Master Mix、 TaqManMicroRNA Reverse Transcription Kit、hsa—miR-185 RT primer、hsa-miR-185 real-time pcrprimer、RNU6B RT primer、RNU6B real-time per primer 购自 ABI01)总RNA提取、检测分别向786-0细胞系中转染miR-185类似物或miR-185抑 制剂及阴性对照后24小时，收集样品，用Trizol法提取总RNA并用分光光度计检测RNA样 的质量和浓度。2)miR_185表达量的检测(I)RT-PCR(a)试剂置于冰上溶解15-20min。振荡混勻后轻微离心；(b)按下表配制反转录混合液(RT-Mix)，充分混勻，置于冰上
权利要求
1.如下1)、2)、3)或4)或5)所示的物质在如下I、II或III中的应用1)SEQ ID NO 1所示的RNA分子；2)SEQ ID NO 2所示的RNA分子；3)编码1)所示分子的DNA或表达1)所示分子的载体；4)编码2)所示分子的DNA或表达2)所示分子的载体；5)由Ambion 公司制造的产品，产品名称为 Pre-miR miRNA Precursorhsa-miR-185, 产品 Cat# :AM17100，产品 ID :PM12486，产品规格:5nmol ；1.制备具有增强细胞和/或组织和/或机体对辐射敏感性功能的产品；II、制备具有治疗和/或预防肿瘤功能产品；III、制备抑制基因ATR激活或介导的信号通路的产品、制备抑制蛋白ATR激活或介导 的信号通路的产品、制备抑制基因ATR的产品、和/或制备抑制蛋白ATR的产品。
2.基因ATR作为靶点在如下IV或V中的应用；蛋白ATR作为靶点在如下IV或V中的 应用；基因ATR激活或介导的信号通路作为靶点在如下IV或V中的应用；蛋白ATR激活或 介导的信号通路作为靶点在如下IV或V中的应用；IV、设计和/或筛选和/或制备具有治疗和/或预防肿瘤功能产品；V、设计和/或筛选和/或制备具有增强细胞和/或组织和/或机体对辐射敏感性功能 的产品。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述增强细胞和/或组织和/或机 体对辐射敏感性功能为促进辐射后的细胞的凋亡；所述治疗和/或预防肿瘤为如下1)或2)或3)或4)所示1)抑制肿瘤的生长；2)抑 制肿瘤的成瘤能力；3)抑制肿瘤细胞的生长；4)辅助增强肿瘤的辐射敏感性。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于所述增强细胞和/或组织和/或 机体对辐射敏感性功能的产品为辐射增敏剂。
5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于所述辐射为非电离辐射或电离 辐射；所述非电离辐射为紫外线，所述电离辐射为X射线；所述紫外线为UVA或UVB。
6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于所述增强细胞和/或组织和/或 机体对辐射敏感性是通过1)、2)、3)、4)或5)所示的物质抑制基因ATR激活或介导的信号 通路、抑制蛋白ATR激活或介导的信号通路、抑制基因ATR的表达或抑制蛋白ATR的表达实 现的；所述治疗和/或预防肿瘤是通过1)、2)、3)、4)或5)所示的物质抑制基因ATR激活或介 导的信号通路、抑制蛋白ATR激活或介导的信号通路、抑制基因ATR的表达或抑制蛋白ATR 的表达实现的。
7.根据权利要求1-6中任一所述的应用，其特征在于所述抑制基因ATR激活或介导 的信号通路、抑制蛋白ATR激活或介导的信号通路、抑制基因ATR的表达或抑制蛋白ATR的 表达是通过如下方式实现的所述1)、2)、3)、4)或5)所示的物质与所述ATR基因3’端非 转录区域靶位点结合。
8.根据权利要求1-7中任一所述的应用，其特征在于所述与所述ATR基因3’端非转 录区域靶位点结合为与NM_001184. 3所示序列中第8165-8186位核苷酸结合或与SEQ ID NO 3所示序列中第8165-8186位核苷酸结合。
9.根据权利要求1-8中任一所述的应用，其特征在于所述增强细胞和/或组织和/或 机体对辐射敏感性中，所述细胞为肿瘤细胞；所述肿瘤为肾癌、黑色素瘤、宫颈癌或胃癌；所述治疗和/或预防肿瘤中，所述肿瘤为肾癌、黑色素瘤、宫颈癌或胃癌。
10.根据权利要求1-9中任一所述的应用，其特征在于所述增强细胞和/或组织和/或机体对辐射敏感性中，所述肾癌的细胞为人肾透明细 胞腺癌细胞786-0 ；所述黑色素瘤为小鼠黑色素瘤B16细胞；所述宫颈癌的细胞为HeLa ；所 述胃癌的细胞为BGC-823或MGC-803 ；所述治疗和/或预防肿瘤中，所述肾癌的细胞为人肾透明细胞腺癌细胞786-0 ；所述 黑色素瘤为小鼠黑色素瘤B16细胞；所述宫颈癌细胞为HeLa ；所述胃癌细胞为BGC-823或 MGC-803。
全文摘要
本发明涉及hsa-miR-185的新用途。该新用途为miR-185在如下I、II或III中的应用I、制备具有增强细胞和/或组织和/或机体对辐射敏感性功能的产品；II、制备具有治疗和/或预防肿瘤功能产品；III、制备抑制ATR基因激活或介导的信号通路的产品、制备抑制ATR蛋白激活或介导的信号通路的产品、制备抑制ATR基因的产品、和/或制备抑制ATR蛋白的产品。实验证明，miR-185可以直接抑制肿瘤生长和增强细胞对辐射的敏感性。进一步实验证明，miR-185的上述功能是通过抑制细胞内的ATR基因的表达实现的。因此，将miR-185用于制备治疗肿瘤的药物及辐射增敏剂，将对肿瘤的治疗具有重要意义和广阔的应用前景。
文档编号A61K48/00GK102102102SQ20101057785
公开日2011年6月22日 申请日期2010年12月2日 优先权日2010年6月12日
发明者丁楠, 何进鹏, 周光明, 徐瑚珊, 朱佳贇, 胡文涛, 苏锋涛 申请人:中国科学院近代物理研究所