敲除MLDS基因的产油红球菌Rhodococcussp.RHA-MLDS及其用途的制作方法

专利名称：：敲除MLDS基因的产油红球菌Rhodococcussp.RHA-MLDS及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及敲除MLDS基因的产油红球菌Rhodococcussp.RHA-MLDS及其用途，并涉及MLDS基因和/或MLDS蛋白的抑制剂在生产生物柴油中的应用，MLDS基因和/或MLDS蛋白和包含重组MLDS基因蛋白质表达产物、MLDS基因或包含MLDS基因的重组表达载体的組合物在制备预防和/或治疗与脂质的代谢和储存障碍有关的代谢性疾病的药物中的用途。
背景技术：
：能源的短缺及环境的污染已经严重地限制了世界经济的发展和生活水平的提高。因此，开发新型能源，尤其是开发可持续和可再生的清洁生物能源就变得势在必行。从2009年我国在緑色清洁能源上的投入(三百四十六亿美金)高于全世界的总投入的四分之一及美国的两倍就能看出我国对绿色清洁能源的需求及重视。微生物能量转化效率远高于其它生物物种，美国能源部的研究报告指出，単位面积土地上微藻的产油量是地面植物的100倍[1]。因此利用微生物生产生物能源已经成为人类开发可持续可再生能源的ー个重要方向。其中，利用微生物生产生物柴油又是重中之重[2]。在細菌中，生物柴油的前体甘油三酯是储存在一个叫脂滴的細胞器中。因此，阐明调节脂滴形成及动态变化的相关分子机理将大大有助于提高生物柴油的产量及降低生产成本。同吋，人体的多种代谢疾病均与脂质的代谢和储存有着密切的[3]。到目前为止，脂滴的形成机理依然还处于假说之中，其分子机理仍待研究。很显然，脂滴结合蛋白的确定会为掲示脂滴形成机理提供有力的线索和依据。虽然真核細胞中脂滴结合蛋白已经大部分被鉴定出来了W-7]，但细菌的脂滴结合蛋白仍然是空白。同吋，对动物細胞脂滴有着很大作用的PAT家族蛋白在細菌中却没有同源蛋白。因此，我们选定产油红球菌miodococcussp.RHAl[8]为研究材料分析研究細菌脂滴的有关蛋白，尤其是调节脂滴形成及大小变化的蛋白。Rodococcussp.RHAl起初是从农药污染的土壌中分离出的ー种菌株，它可以利用多种有机化合物作为碳源，如碳水化合物、类固醇、芳香族化合物、腈类化合物等等。近期的研究主要集中于它的生物降解功能，包括腈、丁子香酚、固醇酮、苯甲酸酯等[9-11]。这种細菌有很强的在体内积累甘油三酯的能力，这是ー种潜在的可再生资源，可以产生脂肪酸甲酷。因此我们选取这种菌为研究材料不仅有助于生物柴油的开发，而且还会为治疗人类代谢疾病提供理论基础。
发明内容因此，本发明的技术目的在于探究細菌脂滴的有关蛋白并探究该有关蛋白在生产生物柴油及治疗人类代谢疾病中的应用。因此，本发明的第一方面涉及敲除MLDS基因的产油红球菌Iihodococcussp.RHA-MLDS，其于2010年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，其地址为中华人民共和国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其分类命名为红球菌Iihodococcussp.，保藏号为CGMCCNo.4379，其中所述MLDS基因的NCBI登录号为4218150。本发明的第二方面涉及敲除MLDS基因的产油红球菌Iihodococcussp.RHA-MLDS在生产生物柴油中的应用。本发明的第三方面涉及利用敲除MLDS基因的产油红球菌Iihodococcussp.RHA-MLDS生产生物柴油的方法。本发明的第四方面涉及MLDS基因和/或MLDS蛋白的抑制剂在生产生物柴油中的应用，其中所述MLDS基因的NCBI登录号为4218150。优选地，所述抑制剂为siRNA和/或特异性抗MLDS蛋白的抗体，所述siRNA和/或特异性抗MLDS蛋白的抗体能沉默和/或降低MLDS基因的表达及中和MLDS蛋白。本发明的第五方面涉及MLDS基因和/或MLDS蛋白在制备预防和/或治疗与脂质的代谢和储存障碍有关的代谢性疾病的药物中的用途，其中所述MLDS基因的NCBI登录号为4218150。优选地，所述疾病选自肥胖症、脂肪肝或动脉粥样硬化。优选地，所述药物选自重组MLDS基因蛋白质表达产物、MLDS基因、包含MLDS基因的重组表达载体或包含MLDS基因的重组表达载体的宿主細胞，优选地，所述重组MLDS基因蛋白质表达产物由原核表达系统或真核表达系统表达，优选地，所述重组表达载体为适用于基因治疗的重组表达载体。本发明的第六方面涉及包含重组MLDS基因蛋白质表达产物、MLDS基因或包含MLDS基因的重组表达载体的組合物在制备预防和/或治疗与脂质的代谢和储存障碍有关的代谢性疾病的药物中的用途，其中所述MLDS基因的NCBI登录号为4218150。优选地，所述疾病选自肥胖症、脂肪肝或动脉粥样硬化。換言之，由于细胞储存甘油三酯的細胞器-脂滴的形成和动态变化不但直接与人类代谢疾病有关，而且还直接决定了生物体合成生物柴油的能力。因此，掲示调控脂滴形成和动态变化的分子机理及相关基因对预防治疗代谢疾病以及开发生物柴油有重大意义。本发明通过对产油红球菌Miod0c0ccussp.RHAl的基因组和蛋白组分析研究从而选定相关基因，利用基因敲除的手段对这些选定的基因进行敲除，然后用光学和电子显微镜对这些菌株进行分析观测，最后用其它生物化学和分子生物学方法对相关菌株进行分析研究，重点在于测定甘油三酯含量。本发明发现敲除基因ro2104(NCBI登录号4218150)可以明显増加产油红球菌脂滴的大小，同时显著提高細菌甘油三酯含量。另外，通过借助表达载体JAM-egfp使绿色荧光蛋白与ro2104形成融合蛋白，使其在产油红球菌中表达，还由此观测到该蛋白在細菌中的定位。本发明发现ro2104蛋白完全定位在脂滴上。因此，ro2104有可能是ー个存在于脂滴上，保护小脂滴不被融合成大脂滴的蛋白。由此，本发明命名它为"MicroorganismLipidDropletSmall”，简称"MLDS”。由于MLDS阻止小脂滴融合为大脂滴，因此，敲除了MLDS基因的产油红球菌Iihodococcussp.RHA-MLDS中的脂滴明显变大，甘油三酯含量明显提高。该菌已经于2010年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)，其地址为中华人民共和国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNo.4379，其分类命名为红球菌(拉丁文名称为Rhodococcussp.)。由于该菌能使菌体内的脂滴明显变大，甘油三酯含量明显提高，因此其可以用于生产生物柴油。由于MLDS阻止小脂滴融合为大脂滴，因此，MLDS对于生物柴油的生产是ー种负面因素，因此，MLDS基因和/或MLDS蛋白的抑制剂可以促进相关生物(如产油红球菌)細胞内的脂滴变大并显著提高甘油三酯的含量，也即MLDS基因和/或MLDS蛋白的抑制剂可以用于生产生物柴油。MLDS基因的抑制剂可以是能特异性敲除或敲降MLDS基因表达的小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)，也可以是能降低MLDS基因表达的其他化学物质。本领域技术人员公知如何设计特异性敲除或敲降某种基因表达的siRNA的方法以及筛选能降低MLDS基因表达的其他化学物质的方法。同吋，由于抗原抗体的特异性结合能中和掉抗原的生物活性，因此，特异性结合MLDS蛋白的抗体也可以用于生产生物柴油。由于MLDS能保护小脂滴不被融合成大脂滴，因此，MLDS基因和/或MLDS蛋白以及包含MLDS基因和/或MLDS蛋白的組合物能用于预防和/或治疗与脂质的代谢和储存障碍有关的代谢性疾病，这样的疾病可以是肥胖症、脂肪肝或动脉粥样硬化。可以MLDS蛋白、MLDS基因或包含MLDS基因的重组表达载体的形式应用MLDS。敲除了MLDS基因的产油红球菌Rhodococcussp.RHA-MLDS已经于2010年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)，其地址为中华人民共和国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNo.4379，其分类命名为红球菌Miodococcussp.。产油红球菌Rhodococcussp.RHAl于2010年12月8日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)，其地址为中华人民共和国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其分类命名为红球菌Iihodococcussp.，保藏号为CGMCCNo.4423ο含有pJAM2_eGFP表达质粒的大肠杆菌pJAM2-egfp/S17_l于2010年12月8日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)，其地址为中华人民共和国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichiacoli，保藏号为CGMCCNo.4422。图1:MLDS基因敲除的突变策略及PCR各引物的位置。图2:MLDS基因敲除构建物电泳图，其中敲除菌株的PCR扩增片段(泳道2)大约640bp，与构建的基因敲除质粒相同(泳道1)。而用同样的引物PCR扩增野生型片段大约1470bp(泳道3)。为了进一歩确认缺失的准确性，我们也用PCR检测了目的基因及其两边的序列。结果表明目的基因两侧的序列071bp和372bp)均与野生型菌株一致(泳道4-7)，而目的基因(831bp)只存在于野生型菌株中，缺失菌株中PCR检测不到(泳道8-9)，表明缺失菌株已经构建成功。1，阳性对照，以基因敲除质粒作为模板，以I^rimera.Primerd作为引物。2，用ro02104缺失型细菌基因组作为模板，Primera.Primerd作为PCR引物。3，阴性对照，用野生型菌株基因组作为模板，Primera.Primerd作为PCR引物。4_5，以野生型和基因敲除菌株作模板，Primera.Primerb作为引物的PCR结果。6-7，以野生型和基因敲除菌株作模板，Primerc,Primerd作为引物的PCR結果。8-9，以野生型和基因敲除菌株作模板，Primerf>Primerr作为引物的PCR结果。图3电镜照片，其中负染电镜(a和C)和透射超薄切片电镜(b和d)分别观察了野生型菌和MLDS基因敲除菌中脂滴的大小，发现在基因敲除菌中脂滴远大于野生型的脂滴。图4=TLC实验結果，其中TLC显示在MLDS基因删除菌的甘油三脂含量增多。图5=Westernblot检测MLDS融合蛋白的定位。图6用表达有MLDS-GFP融合蛋白的細菌定位MLDS的荧光显微镜照片，其中，a，明场下转有空载体JAM-egfp的細菌；b，荧光场下转有空载体JAM-egfp的細菌；c，明场下转有目标基因JAM-MLDS-egfp的細菌；d，荧光场下转有目标基因JAM-MLDS-egfp的細菌(图中标尺为5μm)。具体实施例方式下面将通过下述非限制性实施例进ー步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。实施例实施例1实验材料与设备1.菌株与质粒产油红球菌Rhodococcussp.RHAl由加拿大英属哥伦比亚大学(UniversityofBritishColumbia)LindsayD.Eltis教授惠赠(于2010年12月8日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)，其地址为中华人民共和国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为红球菌miodococcussp.，保藏号为CGMCCNo.4423；大肠杆菌S17-1(ATCC4705。和pK18mobsacB(ATCC87097)整合质粒均购自美国ATCC;pJAM2-eGFP表达质粒为德国明斯特大学(UniversityofMunster)的DanielBr0ker教授惠赠，含有pJAM2-eGFP表达质粒的大肠杆菌pJAM2-egfp/S17-l于2010年12月8日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)，其地址为中华人民共和国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichiacoli，保藏号为CGMCCNo.4422；大肠杆菌DH5α购自TIANGEN公司。2.限制性内切酶和其他修饰酶限制性内切酶和PCR用ExTaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司；克隆用T载体购自Genstar公ロ]。3.其他主要试剂硫酸卡那霉素(Kanamycin)和萘啶酸(NalidixicAcid)购自Sigma公司；酵母粉(YeastExtrant)禾ロ姨蛋白月东(Tryptone)购自Oxide公司；预染蛋白Marker为Fermentas公司产品；质粒小量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自Tiangen公司；其它试剂均为分析纯试剂。4.主要仪器设备电子显微镜(FEITecnaiG2F20)为美国FEI公司产品；荧光显微镜的型号为Zeiss-AXIO-Imager；电转化仪为BIO-RADMicopulserl65_2100型；电热恒温培养箱(DPX-9002B-1)为上海福玛实验设备有限公司产品；双层小容量全温度恒温摇床(ZHWY-2102C)为上海智城分析仪器制造有限公司产品；洁净工作台(SW-CJ-IFD)为苏州安泰空气技术有限公司产品；电转化仪为美国BIO-RAD公司产品；超纯水制备器为美国PALL公司产品；PCR热循环仪(东胜龙EDC-810)为北京东胜创新生物科技有限公司产品；紫外分光光度计(D-2233IHamburg)为Eppendorf公司产品；离心机(microfuge16、centrifuge5417R和3K30)分别为Sigma、Eppendorf和Beckman公司产品；凝胶成像系统(AlphalmagerEP)为美国Alphahnotech公司产品；紫外透射反射分析仪(ZF-4)为上海长明光学电子仪器厂产品；电热恒温水槽(DK-8D)为上海一恒科技有限公司产品；高压蒸汽灭菌锅aXQ-LS-50SII)为上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；电泳仪和电泳槽为北京六ー厂公司产品；微波炉为LG和格兰仕公司产品；实验用各种冰箱为海尔公司产品；微型台式真空泵(CL-802B)为海门市其林贝尔仪器制造有限公司产品；0.22μπι滤器为德国Sartorius公ロJ广品。实验方法1用于缺失ro02104(MLDS)基因的载体的构建1.Iro02104(MLDS)基因引物的设计从NCBI数据库中查找出目标基因RHAlMLDS及其两侧的序列(分别为ro02103，NCBI登录号为4218149，和ro02105,NCBI登录号为4218151)，用PCR的方法扩增其上游27Ibp段和下游372bp的序列，引物通过primer5.O软件设计。其中，271bp序列由!3rimera(SEQIDNO:1)禾ロPrimerb(SEQIDNO:2)扩增，Primera的5'端为EcoRI酶切位点。372bp序列用Primerc(SEQIDNO:3)和Primerd(SEQIDNO:4)引物扩增，Primerd的5'端为HindIII酶切位点。I^rimerb和Primerc引物之间有19bp的粘性互补区，用于PCR扩增时将AB段和⑶段连接到一起。检测用的引物为I^rimerf(SEQIDNO5)和Primerr(SEQIDNO:6)，用于扩增目标基因ro02104。PrimeraPrimerbPrimercPrimerdPrimerfPrimerr5'-CGGAATTCGGGAACAGCAGGAGGACGAGGAAT-3'5'-CCATCCACTAAACTTAAACAGGCTTGATCCTTCACGCTTTTCG-3，5'-GTTTAAGTTTAGTGGATGGTCTTGACGCTGTCGATGGTCTTCT-3，5'-CACAAGCTTTCTGAGTCAGATCGAGCGTGGGTT-3'5'-ATGACTGACCAGAAGACCATCGACAG-3'5'-TCAAGCCTTCTTGGCCGGAGCAGC-3'1.2MLDS基因的扩增用primera和primerb扩增AB段，用primerc和primerd扩增CD段，模板为野生型RHAl的基因組。PCR体系为摸板引物1引物22.5mMdNTPIOxbufferTaq酶ddH20共计1μνζμνζμν5μν5μν0.5μL34.5μL50μLPCR条件为预变性94°C,Dmm变性94°C,30sec退火12°C,55sec延伸12°C,1mm循环数35后延伸12°C,2mm将AB段和⑶段分别回收以回收后的AB段和CD段为模板，以primera和primerd为引物扩增AD段，PCR条件同AB段和⑶段。1.3PCR产物的琼脂糖凝胶电泳将扩增产物和连接产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖浓度为0.8%，用Goldview核酸染料(购自赛百盛，目录号HGV-1)；进行着色，用凝胶图像分析仪对染色后的凝胶进行分析并拍照记录。1.4PCR产物的回收将AD段进行凝胶回收，操作步骤按凝胶回收试剂盒(购自TIANGEN公司)中的说明书进行，回收出来的AD段就是体外缺失掉目标基因MLDS的DNA序列。2质粒整合载体的构建2.IMLDS基因与T载体的连接将回收后的AD段序列作为外源片段与T载体连接，连接体系为外源片段4μL，T载体lyL，2X预混缓冲液5μし连接条件为16°C，过夜。2.2CaCl2法制备DH5α感受态细胞从LB平板上挑取新活化的DH5α单菌落，接种于5mLLB液体培养基中，37°C下振荡培养12hr左右。然后将该菌液以1100的比例接种于IOOmLLB液体培养基中，37°C，220rpm振荡培养至OD6tltl为0.6。置于冰上20min。在4°C，5000rpm离心5min，弃上清液，用吸头吸尽残余培养基。加入适量的MgCl2-CaCl2溶液清洗两次。加入适量冰预冷的0.Imol/LCaCl2重悬。此时的感受态细胞既可以进行转化，也可以加入甘油之后保存于-80°C。2.3T载体连接产物的转化将连接产物加入50μLDH5a感受态细胞中，温和混勻，冰上放置20hr，热击(42°C，90sec)。在冰上放置2_;3min，加入0.8mLLB培养基，37°C孵育45min，离心后用200μ1LB培养基重悬，取100μL涂氨苄青霉素家IPTG和Χ-gal平板，37°C过夜培养。2.4转化菌落质粒的提取将生长出来的菌落提取质粒验证，提取质粒使用天根质粒小量快速提取试剂盒。将提取的质粒送北京擎科生物技术有限公司测序。测序结果表明所获得的重组基因序列完全正确。2.5含MLDS基因的H(18质粒整合载体的构建1)将测序正确的阳性克隆和载体pK18mobSaCB进行EcoRI和HindIII双酶切，酶切体系如下表，酶切温度为37°C，酶切时间为4hr。质粒DNA15μLIOXbufferM5μνEcoRI1μνHindIII1μνddH2028μL共计50μL2)将酶切产物跑电泳后按凝胶回收试剂盒的说明进行凝胶回收。3)将回收后的小片段作为外源片段和载体pKlSmobsacB进行连接。连接体系为外源片段4μL，T载体1μL，2X预混缓冲液5μし连接条件为16°C，过夜。4)将连接产物转化经CaCl2法制备好的感受态细胞S17-1，转化方法如2.3。幻涂卡那霉素平板，37°C过夜培养。长出来的菌落即是含有重组质粒的阳性菌落。3RHA1菌株基因组上MLDS基因的敲除3.1S17-1和RHAl细菌的培养挑取大肠杆菌S17-1的单菌落至IOmL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基，于37°C培养。挑取野生型RHAl的单菌落至IOmL含有30μg/mL萘啶酸的LB培养基，于30°Ciロ养。3.2S17-1菌株和RHAl菌株的结合作用分别培养供体菌S17-1和受体菌野生型RHAl至細菌生长指数末期。各取100μL涂无抗性的固体LB平板，30°C培养过夜。这时质粒就会从供体菌转进受体菌RHAl中。3.3整合筛选MLDS突变株向过夜培养的平板中加入2mL液体LB培养基，用涂布棒将菌体刮下，梯度稀释成川入川人川づ，涂嫩+！^！！板(萘啶酸+卡那霉素平板)，30°C培养2-3day。长出来的为第一次整合的細菌。将长出来的菌落进行第一次整合的鉴定挑一个单菌落分别扎到NA+Kan平板和NA+Kan+10%蔗糖平板，挑选在NA+Kan平板生长而在NA+Kan+10%蔗糖平板上不能生长的菌落。这样的菌落为第一次整合成功的細菌。将第一次整合成功的菌落在10%蔗糖平板上划线，30°C培养2-3day。长出来的为第二次整合的細菌。将长出来的菌落进行第二次整合的鉴定挑一个单菌落分别扎到NA+Kan平板和NA平板，挑选在NA平板生长而在NA+Kan平板上不能生长的菌落。这样的菌落为第二次整合成功的細菌。4MLDS突变株的分子生物学水平验证4.1基因组的提取提取方法按照TIANGEN公司細菌基因组DNA提取试剂盒进行4.2PCR鉴定缺失突变株以提取的基因组做模板做PCR验证，阳性对照为以体外构建的重组质粒为模板，阴性对照为以野生型RHAl基因组为模板。同时以primerf和primerr扩增MLDS基因，再次确认目标基因的缺失与否。5电子显微镜观察菌体形态5.1电子显微镜样品切片的制备菌体收集3800g离心anin收集2mL菌体，分别用ImL0.IMPBS洗涤菌体2次；包埋加入5%gelatin(明胶)(w/v)，室温放置lhr，4°C放置30min，然后将包埋块切成Imm3左右的小块；前固定将上述小块用2.5%(w/v)戊ニ醛(pH7.4,0.IMPBS)，4°C固定过夜；洗涤用ImL0.IMPBS在4°C洗涤去除戊ニ醛，洗涤3次，每次IOmin；后固定用200μ11%(w/v)锇酸4°C固定样品Mhr；洗涤用ImL0.IMPBS在4°C洗涤去除锇酸，洗涤3次，每次IOmin；梯度乙醇脱水室温下分別用ImL30%、50%、70%、90%和95%乙醇脱水lOmin，最后用100%乙醇脱水3次，毎次IOmin；替代室温下加入ImL环氧丙烷替代乙醇，替代3次，每次IOmin；渗透室温下以环氧丙烷Quetol812分别以31、11、13的比例渗透8hr、10hr、12hr，最后以纯Quetol812树脂渗透12hr；包埋及聚合以加入加速剂的Quetol812全树脂包埋样品，并分别在35°C下聚合12hr，45°C下聚合12hr，60°C下聚合Mir；切片用超薄切片机LeicaEMUC6(Leica公司)将包埋好的样品切成90nm的超薄切片；染色将超薄切片用2%(w/v)醋酸双氧铀在室温染色20min，水洗3次，然后用2%柠檬酸铅室温下染色5min，水洗3次，此超薄切片用电镜FEITeCnai20(FEIcompany)观察。6ro02104基因的过表达6.1表达质粒的构建6.1.1目标基因的扩增从NCBI数据库中查找出目标基因RHA1MLDS的序列，用PCR的方法扩增其序列，弓丨物通过primer5.0软件设计。基因的5'端和3'端都加入BamHI酶切位点。所用引物分别为PrimerF(SEQIDNO7)禾ロPrimerR(SEQIDNO8)PrimerF5'-CAGGATCCACTGACCAGAAGACCATCGACAGCGT-3‘PrimerR5'~CAGGATCCAGCCTTCTTGGCCGGAGCAGCCTT~3‘PCR体系为模板1APrimerF2fiLPrimerR2fiL2.5mMdNTP5^iLlOxbuffer5fiLTaq酶0.5fiLddH2034.5^iL共计50^iLPCR条件为预变性94°C，5min变性94°C，30sec退火72°C，55sec延伸72°C，2min循环数35后延伸72°C，2min6.1.2将PCR产物进行凝胶电泳及回收，请分别参考1.3和1.4部分。将目的基因进行T载体的连接和转化，请分别参考2.1和2.3部分。转化子质粒的提取，请参考2.4部分。6.1.3含ro02104基因的JAM-egfp质粒整合载体的构建1)将测序正确的阳性克隆和载体pJAM-egfp进行BamHI酶切，酶切体系如下表，酶切温度为30°C，酶切时间为4hr。质粒DNA15pLlOxbufferM5fiLBamHI2fiLddH2028^iL共计50pL2)将酶切产物跑电泳后凝胶回收，按试剂盒说明进行凝胶回收。3)将回收后的小片段作为外源片段和载体pJAM-egf进行连接。连接体系为夕卜源片段4iiL，载体liiL，2X预混缓冲液5iiL。连接条件为16°C，过夜。4)将连接产物转化DH5a感受态细胞，方法同2.3，37°C培养过夜。5)将转化子提取质粒并酶切鉴定是否有外源片段的插入，方法同2.4。6.2用于电转化的感受态细胞的制备从LB平板上挑取新活化的RHAl单菌落，接种于IOmLLB液体培养基中，30°C下振荡培养48hr左右。然后将该菌液以I:100的比例接种于IOOmLLB液体培养基中，30°C，220rpm振荡培养至OD6tltl为0.6。各取45mL菌液加入2个无菌的50mL离心管中。立即置于冰上20min，使培养物冷却至0°C，以使菌停止生长。将离心管在4°C，6000rpm离心lOmin，弃上清液，用吸头吸尽残余培养基。每个离心管里加入25mL冰冷的无菌水重悬。置于冰上若干分钟。4°C，6000rpm离心lOmin，回收细胞。再次用25mL冰冷的无菌水重悬，同样条件离心后弃上清液，用吸头吸尽残余培养基。每个离心管里加入2mL冰冷的10%的甘油重悬，分装到I.5mL离心管中。保存于_80°C。6.3质粒的转化和表达取2iiL阳性克隆质粒加入到50iiL感受态细胞中，温和混匀后转移到0.Icm的电击杯中，置于冰上20min。选择“Ec3”程序(3.OkV，6.Omsec)电击一次。迅速将细胞SMM配制的LB液体培养基中，于30°C，180rpm培养4hr。涂卡那霉素平板，30°C培养。(SMM配方0.5M蔗糖，20uMMgCl2,20uM顺丁烯ニ酸，用NaOH调pH至6.5)。将长出来的单菌落挑至IOmLLB液体培养基中，加入卡那霉素至终浓度为50ug/mL,加入诱导剂acetamide(こ酰胺，购自sigma-aldrich,目录号695122-1G)至终浓度为0.5%(w/v)，30°C培养约48hr。将菌液离心(4°C,8000rpm,3min),弃上清,加入ImL0.IMPBS重悬,再次同样条件离心，加入200iiL的PBS重悬，进行荧光显微镜观察。7Westernblot鉴定融合蛋白7.I样品的制备将含有诱导剂acetamide的细菌培养至指数生长末期,取0.5mL菌液离心(4°C,8000rpm,3min),弃上清，加入ImL0.IMPBS重悬，再次同样条件离心，加入200yL的2Xsamplebuffer(加样缓冲液)，200瓦功率超声8次，超声循环条件为超声3s，停顿3s。然后置于金属加热器上加热至95°C,5min,样品放于4°C冰箱。7.2电泳10%聚丙烯酰胺凝胶的制备配方如下表所示分离胶(10%，IOmL)浓缩胶(5%，5mL)水4mL3.4mL30%丙烯酰胺3.3mL0.83mLTirs-HCl2.5mL(1.5M,pH8.8)0.63mL(lM,pH6.8)10%SDSO.lmL0.05mL10%过硫酸胺O.lmL0.05mLTEMED0.005mL0.005mL分离胶的配制首先安装好配胶专用装置，所用的物品需充分洗净并干燥，测试不漏水以后方可进行。在冰上按配方配好分离胶后，混勻。然后吸取7.5mL分离胶缓缓加入制胶槽中，随即用移液器慢慢加入2mL去离子水进行压胶。至少聚合45分钟后方可进行浓缩胶的配制。浓缩胶的配制首先吸干压胶的水，插上合适的样品梳。然后在冰上按配方配好5mL的浓缩胶，混勻。然后用移液器小心的将浓缩胶加入到制胶槽中直至加满为止。等待凝胶聚合。此过程中可能会有缩胶现象，需要补齐浓缩胶。大约聚合30分钟即可。点样将梳子从凝胶中拔出，安装好电泳槽并住满电泳缓冲液，然后用移液器点样，每孔点样品10微升，在靠边的泳道点IOyL预染marker(分子量标准)。空泳道用上样缓冲液补齐。电泳恒定电流电泳，25mA每块胶，电泳至溴酚蓝前沿距凝胶底部0.5cm处停止，此过程大约需要lOOmin。7.3转膜转移前准备将凝胶取下，去除浓缩胶后，置于转移缓冲液中平衡15min。将PVDF膜剪成6.5cm*8.3cm大小，先置于甲醇中活化30sec，然后在转移缓冲液中平衡15min。同时剪取2张Bio-rad专用电转滤纸2张，大小为8cm*lcm，置于电转液平衡5min。转移取干净的25cm直径的大圆平皿，倒满转移缓冲液。然后将转印夹黑面朝下，依次平铺海绵垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫，此过程中用厚梳子赶净凝胶与PVDF膜中的气泡，最后夹紧转印夹，按正负极顺序正确置于转印槽中，灌满转移缓冲液，盖好电极盖。整体置于冰上，设置恒定电流模式，200mA，转印2hr。7.4杂交取下PVDF膜，置于干净的小方盒中，用TBS漂洗2遍，每次lmin。将PVDF膜置于封闭液中封闭，室温摇动孵育》ir。将封闭的膜用TBS漂洗2遍，每次lmin。加入IOmL用抗体稀释液配制的GFP小鼠单克隆抗体，稀释比例为12000，于4°C下置于摇床上摇动孵育过夜。用洗膜缓冲液洗ー抗3次。加入20mL山羊抗小鼠ニ杭，稀释比例为110000，室温，摇动孵育Ihr。用洗膜缓冲液洗3次，毎次:3min。7.5化学发光试剂检测底物孵育将底物A液和B液各取0.5mL，在ParafiIm膜上混勻待用。将PVDF取出后置于滤纸上吸干多余液体。后将其正面朝下平铺于已经混合均勻的底物上，孵育30sec，浙干多余的底物，然后将膜用保鲜膜包好置于X光胶片盒中，注意防止气泡出现。曝光在暗室红灯下操作，将胶片迅速贴紧PVDF膜，盖紧X光胶片盒盖，根据荧光強度，控制曝光时间在lOsec-anin之间。红灯下显影至合适的条带深度，用清水漂洗停止显影，然后定影45秒左右至胶片完全透亮为止，最后用清水冲洗2遍。将胶片置于架子上晾干，标记好预染marker(分子量标准)在胶片上的位置，最后扫描胶片获得数据。7.6相关溶液的配方Tris-甘氨酸电泳缓冲液25mMTris，250mM甘氨酸，0.1%(m/v)SDS；电泳转移缓冲液25mMTris，192mM甘氨酸，15%甲醇(ν/ν)，冷却至4°C备用’2X样品缓冲液100mMTris-HCl(pH6.8)，8%SDS(m/v)，20%甘油(ν/ν)，0.2%溴酚蓝(m/v),200mMDTT；TBS缓冲液20mMTris,150mMNaCl，pH7.5；洗膜缓冲液TBS缓冲液+0.2%奶粉+0.2%Tween20；封闭液TBS缓冲液+5%脱脂奶粉+0.2%Tween20；抗体稀释液TBS缓冲液+1%脱脂奶粉+0.2%Tween20。实验结果1.MLDS基因敲除产油红球菌Rodococcussp.RHAl起初是从农药污染的土壤中分离出的ー种菌株，它可以利用多种有机化合物作为碳源，如碳水化合物，类固醇，芳香族化合物，腈类化合物等等。在实验中，用营养肉汤(NB)培养基维持細胞生长，用矿物盐培养基(MSM)，包括少量的氮，并有充足的葡糖酸钠作为甘油三酯TAG累积的碳源。在比较蛋白组学的结果中，观察到MLDS(GI111019097)蛋白的肽段数在MSM环境的脂滴中明显減少，表明蛋白表达降低。有趣的是通过同源序列比较(http://pfam.ianelia.org),这个基因的同源蛋白是载脂蛋白。为了研究该蛋白的功能，我们利用pKlSmobsacB通过同源重组的方法对该基因进行敲除[12-13]，图1显示的是删除部位及其两侧的序列PCR引物的设计方案。并且通过PCR的方法对该基因的敲除进行确认(图2)。结果表明与阳性质粒对照(泳道1)相比，MLDS(83Ibp)基因被完全敲除(泳道幻，而细菌基因组作为阴性对照(泳道;3)，敲除部位及其两侧的序列也分别进行了PCR检测，进ー步确认基因敲除成功。为了进一歩分析该MLDS基因敲除菌的表型，用负染电镜和透射超薄切片电镜(TLC)分别观察了野生菌和MLDS基因敲除菌，发现在MLDS基因敲除菌中脂滴明显变大(图3)。TLC结果显示MLDS基因敲除菌的甘油三脂含量增多(图4)。2.MLDS蛋白的定位结果JAM-egfp是ー种能够在放线菌ー类微生物中表达外源蛋白的载体，为了研究影响脂滴大小的MLDS蛋白的定位，我们分别将JAM-egfp空载体和JAM-MLDS-egfp在野生型菌株中过表达[14-16]。与此同时，通过Wfesternblot鉴定融合蛋白的表达情況。Westernblot结果显示融合蛋白MLDS-GFP的含量很高，而单独的GFP几乎没有(图幻。这就确保了我们在荧光显微镜下看到的绿色是融合蛋白所发出的颜色，能够准确地反映出MLDS的定位情況。通过荧光显微镜的观察，我们看到当只有JAM-egfp载体转入細胞中吋，整个菌体中是均勻分布的绿色，而当JAM-MLDS-egfp转入细胞中时，可以看到細胞中有球型颗粒的分布(图6)，这表明MLDS蛋白是定位在脂滴表面的。脂滴的由小变大有两种可能性，其一是脂滴自己长大，其ニ是小脂滴融合成大脂滴。我们的结果支持第二种可能性，因为在MMLDS敲除的突变株中脂滴的个数明显变少。而脂滴融合的过程中又有两种可能的机制在调节，一方面是某些蛋白的正调节，例如SNARE、ADRP，他们可以促使小的脂滴融合成大脂滴；另ー方面是某些蛋白的负调节，例如MMLDS，它保护着脂滴，不让脂滴之间相互融合，这两个方面在細胞内达到动态的平衡，而当我们把起负调节作用的MMLDS敲除之后就会使脂滴趋向于融合。參考文献1.Singh,Α.,P.S.Nigam,andJ.D.Murphy,Mechanismandchallengesincommercialisationofalgalbiofuels.BioresourTechnol,2010.2.Smith,V.H.,etal.,Theecologyofalgalbiodieselproduction.TrendsEcolEvol，2010.25(5):p.301-9.3.Maeda,K.,etal.,Adipocyte/macrophagefattyacidDindingproteinscontrolintegratedmetabolicresponsesinobesityanddiabetes.CellMetab,2005.1(2):p.107-19.4.Liu,P.，etal.,ChinesehamsterovaryK2celllipidaropietsappeartobemetabolicorganellesinvolvedinmembranetraffic.JBiolChem,2004.279(5)p.3787-92.5.Bartz,R.，etal.，Dynamicactivityoflipiddroplets:proteinphosphorylationandGTP—mediatedproteintranslocation.JProteomeRes，2007.6(8):p.3256-65.6.Zehmer,J.K.,etal.,Aroleforlipiddropletsininter-membranelipidtraffic.Proteomics,2009.9(4):p.914-21.7.刘平生，张.社.汪.，脂滴-細胞脂类代谢的細胞器.生物物理学报，2010.26(2):p.97-105.8.McLeod,Μ.P.，etal.，ThecompletegenomeofRnodococcussp.RHAlprovidesinsightsintoacataboiicpowerhouse.ProcNatlAcadSciUSA，2006.103(42):p.15582-7.9.Banerjee,A.,R.Sharma,andU.C.Banerjee,Thenitrile-degradingenzymescurrentstatusandfutureprospects.ApplMicrobiolBiotechnol，2002.60(1-2)p.33-44.10.Larkin，M.J.，L.A.Kulakov，andC.C.Allen，BiodegradationandRhodococcus__mastersofcatabolicversatility.CurrOpinBiotechnol,2005.Ib(3)p.282-90.丄1.Hernandez，M.A.，etal.，BiosynthesisofstoragecompoundsbyRhodococcusjostnRHAlandglobalidentificationofgenesinvolvedintheirmetabolism.BMCGenomics，2008.9:p.600.12.vanderGeize，R.，etal.，UnmarkedgenedeletionmutagenesisofkstD，encoding3-ketosteroidDeltal一dehydrogenase，inRhodococcuserythropolisSQlusingsacBascounter-selectablemarker.FEMSMicrobiolLett,2001.205(2)p.197-202.13.Sharp，J.0.，etal.，AninduciblepropanemonooxygenaseisresponsibleforN-nitrosodimethylaminedegradationbyRhodococcussp.strainRHAl.ApplEnvironMicrobiol,2007.73(21):p.6930-8.14.Hanisch,J.，etal.，Eukaryoticlipidbodyproteinsinoleogenousactinomycetesandtheirtargetingtointracellulartriacylglycerolinclusions.ImpactonmodelsoflipidbodyDiogenesis.ApplEnvironMicrooiol,2006.72(10):p.6743-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