专利名称：用于nk细胞活化产生抗肿瘤作用的番茄红素和白藜芦醇组合物的制作方法
技术领域：
本发明披露了一种包括类胡萝卜素和萜类化合物的植物化学物质组合物。具体而言，所述类胡萝卜素为番茄红素，和所述萜类化合物为白藜芦醇，并且这两种化合物以适当的比例混合后，在哺乳动物体内代谢，发现在增强免疫力中协同作用，特别是通过NK细胞活化，引起机体的抗肿瘤机制。
背景技术：
在我们于2009年5月14日提出申请特此要求优先权的共同未决的专利申请号SG 200903301-0中，我们披露了一种包含一定比率或比例的番茄红素和白藜芦醇的新的组合物，所述一定比例的番茄红素和白藜芦醇在哺乳动物中癌性生长的抑制中显示协同作用。 但是由本发明的组合物引起的特定的抗肿瘤机制并不清楚。哺乳动物体的天然免疫反应由NK细胞提供，所述NK细胞是大颗粒淋巴细胞 (LGL)，负责免疫监视体内发生癌变的任何细胞或受病原体感染的细胞，或例如移植的组织这样的外来物。作为第一线天然防御，NK细胞不需要抗原依赖性活化。它的免疫监视功能是通过找出由病原体感染或癌变而发生变化的细胞，并通过细胞毒性或细胞溶解性方式杀死这些细胞，例如通过释放对靶细胞有细胞毒性的如穿孔素、粒酶的胞质蛋白颗粒，引起细胞通过细胞凋亡如细胞溶解来杀死这些细胞。由于NK细胞所拥有的强大的细胞溶解活性和潜在的自身活性，NK细胞活性必须受到严格的调控，其中其必须接受引发的生物化学信号来被活化。这个生物化学引发物包括双链RNA、细胞因子、Fc受体以及其他可应用配体的受体。因此肿瘤的危险与NK细胞群水平或活性成反比。我们已知的尝试通过生物化学信号活化NK细胞活性的现有技术如下。美国专利 US-4, 883, 662 (Stout)披露了应用生物物质来刺激遭受癌症患者的NK细胞群。所述生物物质是通过将一株免疫抑制性病毒引入到动物体内，从而刺激所述动物产生需要的生物物质而制备的，可以收获和分部分离或纯化所述生物物质，用于通过注射施用于癌症患者的血流中。美国专利US-5，7 , 378 (Hellstrand)描述了由细胞因子、α干扰素(IFN- α )和包含组胺和血清素(seretonin)的组合物构成的组合作为药物制剂在单核细胞存在下增强NK细胞的活性。该制剂通过局部或系统注射或灌注到遭受癌症或病毒感染的患者的血流中施用。所述制剂在升高NK细胞活性中协同作用，其中包含组胺和血清素的组合物的作用是抑制单核细胞活性，因此能通过α干扰素活化NK细胞。在后续的美国专利US-6，063，373(Hellstrand)中，使用由NK细胞活化剂和细胞内过氧化氢抑制剂组成的组合用于在单核细胞存在下增强NK细胞活性。所述NK细胞活化剂选自由白细胞介素-1 (IL-I)、白细胞介素-2 (IL-2)、白细胞介素-12 (IL-12)、白细胞介素-15(IL_15)、a干扰素(IFN-α )、β干扰素(IFN-β)、或γ干扰素(IFN-γ )组成的组中。所述活化剂也可以是类黄酮形式，所述类黄酮选自由黄酮-8乙酸(FAA)和咕吨酮-4乙酸(XAA)组成的组中。而细胞内氢抑制剂选自组胺、氢受体激动剂和血清素。可以增强NK细胞活性，无论是通过NK细胞增殖或提高NK细胞活性来有效治疗性治疗肿瘤或感染的基于植物的膳食补充剂相关的专利并不多见。在欧洲专利 EP-1,243, 274(Lu Kung-Ming)中描述了由特定细菌乳酸菌属(Lactobacillus)或可选择地由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酵母发酵的大豆水抽提物诱导细胞凋亡。在美国专利公开US2002/010149(Yagita)描述了香菇(Lentinus edodes)(也称为shiitake)的菌丝体可以诱导活化NK细胞的IL-12的产生。在PCT专利公开号 W02007/131767 (Goral-Czyk)中，番茄红素和染料木黄酮的组合用于治疗前列腺癌，其中一个实施方式可以可选择的包括白藜芦醇，但是没有提出对NK细胞活性的影响。
发明内容
现在从我们持续深入的研究显示，抗肿瘤机制得益于一些具有提高NK细胞免疫监视活性的植物化学物质的消耗和代谢。发现本发明的植物化学组合物显著升高哺乳动物中NK细胞的数量和其活性。在本说明书中，术语“升高NK细胞活性”指的是NK细胞增殖和细胞溶解能力升高的混合作用。具体而言，发现了与单独一种植物化学物质相比，两种具体植物化学物质组合的显著协同作用。广义而言，本发明的组合物包含治疗有效量的类胡萝卜素和萜类化合物，使得当摄入和代谢时，升高了包括自然杀伤(NK)细胞的大颗粒淋巴细胞(LGL)的活性。具体而言， 本发明的组合物包含用于升高NK细胞活性的治疗有效量的番茄红素和白藜芦醇。本发明的第一方面，根据权利要求2，组合物包含番茄红素和白藜芦醇，其中升高的NK细胞活性包括增加总淋巴细胞中的NK细胞部分。NK细胞活性升高包括提供引发NK 细胞进入细胞毒性或细胞溶解性反应的生物化学信号；可选择地，升高的NK细胞活性包括增加各NK细胞反应潜力，其中生物化学信号引发任选地包括双链RNA、细胞因子、Fc受体、 和其他可利用的配体受体的任意一种或者组合。可以延长升高的NK细胞的细胞毒性。本发明的第二方面，番茄红素白藜芦醇的优选摩尔比例范围为1 10到 10 1，更优选为1 1到3 1，最优选为3 1。可选择地，优选的重量比例可以表示为 1 4到25 1，更优选为272 1到772 1，最优选为772 1。所述组合物可以制成用于药用、膳食补充剂用或食品用产品，并以治疗有效量提供给哺乳动物，优选当番茄红素与白藜芦醇的重量比为272 1时，剂量为每20克哺乳动物体重大约3. 5mg，这个剂量相当于一个需要升高NK细胞活性的一般人每天大约400mg lOOOmg。本发明的第三方面，番茄红素和白藜芦醇组合物优选被制成经口服用。可选择地， 其可以被递送或用于相继服用提供。优选地，所述组合物的治疗有效性方面包括用于引发 NK细胞进入细胞毒性或细胞溶解性反应的其代谢产生剂、前体药物、代谢物或中间体化合物。
伴随本说明书的为附图，所述附图结合下面的详细描述，可以对本发明提供更好的理解。下面列出的附图用于提供本发明的示例性和非限制性实施方式，其中图1的条形图中显示了包括对照、仅番茄红素、仅白藜芦醇以及番茄红素和白藜芦醇组合的不同处理组的小鼠的NK细胞毒性。图2显示确定了达到最高NK细胞细胞毒性活性的番茄红素与白藜芦醇的最佳比例的条形图。图3表示用不同剂量的番茄红素白藜芦醇=2.5 1 (w/w)的组合物处理的小鼠的NK细胞毒性。图4显示了为图2中的剂量的三倍时NK细胞活性的结果。图5显示用2. 5mg/天/小鼠的番茄红素加Img白藜芦醇/天/小鼠处理的小鼠的NK毒性。图6显示根据本发明的一个实施方式的膳食补充剂处理前和处理后脑血管瘤的试验受试者的放射照片。图7显示根据本发明的一个实施方式的膳食补充剂处理前和处理后另一个胸腺癌的试验受试者的放射照片。图8显示根据本发明的一个实施方式的膳食补充剂处理前和处理后又另一个脑中非小肺癌转移瘤试验受试者的放射照片。
具体实施例方式我们广泛定义了本发明的组合物，所述组合物包含治疗有效量的类胡萝卜素和萜类化合物，使得在摄入和代谢时，升高包括自然杀伤(NK)细胞在内的大颗粒淋巴细胞 (LGL)的活性。作为所述组合物的具体实施方式
，所述类胡萝卜素为番茄红素，萜类化合物为白藜芦醇。番茄红素番茄红素是可以被人体吸收并积蓄的六种类胡萝卜素中的一种[Ref.l: Mein (2008) ]0它主要分布在睾丸、前列腺、肝和小肠中。番茄红素是地球上最强的抗氧化齐U，显示比β -胡萝卜素和维生素E的抗氧化活性分别高3. 2倍和100倍。此前的研究已经证明番茄红素有许多促进健康的功能，包括抗衰老、增强免疫性、 减少心血管疾病的危险和恶性肿瘤，特别是口腔癌、喉癌、胃癌、结肠癌和子宫癌的发生率等。临床试验表明，番茄红素对抑制肿瘤生长和转移很有效，特别是胰腺癌、肺癌和胃肠道癌[Ref. 2 =Giovannucci (1999) ；Ref. 3 =Gann (1999) ] 由于其多种有益作用，番茄红素被誉为是21世纪的健康食品补充剂之星，而且在全世界得到广泛的认同。在发达国家，包括美国、西欧国家、日本和以色列，大量的人力物力投入并继续花费到包含番茄红素的药品、食品补充剂、食品和化妆品的相关研究和开发中。在人体小肠中，番茄红素与脂肪和胆酸形成微囊。这些微囊可以在小肠粘膜细胞观察到。天然的番茄红素呈全反式结构。胃酸可以将全反式番茄红素转化成各类顺式异构体，所述顺式异构体被认为显示较高的生物利用度。在人体中已经发现总共15 18种异构体，可能对应于番茄红素的广泛多种生理功能。然而，仅番茄红素的抗氧化活性，并不能解释其抗肿瘤和预防心血管疾病的功效。最近，假定类番茄红素(lycopenoid)可以与维生素A类似的方式调节基因表达。已知的类番茄红素包括5，6-二羟基-5’，6’ - 二氢番茄红素、2，6_环番茄红素-1，5-二醇A & B、阿朴-10’ -类番茄红酸(apo-10，-Iycopenoic acid)、无环视黄酸、阿朴-8’ -番茄红素(apo-8' -lycopenal)、阿朴-10’ -番茄红素(apo-10，-lycopenal)、阿朴-12，-番茄红素(apo-12，-lycopenal)和阿朴-14，-番茄红素(apo-14' lycopenal)[Ref. 4 =Ruhl(2004) ；Ref. 5 =Lindshield, (2007) ；Ref. 1 Mein (2008)]ο对于体外和体内实验，观察到在比人体内更高浓度的番茄红素的作用，表明可能存在辅因子。2008年，首次报道描述了番茄红素的最佳抗肿瘤效果需要有辅因子[Ref. 6: Mossine (2008) ；Ref. 7 =Venkateswaran(2009)]。白藜芦醇白藜芦醇是一种萜类化合物，在葡萄皮、花生、菠萝和草血竭中含量丰富。白藜芦醇是一种抗氧化剂，能降低血液粘稠度、抑制血小板凝结、促进血管舒张以及因此促进血液循环。白藜芦醇具有降低血脂的特性[Ref. 8 =Arichi (1982)]，因此在防止动脉粥样硬化和缺血性心脏病中发挥重要作用。白藜芦醇也已知有抗肿瘤作用，并且是雌激素的天然替代物。白藜芦醇的功能还包括抗衰老作用、防止低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的氧化、抗炎和抗过敏作用。白藜芦醇的其它用途包括治疗急性传染性肝炎、绝经、风湿、骨和肌肉痛、支气管炎、胆囊结石、高胆固醇和甘油三酯过高状况。已知白藜芦醇还调节免疫系统[Ref.9 =Kimura (1985) ；Ref. 10 =Gao (2001) ] 它抑制促炎介质的合成与释放，抑制如环氧化酶I型或环氧化酶II型的酶、抑制淋巴细胞增殖、促进细胞毒性T细胞的活化和刺激细胞因子的分泌。最重要的是，白藜芦醇可以抑制如活化B细胞的因子K轻链增强剂(NF-KB)的转录因子的活性，因此可通过调节人免疫性具有抗肿瘤作用[ReI. 11 =Tsai (1999) ；Ref. 12 =Falchetti (2001) ；Ref. 13 Heynekamp (2006)]。即便摄入了大量的白藜芦醇，白藜芦醇的完整形式在人体中仅以痕量存在 [Ref. 14 =Andlauer (2000) ；Ref. 15 =De Santi (2000)]并且远远低于在体外可杀死肿瘤细胞的量。然而，白藜芦醇的抗肿瘤作用在许多体内实验明显[Ref. 16 =Vitrac XQ003)]。这些发现表明白藜芦醇的抗肿瘤作用是通过其一些代谢产物在人体或小鼠上实现。我们进行了许多的实验，以下描述了实验的步骤和结果。实验步骤NK细胞的分离NK细胞从Balb/c小鼠的脾脏分离。每组小鼠在喂食番茄红素 /白藜芦醇后的第七天杀死，摘取脾脏，在75%酒精中浸泡5分钟，在细胞筛上轻轻碾碎， 用RPMI-1640培养基冲洗细胞筛后收集单个细胞。将所述混合物放置在淋巴细胞分离液上2000rpm离心25分钟，分离得到的总脾细胞。仔细收集白色的淋巴细胞层，用无血清的 RPMI-1640培养基洗涤二次，计数后转移到6孔培养板中备用。这样制备的淋巴细胞含10 20%的NK细胞，可用于NK细胞测定[Ref. 18 =Zhang(2006) ] B16黑素瘤细胞的分离在C57荷瘤小鼠分离B16黑素瘤，在Hank’ s培养基中浸泡30分钟。除去肿瘤的脂肪和坏死部分后，将肿瘤切成小块，以含0.1% II型胶原蛋白的RPMI-1640在4°C处理12小时。消化后的肿瘤组织在100目的细胞筛上轻轻滤过，并用 100%的Ficoll通过离心分离肿瘤细胞。NK细胞的细胞毒性活性测定从小鼠脾脏分离到的NK细胞与B16黑素瘤细胞以 25 1,50 1和100 1的比例进行混合，在37°C放置。5小时后，取100 μ 1培养基进行乳酸脱氢酶(LDH)活性的测定作为NK细胞的细胞毒性活性。细胞毒性由以下公式进行计
权利要求
1.一种组合物，包含治疗有效量的至少一种类胡萝卜素和至少一种萜类化合物，用于代谢性地升高包括自然杀伤(NK)细胞的大颗粒淋巴细胞(LGL)的活性。
2.如权利要求1所述的组合物，包含治疗有效量的番茄红素和白藜芦醇，用于升高包括自然杀伤(NK)细胞的大颗粒淋巴细胞(LGL)的活性。
3.如权利要求2所述的包含番茄红素和白藜芦醇的组合物，其中，升高的NK细胞活性包括总淋巴细胞中NK细胞比例的增加。
4.如权利要求2所述的包含番茄红素和白藜芦醇的组合物，其中，升高的NK细胞活性包括提供生物化学信号引发NK细胞进入细胞毒性或细胞裂解反应状态。
5.如权利要求2所述的包含番茄红素和白藜芦醇的组合物，其中，升高的NK细胞活性包括单个NK细胞反应强度的增加。
6.如权利要求4所述的包含番茄红素和白藜芦醇的组合物，其中，生物化学信号引发包括双链RNA、细胞因子、Fc受体和其他可适用的配体受体的任一种或其组合。
7.如权利要求2所述的包含番茄红素和白藜芦醇的组合物，其中，升高的NK细胞活性包括延长的细胞毒性。
8.如权利要求2所述的包含番茄红素和白藜芦醇的组合物，其中，番茄红素白藜芦醇的比例优选为摩尔比范围在1 10到10 1。
9.如权利要求8所述的包含番茄红素和白藜芦醇的组合物，其中，所述比例更优选摩尔比为1 1到1 3，最优选摩尔比为3 1。
10.如权利要求2所述的包含番茄红素和白藜芦醇的组合物，其中，番茄红素白藜芦醇的比例为重量比范围在1 4到25 1。
11.如权利要求10所述的包含番茄红素和白藜芦醇的组合物，其中，所述比例重量比更优选为272 1到772 1，和最优选为772 1。
12.如权利要求2所述的包含番茄红素和白藜芦醇的组合物，被制备成药用、膳食补充剂用或食品用产品。
13.如权利要求12所述的包含番茄红素和白藜芦醇的组合物，以治疗有效量提供给哺乳动物。
14.如权利要求13所述的包含番茄红素和白藜芦醇的组合物，以每天每20克哺乳动物体重大约3. 5mg的剂量提供。
15.如权利要求12所述的包含番茄红素和白藜芦醇的组合物，对于需要升高NK细胞活性的一般人，以每天大约400mg到IOOOmg的剂量提供。
16.如权利要求12所述的包含番茄红素和白藜芦醇的组合物，被制备成经口服用。
17.如权利要求12所述的包含番茄红素和白藜芦醇的组合物，与每种所述番茄红素和白藜芦醇制成制剂被递送或用于相继服用提供。
18.如权利要求2所述的包含番茄红素和白藜芦醇的组合物的用途，代谢性地产生试齐U，药物前体、代谢产物或中间体化合物，用于引发NK细胞进入细胞毒性或细胞裂解反应状态。
19.如权利要求18所述的包含番茄红素和白藜芦醇的组合物的用途，其中，所述番茄红素和白藜芦醇以下述方式中的任何一种方式摄取-同一种制剂包括两种化合物；-各所述番茄红素和白藜芦醇的制剂，所述制剂同时服用；或者 -各所述番茄红素和白藜芦醇的制剂，所述制剂以相同次序或相反次序相继服用。
20.如权利要求18所述的试剂、药物前体、代谢产物或中间体化合物，能引发NK细胞进入细胞毒性或细胞裂解反应状态。
全文摘要
本发明披露了治疗有效量的类胡萝卜素和萜类化合物，以一种制剂，或两种分开的制剂同时摄入或相继摄入体内，经过代谢后，自然杀伤(NK)细胞活性升高。具体而言，组合物包含以摩尔比范围为1∶10到10∶1；更有选摩尔比为1∶1到3∶1，最优选为3∶1的番茄红素和白藜芦醇。可选择地，优选的比例可以表示为重量比为1∶4到25∶1；更优选重量比为21/2∶1到71/2＞∶1，以及最优选为71/2∶1。所述组合物可制备成经口服用的药用型、膳食补充剂型或食品型产品，并以治疗有效量提供给哺乳动物，优选剂量为以重量比为21/2∶1每天每20g哺乳动物体重大约3.5mg，所述剂量可以转换成对于需要升高NK细胞活性的一般成人每天大约400mg到1000mg。优选地，所述组合物的治疗有效性方面包括用于引发NK细胞的细胞毒性或细胞裂解反应的其代谢产生剂、药物前体、代谢产物或中间体化合物。
文档编号A61P35/00GK102481267SQ201080031650
公开日2012年5月30日 申请日期2010年4月13日 优先权日2009年5月14日
发明者谢坤龙 申请人:谢氏生技(新加坡)有限公司