专利名称：一种ev71病毒样颗粒及以其制备的手足口病疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种EV71病毒样颗粒及以其制备的手足口病疫苗。
背景技术：
自1957年以来，手足口病在世界多个国家爆发流行，特别是20世纪90年代以来， 在亚太地区流行日益猖獗。2007年以来中国大陆发生手足口病爆发流行，至2010年9月底，累计报告300多万儿童感染手足口病，严重威胁儿童的身体健康和生命安全。手足口病的病原体主要是小RNA病毒，肠道病毒属成员，主要是柯萨奇A组16型(Coxsakie A16， CoxA16)和肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)，其中EV71病毒是导致神经系统并发症和死亡病例的主要病原体。目前还没有有效的疫苗用以预防EV71，但脊髓灰质炎疫苗在控制全球脊髓灰质炎病毒传播中的成功实践，给EV71疫苗的研制带来了希望。不同形式的EV71疫苗都处于研发阶段，研究发现福尔马林灭活的EV71疫苗产生的中和抗体(1 64)比自然感染的中和抗体(1 128)低，可能是因为福尔马林灭活的EV71疫苗在制备过程中破坏了 B细胞表位。 研究也发现热灭活的全病毒疫苗诱导的中和抗体滴度比自然感染明显低，可能也与破坏构象表位有关；并且灭活疫苗存在灭活不完全的风险。减毒活疫苗可以保存构象表位，但也存在毒力回复的风险。病毒样颗粒(Virus Like Particle，VLP)疫苗的发展为如何研发既保持构象表位并且无毒力回复风险的疫苗提供了一种新的研究策略。VLP疫苗是通过分子生物学技术，表达病毒的一个或多个结构蛋白，这些结构蛋白具有天然的自装配能力，可形成与真正病毒颗粒相同或相似的空心颗粒，没有病毒的核酸，不能自主复制，没有感染性，不存在灭活不完全或毒力回复的风险，并且表面有高密度的病毒抗原，保存了构象表位，可通过和全病毒疫苗一样的途径呈递给免疫细胞，有效诱导机体免疫系统产生免疫保护反应。目前国内外有多家研究组进行EV71病毒颗粒疫苗的研制，发表的文献(Chung YC, Huang JH, Lai Cff, et al. Expression, purification and characterization of enterovirus-71 virus-like particles. World J Gastroenterol 2006 ;12 :921-927 ；)主要用重组杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达EV71的3⑶和Pl蛋白，3⑶蛋白酶能将Pl 前蛋白酶切为VP1，VP3和VPO三个蛋白，这三个蛋白能自动组装成VLPs，能诱导产生Thl 和Th2免疫反应。用VLPs免疫的母鼠能给用EV71病毒致死攻击的乳鼠提供免疫保护，表明EV71VLPS是一种有效的疫苗。但是，由于目前主要用昆虫细胞制备VLPs，培养条件要求较高；又由于是胞内表达，VLP纯化过程复杂，限制了大规模的生产需求；而且杆状病毒-昆虫细胞系统另一个主要的缺陷是产生杆状病毒颗粒及其他明显影响疫苗效果的污染物，由于杆状病毒颗粒很难和制备的VLP分离开来，制备的VLP应用于临床需要进行化学灭活处理等措施，这些处理可能会影响制备的VLP的质量。
发明内容
有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种从新的表达系统获得的EV71病毒样颗粒，该EV71病毒样颗粒易于培养获得，适合工业化生产，且便于纯化。本发明的另一目的是提供以上述EV71病毒样颗粒制备的手足口病疫苗。本发明提供的一种EV71病毒样颗粒，其中，所述EV71病毒样颗粒的制备过程包括(1)重组质粒的构建用EV71病毒的Pl蛋白基因和3⑶蛋白酶基因与pGAPZaA质粒分别连接后构建Pl-pGAPZ a A和3⑶-pGAPZ a A重组质粒；(2)重组质粒转入表达菌株所述重组质粒依次转入毕赤酵母SMDl 168表达菌株，得到Pl-pGAPZ a A_3CD_pGAPZ a A-SMDl 168 毕赤酵母重组表达菌株；(3)菌体培养及EV71病毒样颗粒纯化培养所述毕赤酵母重组表达菌株，离心分离上清液，所述上清液经超速离心后的沉淀用蔗糖密度梯度离心，获得EV71 病毒样颗粒。本发明通过构建并培养能够表达EV71病毒样颗粒的毕赤酵母重组表达菌株，成功的获得了一种易于通过菌体培养获得，适合工业化生产，且便于纯化的EV71病毒样颗粒。进一步，所述Pl-pGAPZ a A重组质粒是将Pl蛋白基因与pGAPZaA质粒均用RiilI 内切酶和^iclI内切酶分步双酶切后，用T4DNA连接酶将Pl基因和pGAPZaA质粒双酶切产物连接得到。 进一步，所述3⑶-pGAPZ a A重组质粒是将所述3⑶蛋白酶基因和pGAPZaA质粒均用EcoRI和^CbaI内切酶分步双酶切后，用T4DNA连接酶将3⑶蛋白酶基因和pGAPZaA质粒双酶切产物连接得到。进一步，所述3⑶蛋白酶基因和Pl蛋白基因是以EV71病毒RNA反转录的cDNA为模板，用PCR方法扩增获得。进一步，所述重组质粒转入表达菌株是用电穿孔仪先将所述3⑶-pGAPZaA质粒转入SMDl 168酵母表达菌株，用低浓度博莱霉素zeocin筛选得到3⑶-pGAPZ α A-SMD1168 重组表达菌株，然后再将所述Pl-pGAPZ α A质粒转入3⑶-pGAPZ α A-SMDl 168重组表达菌株，用高浓度博莱霉素zeocin筛选得到Pl-pGAPZ α A_3CD_pGAPZ α A-SMDl 168重组表达菌株。进一步，所述低浓度博莱霉素zeocin是指100 μ g/ml浓度的博莱霉素，所述高浓度zeocin是指500 μ g/ml浓度的博莱霉素。进一步，所述EV71病毒样颗粒纯化是将所述毕赤酵母重组表达菌株培养菌液 5000转/分钟转速离心10分钟，取上清，超速离心28000转/分钟转速离心4小时，弃上清， 沉淀用磷酸盐缓冲液PBS溶解，铺于不连续重量百分比蔗糖梯度15^^30^^45%和60% 上，于28000转/分钟4°C离心1小时，收集15% -30%层病毒带，用磷酸缓冲液稀释，28000 转/分钟4°C离心2. 5小时，弃去上清液，即得纯化的EV71病毒样颗粒。本发明提供的一种手足口病疫苗，所述疫苗的制备方法包括(1)重组质粒的构建用EV71病毒Pl蛋白基因和3CD蛋白酶基因与pGAPZaA质粒分别连接后构建 Pl-pGAPZ α A和3⑶-pGAPZ α A重组质粒；(2)重组质粒转入表达菌株所述重组质粒依次转入毕赤酵母SMD1168表达菌株，得到Pl-pGAPZ α A_3CD_pGAPZ α A-SMDl 168重组表达菌株；C3)菌体培养及EV71病毒样颗粒纯化培养所述毕赤酵母重组表达菌株，离心分离上清液，所述上清液经超速离心后沉淀用蔗糖密度梯度离心，获得EV71病毒样颗粒；(4)制备疫苗所述EV71病毒样颗粒用磷酸缓冲液溶解到40 μ g/ml，与等体积弗氏完全佐剂相混合制成疫苗。本发明的有益效果在于1.表达本发明EV71病毒样颗粒的毕赤酵母重组表达菌株易于筛选得到重组转化子具有kocin抗性标记基因，可直接用kocin进行筛选，大大简化了重组转化酵母的筛选过程。2.本发明的EV71病毒样颗粒适于制备疫苗本发明选择的毕赤酵母重组表达菌株具有真核生物表达蛋白质的特点一正确加工、修饰、合理的空间折叠，不含内毒素和其他有害物质，使用安全；由于毕赤酵母加到翻译蛋白上的糖链比酿酒酵母短得多，并且毕赤酵母极少出现过渡糖基化，可避免外源蛋白生产过强的免疫原性或因糖链过长干扰外源蛋白正确折叠而影响其功能。3.适于工业化生产本发明选择的毕赤酵母重组表达菌株同时具有原核细胞生长快、易于培养、遗传操作简单、繁殖速度快，对培养条件要求低，培养基价廉，能进行高密度培养，且能耐受较高的液体静压，便于工业化生产等特点。4.稳定性好pGAPZ α A质粒能与酵母宿主细胞的染色体基因组DNA发生同源重组，质粒稳定，不易丢失；所采用的毕赤酵母SMD1168菌株是蛋白酶缺陷菌株，可有效降低外源目的蛋白的酶解。5.便于纯化启动子为GAP，不需甲醇诱导，便于疫苗生产；同时含有α分泌信号，将蛋白分泌至胞外，便于纯化。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中图1为本发明构建的3⑶-pGAPZ α A重组质粒构建流程图；图2为本发明构建的Pl-pGAPZ α A重组质粒构建流程图；图3为本发明构建的Pl-pGAPZa A-3CD_pGAPZa A-SMD1168重组菌株表达制备 EV71病毒样颗粒构建流程图；图4为本发明EV71病毒样颗粒与对照组免疫小鼠后总IgG抗体滴度图；图5为本发明EV71病毒样颗粒与对照组中和抗体滴度图；图6为本发明EV71病毒样颗粒与对照组免疫小鼠淋巴细胞增殖图；图7 为本发明EV71病毒样颗粒与对照组VLP刺激脾细胞产生细胞因子的浓度图；其中1 =SMDl 168菌对照组 2 空质粒重组菌对照组3:灭活疫苗组4:VLP组
具体实施例方式以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。实施例本发明EV71病毒样颗粒的制备本发明所采用的RT-PCR、酶切、连接等分子生物学实验方法可参考《分子克隆》第二版。制备本发明EV71病毒样颗粒的基础材料包括EV71病毒Pl基因、3⑶基因、 pGAPZ α A质粒(美国hvitrogen公司产品)、SMDl 168酵母菌株(美国hvitrogen公司广品)O一、Pl基因，3CD基因克隆1.第一链 cDNA 制备用上海生工重组禽类成髓纤维病毒逆转录酶(AMV)第一链cDNA反转录试剂盒将 EV71病毒RNA反转录为cDNA。2.引物设计借助I^rimer Premier 5. 0软件设计Pl基因和3⑶基因引物，由上海生工合成，下横线为酶切位点Pl-上游引物(Pml 1)5’ -TATCTACACGTGCATGGGTTCGCAGGTGTCTAC-3’ Pl-下游引物(SacII) 5，-TATCGTCCGCGGCTAAAGAGTAGTGATCGCTGT-3’ ；3CD-上游引物(EcoRI) 5，-AGCAGAATTCATGGGCCCGAGTCTTGATTT-3 ‘；3CD-下游引物(XbaI) 5，-GCCGTCTAGACTAAAATAACTCGAGCCAATTGCGTC-3’。3. EV71 Pl 和 3CD 基因 PCR 扩增用Takara公司PrimerSTAR HS DNA多聚酶以反转录的cDNA为模板用PCR方法扩增Pl基因和3CD基因，方法如下Pl基因PCR反应体系
dH2031. 5μ 1
5XPrimerSTAR HS DNA polymerase buffer10 μ 1
dNTP(2. 5mmol)4μ 1
Pl上游引物(ΙΟμπιοΙ)1 μ 1
Pl上游引物(ΙΟμπιοΙ)1 μ 1
cDNA2μ 1
PrimerSTAR HS DNA polymerase0. 5μ 1
50 μ 1
Pl基因PCR反应条件
98°C, 10s,
60°C, 15s,
72°C,3min ；30 个循环；
72°C, IOmin ；
4°C。
3⑶基因PCR反应体系
dH2031. 5μ 1
5XPrimerSTAR HS DNA polymerase bufferdNTP(2. 5mmol)3CD 上游引物(ΙΟμπιοΙ)3CD 上游引物(ΙΟμπιοΙ)cDNAPrimerSTAR HS DNA polymerase_
10 μ 1 4μ 1 1 μ 1 1 μ 1 2μ 1 0. 5μ 1
50 μ 13CD基因PCR反应条件98°C, 10s,60°C, 15s,72 °C，2min ; 30 个循环；72°C, IOmin ；4°C。4. Pl 基因，3CD 基因，pGAPZaA 双酶切Pl基因和pGAPZaA质粒用PmlI内切酶(NEB公司)禾Π SacII (NEB公司)内切酶分步进行酶切，3⑶基因和pGAPZaA质粒用EcoRI (NEB公司)和)(bal (NEB公司)内切酶分步进行酶切。4. 1纯化Pl基因和3⑶基因PCR产物用上海生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收纯化Pl基因和3⑶基因PCR产物，方法步骤如下(I)Pl基因和3⑶基因PCR产物用琼脂糖凝胶电泳；(2)紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，放在1. 5ml离心管中，用Iml TE缓冲液洗一次。用吸头彻底吸掉液体并用之捣碎凝胶。离心数秒，加入4倍凝胶体积的溶胶液 Binding Buffer II ；(3)将离心管放在60°C水浴中lOmin，每^iin温和地颠倒以加速凝胶的溶化；(4)等凝胶彻底融化成为胶溶液后，将胶溶液转移到套放在2ml收集管内带吸附膜的 UNIQ-10 柱中，静置 2min，8000rpm 离心 Imin ；(5)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的滤液，将UNIQ-10柱重新装在收集管中；(6)加入500 μ 1洗涤液WB于离心柱中，8000rpm离心Imin ；(7)倒掉收集管中的滤液，将UNIQ-10柱重新装在收集管中。再加入500 μ 1洗涤液WB于离心柱中8000rpm离心Imin ；(8)弃滤液，将UNIQ-10柱重新装在收集管中，12，OOOrpm离心anin，取下UNIQ-10 柱自然晾干IOmin ；(9)将晾干后的UNIQ-10柱装在一个新的高压灭菌处理过的1. 5ml离心管中，向离心柱膜中央加入40 μ 1洗脱液(Elution Buffer)，室温静置5min ；(10) 12，OOOrpm离心1分钟，洗脱DNA，冻存于_20°C备用。4. 2 提取 pGAPZ α A 质粒用上海生工小量质粒提取试剂盒提取pGAPZ α A质粒，方法如下
(1)用接种环接种含pGAPZ α A质粒DH5 α冻存菌于kocin+(25 μ g/mL) LB平皿， 37°C 培养 16h ；(2)用无菌牙签从LB平板挑取白色单菌落，接种于3mL Zeocin+(25 μ g/mL) LB培养液中，37°C 250r/min振荡培养12-16h ；(3)无菌移取1. 5mL菌液置印pendorf管中，12000r/min离心3min，弃上清；(4)每管加入100 μ L预冷的Sollution I (含RNase Α)，用涡旋器振荡悬浮；(5)加入200 μ L新配制的Sollution II，温和倒置3_4次混勻，使细菌裂解，室温放置2min ；(6)加入350 μ L预冷的SollutionIII，颠倒混和10次，使之充分中和，室温放置 5min ；(7) 12000r/min 离心 IOmin ；(8)将上清转移至套放在2ml收集管内带吸附膜的UNIQ-IO柱中，静置aiiin， 8000rpm 离心 30s ；(9)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的滤液，将UNIQ-10柱重新装在收集管中；(10)加入500 μ 1洗涤液WB于离心柱中，IOOOOrpm室温离心Imin ；(11)倒掉收集管中的滤液，将UNIQ-10柱重新装在收集管中。再加入500 μ 1洗涤液WB于离心柱中IOOOOrpm室温离心Imin ；(12)弃滤液，将UNIQ-10柱重新装在收集管中，12，OOOrpm离心2min，取下 UNIQ-10柱自然晾干IOmin ；(13)将晾干后的UNIQ-10柱装在一个新的高压灭菌处理过的1. 5ml离心管中，向离心柱膜中央加入40 μ 1洗脱液(Elution Buffer)，室温静置5min ；(14) 12，OOOrpm离心1分钟，洗脱DNA，冻存于_20°C备用。4. 3P1基因和pGAPZ α A质粒SacII单酶切(1)纯化的Pl基因用SacII单酶切，反应体系dH2037 μ 110ΧΝΕΒ buffer 45μ 1Pl PCR 胶回收产物 Ο90μ g/ml)7μ 1SacII1 μ 1_Q)pGAPZaA用SacII单酶切，反应体系dH2010XNEB buffer 4pGAPZaA 质粒(53 μ g/ml)SacII_(3)Pl基因和pGAPZaA SacII单酶切条件37°C，2h，
6 μ 1 5 μ 1
50 μ 1
50 μ 1
38 μ 1 1 μ 10127]65°C,20min。
0128]4. 43CD基因和pGAPZaA质粒EcoRI单酶切
0129](1)纯化的3⑶基因用EcoRI单酶切，反应体系
0130]dH2030 μ 1
0131]IOXNEB EcoRI buffer5μ 1
0132]3CD PCR 胶回收产物(145μ g/ml)14 μ 1
0133]EcoRI1 μ 1
0134]_
0135]50 μ 1
0136](2)提取的pGAPZaA用EcoRI单酶切，反应体系
0137]dH206μ 1
0138]IOXNEB EcoRI buffer5μ 1
0139]pGAPZaA(53 μ g/ml)38 μ 1
0140]EcoRI1 μ 1
0141]_
0142]50 μ 1(3) 3CD 基因和 pGAPZaA EcoRI 单酶切条件37°C，2h，65°C,20min。4. 5P1基因，pGAPZaA SacII单酶切产物，3CD基因和pGAPZaA EcoRI单酶切产物分别纯化用上海生工PCR产物回收试剂盒分别回收，按厂家说明书进行操作，步骤如下(1)将酶切产物移至灭菌的1.5ml离心管中，加入5倍体积的溶胶液Binding Buffer II ；(2)将混合液转移到套放在2ml收集管内带吸附膜的UNIQ-IO柱中，室温静置 2min，6000rpm 离心 Imin ；(3)取下UNIQ-IO柱，倒掉收集管中的滤液，将UNIQ-IO柱重新装在收集管中；(4)加入500 μ 1洗涤液WB于离心柱中，8000rpm离心Imin ；(5)倒掉收集管中的滤液，将UNIQ-IO柱重新装在收集管中。再加入500 μ 1洗涤液WB于离心柱中8000rpm离心Imin ；(6)弃滤液，将UNIQ-IO柱重新装在收集管中，12000rpm离心anin，取下UNIQ-IO 柱自然晾干IOmin ；(7)将晾干后的UNIQ-IO柱装在一个新的高压灭菌处理过的1. 5ml离心管中，向离心柱膜中央加入40 μ 1洗脱液(Elution Buffer)，室温静置5min。(8) 12000rpm离心1分钟，洗脱DNA，冻存于_20°C备用。4. 6P1基因，pGAPZaA SacII单酶切纯化产物用PmlI 二次酶切(I)Pl基因SacII单酶切纯化产物用RiilI双酶切反应体系dH208. 5μ 1IOXNEB buffer 15μ 10160]Pl SacII单酶切回收产物；35 μ 1
0161]100 X BSA0. 5 μ 1
0162]PmlI1 μ 1
0163]_
0164]50 μ 1
0165](2)pGAPZaA质粒SacII单酶切纯化产物用RiilI双酶切反应体系
0166]dH208. 5μ 1
0167]10ΧΝΕΒ buffer 15μ 1
0168]pGAPZaA SacII单酶切回收产物35 μ 1
0169]100 X BSA0. 5 μ 1
0170]PmlI1 μ 1
0171]_
0172]50 μ 1(3)Pl基因SacII单酶切纯化产物和pGAPZaA质粒SacII单酶切纯化产物PmlI双酶切条件37°C，2h，65°C,20min。4. 7 3⑶基因，pGAPZaA EcoRI单酶切回收产物)(bal进行双酶切(1)3CD基因EcoRI单酶切回收产物)(bal双酶切反应体系
0178]dH2012. 5μ 1
0179]10ΧΝΕΒ buffer 25μ 1
0180]3CD )(bal单酶切回收产物31 μ 1
0181]100 X BSA0. 5 μ 1
0182]XbaI1 μ 1
0183]_
0184]50 μ 1
0185](2) pGAPZaA EcoRI单酶切回收产物)(bal双酶切反应体系
0186]dH2012. 5μ 1
0187]10ΧΝΕΒ buffer 25μ 1
0188]3CD )(bal单酶切回收产物31 μ 1
0189]100 X BSA0. 5 μ 1
0190]XbaI1 μ 1
0191]_
0192]50 μ 1(3)3CD基因EcoRI单酶切回收产物，pGAPZaA EcoRI单酶切回收产物)(bal双酶切条件37°C，2h，65°C,20min。5.双酶切产物纯化
Pl 基因，pGAPZaA SacII, PmlI 双酶切产物，3CD 基因和 pGAPZaAEcoRI，XbaI 双酶切用上海生工PCR产物回收试剂盒分别回收，按厂家说明书进行操作，同本章1.6. 1。6.纯化双酶切产物连接用Takara公司的T4DNA连接酶分别将Pl基因和pGAPZaA质粒双酶切产物(hell， Bull)，3CD基因和pGAPZaA质粒双酶切产物(EcoRI，XbaI)进行连接。(I)Pl基因和pGAPZaA质粒双酶切产物连接体系10XT4 DNA ligase buffer1 μ 1Pl 基因双酶切产物(SacII，PmlI)7μ 1pGAPZaA 双酶切产物(SacII，PmlI)1 μ 1Τ4 DNA ligase1 μ 1_10 μ 1Pl基因和pGAPZaA质粒双酶切产物连接条件16°C，24h。(2) 3⑶基因和pGAPZaA质粒双酶切产物连接体系dH205μ 110ΧΤ4 DNA ligase buffer2. 5μ 13CD基因双酶切产物15 μ 1pGAPZaA 双酶切产物(EcoRI，XbaI)1. 5 μ 1Τ4 DNA ligase1 μ 1_25 μ 1pGAPZaA (EcoRLXbaI)自连对照连接体系dH2020 μ 110ΧΤ4 DNA ligase buffer2. 5 μ 1pGAPZaA 双酶切产物(EcoRI，XbaI)1. 5 μ 1T4 DNA ligase1 μ 1_25 μ 13⑶基因和pGAPZaA质粒双酶切产物连接条件16°C，20h。7.转化Dffia感受态细胞Pl基因和pGAPZaA质粒连接产物，3⑶基因和pGAPZ α A质粒连接产物， pGAPZaA (SacI I, PmlI)自连对照，pGAPZ α A (EcoRI，XbaI)自连对照连接产物分别转化 Dffia感受态细胞，用抗生素koCin+LB(25y g/ml)平板筛选阳性克隆。方法如下(1)取出4管100μ lDH5a感受态细胞，置冰上；
(2)分别加入Pl基因-pGAPZ α A质粒，3CD基因-pGAPZ α A质粒连接产物 pGAPZ α A(SacILPmlI)自连对照，pGAPZ α A (EcoRI，XbaI)自连对照连接产，各 10 μ 1，轻轻摇勻，冰上放置30min ；(3) 42°C水浴中热击 90s ；(4)迅速置冰上4min ；(5)向管中加入ImlLB液体培养基(不含抗生素)；(6)移入试管中，37°C振荡培养lh，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒抗性基因；(7)取500 μ 1涂布于含抗生素koCin+LB(25 μ g/ml)的筛选平板上，倒置37°C培养 16h。8.阳性克隆鉴定挑取阳性克隆，用Zeoc in+LB (25 μ g/ml)培养，用菌液为模板分别做P1基因， 3CD基因PCR进行筛选初步鉴定，PCR条件如上。扩增出Pl基因或3CD基因菌落为阳性菌落，培养提取重组质粒，分别命名为Pl-PGAPZ α A, 3⑶-pGAPZ α Α,以提取质粒为模板，再用 PCR进行鉴定，阳性质粒送上海生工进行测序对连接插入方向和基因序列进行鉴定，测序引物为质粒多克隆酶切位点两端序列，上游引物5-CTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAG-3’ ；下游引
物，--GCGCTATTCAGATCCTCTTCTG-3，。
二、制备重组酵母菌株
1.重组质粒线性化
用BspHI (NEB公司切酶单酶切Pl-pGAPZaA，3CD_pGAPZaA重组质粒，使线性化,
(l)Pl-pGAPZaA BspHI 单酶切体系
dH2048 μ 1
10XNEB buffer 410 μ 1
Pl-pGAPZaA40 μ 1 (2 μ g)
BspHI2μ 1
100 μ 1
(2) 3CD-pGAPZaA BspHI 单酶切体系
dH2048 μ 1
10XNEB buffer 410 μ 1
3CD-pGAPZaA40 μ 1 (2 μ g)
BspHI2μ 1
100 μ 1
(3) BspHI单酶切条件
37°C, IOh,
65°C,20mino
2.线性化重组质粒转化SMDl 168酵母菌株
2. ISMDl 168酵母感受态制备
(1)取SMD1168菌种用接种环接种在YPD培养皿，30°C培养约48h ；(2)挑取SMD1168单克隆接种于3ml YPD液体培养基中，30°C，300rpm培养约20h ；(3)取 Iml 菌液接种于 100ml YPD 中，30°C，300rpm 培养至 0D600 为 1. ；35，约 IOh ；(4)3000g，4°C离心 5min，弃上清；(5)沉淀中加入8mlYPD和2mlHEPES，悬浮细胞，轻轻混勻；(6)加入 250 μ 1 IM DTT，30°C静置培养 15min ；(7)加入约40ml预冷的IM山梨醇至终体积50ml ；(8)3000g，4°C离心 5min，弃上清；(9)加入50ml预冷的IM山梨醇，轻轻吹打，悬浮细胞；(10)3000g，4°C离心 5min，弃上清；(11)加入25ml预冷的IM山梨醇，轻轻吹打，悬浮细胞；(12)3000g，4°C离心 5min，弃上清；(13)加入100 μ 1预冷的IM山梨醇，轻轻吹打，悬浮细胞，置冰上。2. 2电穿孔转化SMDl 168感受态细胞(1)电转杯用预冷的灭菌水和IM山梨醇分别冲洗三遍，置冰上预冷；(2)取 1 μ g 线性化的 Pl-pGAPZaA 或 3CD_pGAPZaA 禾Π 40 μ 1 制备的 SMDl 168 感受态细胞在冰上混勻，加入电转杯中；(3)2000V，8msec 电击；(4)往电转杯中迅速加入Iml预冷的IM山梨醇；(5)转入15ml离心管中，30°C静置培养Ih ；(6)加入 Iml YPD，200rpm，30°C 培养 Ih ；(7)取菌液 200 μ 1，涂 Zeocin+YPD(100 μ g/ml)平板，筛选 3CD_pGAPZaA 阳性克隆。3. SMDl 168重组菌株鉴定3. 1菌液培养挑取阳性克隆接种于5ml Zeocin+YPD (100 μ g/ml)培养液中培养约24h。3. 2提取酵母基因组用天根生物公司酵母基因组提取试剂盒提取阳性菌株基因组DNA，方法如下(1)取酵母细胞，12000rpm离心lmin，尽量吸除上清；(2)向菌体中加入600 μ 1山梨醇buffer，加入大约50Ulyticase，充分混勻。30°C 处理30min，4000rpm离心lOmin，弃上清，收集沉淀；(3)向沉淀中加入200 μ 1缓冲液GA重悬沉淀，充分混勻；(4)加入20 μ 1蛋白酶K溶液，混勻；(5)加入220 μ 1缓冲液GB，充分颠倒混勻，70°C放置lOmin，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；(6)加入220 μ 1无水乙醇，充分颠倒混勻，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以
去除管盖内壁的水珠；(7)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个放入收集管的吸附柱中，12000rpm 离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
(8)向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液⑶，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；(9)向吸附柱CB3中加入700 μ 1漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；(10)向吸附柱CB3中加入500 μ 1漂洗液Pff, 12000rpm离心30s，倒掉废液；(11)将吸附柱CB3放入收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；(12)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50-200 μ 1洗脱缓冲液ΤΕ，室温放置5min，120000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。3. 3重组菌株PCR鉴定取提取的酵母基因组DNA2 μ 1为模板，用PCR方法扩增Pl或3⑶基因，PCR结果阳性者为重组成功菌株。4. Pl-pGAPZ α A-3CD-pGAPZaA_SMDl 168 重组菌株制备及鉴定(1)用3⑶-pGAPZaA重组SMDl 168菌株制备成感受态细胞，方法同上；(2)用线性化Pl-pGAPZaA电转制备的3CD_pGAPZaA重组SMDl 168感受态细胞，方法同上；(3)用抗生素 kocin+YPD (500 μ g/ml)平板筛选 Pl-pGAPZaA_3CD-pGAPZaA 重组 SMDl 168阳性克隆，方法同上；(4)挑取阳性克隆接种于5ml Zeocin+YPD (100 μ g/ml)培养液中培养约24h ；(5)用天根公司酵母基因组提取试剂盒提取阳性菌株基因组DNA ；(6)取提取的酵母基因组DNA2 μ 1为模板，用PCR方法扩增Pl和3⑶基因，Pl和 3⑶共同阳性者为重组成功菌株，命名为Pl-pGAPZaA-3⑶-pGAPZaASMD1168酵母菌株。5.病毒样颗粒纯化培养菌液50ml，5000rpm离心lOmin，取上清，超速离心28000rpm/min离心4h，弃上清，沉淀用PBS溶解。然后铺于不连续蔗糖梯度(15，30，45和60% )上，于观，OOOrpm/ min 4°C离心lh，分别收集15%-30%、3% _45%、45%-60%三层病毒带。用磷酸缓冲液稀释，28，000rpm/min 4°C离心 2. 5h，弃去上清液，将沉淀溶于TE (10mmol/L Tris-HCl，lmmol/ L EDTA，pH 7.4)溶液中。从15%-30%这条带内取乳白色病毒带，即为纯化的病毒样颗粒。试验例EV71病毒样颗粒免疫原性试验1.材料和方法1.1免疫原制备5L 培养基接种 Pl-pGAPZa A-3CD_pGAPZa A SMDl 168 重组菌后，30 °C，250rpm/ min,培养96h, 5，000rpm/min离心lOmin，取上清，超速离心28，000rpm/min离心4h，弃上清，沉淀用PBS溶解。然后铺于不连续蔗糖梯度(15，30，45和60% )上，于观，OOOrpm/min 4°C离心lh，收集15% -30%之间乳白色带，用磷酸缓冲液稀释，28，000rpm/min 4°C离心 2. 5h，弃去上清液，得EV71 VLP (即本发明的EV71病毒样颗粒)。RDa细胞培养EV71毒株，收获病毒液，病毒液超速离心后用不连续蔗糖密度梯度进行纯化，纯化方法同制备EV71 VLP。纯化的病毒56°C灭活30min，作为灭活疫苗组。培养SMDl 168菌和空质粒(pGAPZ α A) SMDl 168重组菌，用与制备VLP同样的方法处理菌液，得到的产物作为对照组，分别称为SMD1168菌对照组和空质粒重组菌对照组。1.2小鼠免疫在中山大学实验动物中心购买6-8周雌性，BABL/C小鼠40只，在中山大学公共卫生学院SPF二级实验室饲养。共分4组，每组10只小鼠，第一组为SMDl 168菌对照组，第二组为空质粒重组菌对照组，第三组为灭活疫苗组，第四组为VLP组。每组制备产物用PBS溶解为40μ g/ml，每只小鼠用0. 25ml (10 μ g)产物和等体积弗氏完全佐剂进行免疫，免疫方式均为皮下注射；初次免疫后第2，4，6，8，10，12，14，16周从尾静脉取血，离心取上清，-80°C 保存；初次免疫后第4周，各组用与初次免疫相同的抗原进行加强免疫；初次免疫后第16 周，颈椎脱白处死所有小鼠取脾。1.3体液免疫检测1. 3. 1三明治ELISA法检测总IgG(1)包被取96孔ELISA微孔板，每孔加入100 μ 1 1 2000倍稀释的兔抗EV71 抗体，4°C过夜；(2)封闭加入5%脱脂奶粉进行封闭，室温摇床，反应池；(3)洗涤弃封闭液，用TBST洗板3次；(4)加抗原加入100 μ 1热灭活EV71病毒，37°C反应2h ；(5)洗涤弃去灭活病毒液，用TBST洗板5次，在滤纸上印干；(6)加一抗血清加入倍比稀释的血清(22_212)，37°C反应2h ；(7)洗涤弃去倍比稀释的血清，用TBST洗板5次，在滤纸上印干；(8)加二抗加入1 3000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG 二抗；(9)洗涤弃二抗，用TBST洗板5次，在滤纸上印干(10)加入底物显色每孔加入IOOul 3，3，5，5_四甲基联苯胺，充分混勻后置 37 °C, 15min ；(11)终止反应显色结束后，每孔加入100 μ L 2Μ的H2SO4终止液终止反应；(12)测定光密度OD值30min内用酶标仪在450nm处测OD值，彡阴性对照孔OD 值1.5倍判为阳性。1.3.2中和抗体检测1. 3. 2. 1TCID50 测定1. 3. 2. 1. 1材料与试剂(1)EV71 病毒悬液；(2) RDa 细胞；(3)消化液0· 25%胰蛋白酶；(4) DMEM维持液(DMEM+2 %胎牛血清、1 %青链酶素)；(5) DMEM培养液(DMEM+10%胎牛血清、1 %青链酶素)。1. 3. 2. 1. 2实验前准备实验所用RDa细胞在细胞培养室常规传代培养，置(X)2孵箱培养至单层细胞，接种病毒前，弃掉细胞培养液，用Hank’ s洗3次。1. 3. 2. 1. 3 操作方法(1)将稀释管按KT1 10_6依次标记，在SYSUB3生物安全柜里用Iml的微量移液累计总数
变i 孔数τ 孔数1
病毒总接种无病变细稀释度孔数胞孔数
权利要求
1.一种EV71病毒样颗粒，其特征在于，所述EV71病毒样颗粒的制备方法包括(1)重组质粒的构建用EV71病毒的Pl蛋白基因和3⑶蛋白酶基因与pGAPZaA质粒分别连接后构建Pl-pGAPZ a A和3CD_pGAPZ a A重组质粒；(2)重组质粒转入表达菌株所述重组质粒依次转入毕赤酵母SMDl168表达菌株，得到 Pl-pGAPZ a A_3CD_pGAPZ a A-SMDl 168毕赤酵母重组表达菌株；(3)菌体培养及EV71病毒样颗粒纯化培养所述毕赤酵母重组表达菌株，离心分离上清液，所述上清液经超速离心后的沉淀用蔗糖密度梯度离心，获得EV71病毒样颗粒。
2.按照权利要求1所述的EV71病毒样颗粒，其特征在于所述Pl-pGAPZa A重组质粒是将Pl蛋白基因与PGAPZaA质粒均用RiilI内切酶和^icII内切酶分步双酶切后，用T4DNA 连接酶将Pl基因和PGAPZaA质粒双酶切产物连接得到。
3.按照权利要求1所述的EV71病毒样颗粒，其特征在于所述3⑶-pGAPZ a A重组质粒是将所述3CD蛋白酶基因和pGAPZaA质粒均用EcoRI和)(baI内切酶分步双酶切后，用 T4DNA连接酶将3⑶蛋白酶基因和pGAPZaA质粒双酶切产物连接得到。
4.按照权利要求1所述的EV71病毒样颗粒，其特征在于所述3CD蛋白酶基因和Pl蛋白基因是以EV71病毒RNA反转录的cDNA为模板，用PCR方法扩增获得。
5.按照权利要求1所述的EV71病毒样颗粒，其特征在于所述重组质粒转入表达菌株是用电穿孔仪先将所述3CD-pGAPZ α A质粒转入SMD1168酵母表达菌株，用低浓度博莱霉素zeocin筛选得到3⑶-pGAPZ α A-SMDl 168重组表达菌株，然后再将所述Pl-pGAPZ α A 质粒转入3⑶-pGAPZ α A-SMDl 168重组表达菌株，用高浓度博莱霉素zeocin筛选得到 Pl-pGAPZ α A_3CD_pGAPZ α A-SMDl 168 重组表达菌株。
6.按照权利要求1所述的EV71病毒样颗粒，其特征在于所述低浓度博莱霉素zeocin 是指100 μ g/ml浓度的博莱霉素，所述高浓度zeocin是指500 μ g/ml浓度的博莱霉素。
7.按照权利要求1所述的EV71病毒样颗粒，其特征在于，所述EV71病毒样颗粒纯化是将所述毕赤酵母重组表达菌株培养菌液5000转/分钟转速离心10分钟，取上清，超速离心28000转/分钟转速离心4小时，弃上清，沉淀用磷酸盐缓冲溶液PBS溶解，铺于不连续重量百分比蔗糖梯度15%、30%、45%和60%上，于观000转/分钟4°C离心1小时，收集 15% -30%层病毒带，用磷酸缓冲液稀释，28000转/分钟4°C离心2. 5小时，弃去上清液，即得纯化的EV71病毒样颗粒。
8.一种手足口病疫苗，其特征在于，所述疫苗的制备方法包括(1)重组质粒的构建用EV71病毒的Pl蛋白基因和3CD蛋白酶基因与pGAPZaA质粒分别连接后构建 Pl-pGAPZ α A和3⑶-pGAPZ α A重组质粒；(2)重组质粒转入表达菌株所述重组质粒转入毕赤酵母SMDl 168表达菌株，得到Pl-pGAPZ α A_3CD_pGAPZ α A-SMDl 168毕赤酵母重组表达菌株；C3)菌体培养及EV71病毒样颗粒纯化培养所述毕赤酵母重组表达菌株，离心分离上清液，所述上清液经超速离心后的沉淀用蔗糖密度梯度离心，获得EV71病毒样颗粒，(4)制备疫苗所述EV71病毒样颗粒用磷酸缓冲液溶解到40 μ g/ml，与等体积弗氏完全佐剂相混合制成疫苗。
全文摘要
本发明涉及一种EV71病毒样颗粒及以其制备的手足口病疫苗，所述EV71病毒样颗粒按照以下步骤制备(1)重组质粒的构建用肠道病毒EV71的P1蛋白基因和3CD蛋白酶基因与pGAPZαA质粒分别连接后构建P1-pGAPZαA和3CD-pGAPZαA重组质粒；(2)重组质粒转入表达菌株所述重组质粒依次转入毕赤酵母SMD1168表达菌株，得到P1-pGAPZαA-3CD-pGAPZαA-SMD1168重组表达菌株；(3)菌体培养及EV71病毒样颗粒纯化培养所述毕赤酵母重组表达菌株，离心分离上清液，所述上清液经超速离心后的沉淀用蔗糖密度梯度离心，获得EV71病毒样颗粒。本发明的EV71病毒样颗粒易于通过菌体培养获得，稳定性好、易于纯化，适于制备疫苗，且便于工业化生产。
文档编号A61K39/125GK102154229SQ201010585028
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月13日 优先权日2010年12月13日
发明者张定梅, 曹开源, 陆家海, 黎孟枫 申请人:张定梅, 曹开源, 陆家海, 黎孟枫