专利名称：猪细小病毒灭活疫苗的制备方法及其产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种兽用活疫苗的制备方法，尤其涉及一种猪细小病毒灭活疫苗的制 备方法以及由该方法制备得到的猪细小病毒灭活疫苗，属于猪细小病毒灭活疫苗的制备领 域。
背景技术：
猪细小病毒(Porcin印arvo viurs,PPV)可引起猪的繁殖障碍，主要表现为胎儿和 胚胎的感染和死亡，而母体通常并不表现临床症状。血清学阴性母猪主要在妊娠的前半期 经口鼻感染病毒，结果免疫机能不全的胎儿经胎盘受到感染，从而导致发病。经检查得知在 世界各地的猪群中，该病毒是普遍存在的，在大多数猪场呈地方性流行。此病流行很广，在 欧、美、亚及大洋洲很多国家均有报道。我国的各省市相继分离到猪细小病毒，血清阳性率 很高。本病对养猪业的危害极大。由于PPV目前尚无有效的药物治疗方法，因此，该病的预 防免疫就显得更为重要。体外培养的动物细胞有两种类型，一种是非贴壁性细胞，培养时不贴附于支持物 上，而呈悬浮状态生长，胞体为圆形。来源于血液、淋巴组织的细胞，多数肿瘤细胞和部分转 化细胞属于这一类型，其培养方式类似微生物培养方式；另一种是贴壁依赖性细胞，培养时 能贴附在支持物表面生长。当细胞贴附在支持物上后，会迅速铺展，然后开始有丝分裂，进 入对数生长期，数天后可长成致密的细胞单层。成纤维细胞、上皮细胞以及Vero细胞、BHK 细胞、ST细胞等大多数动物细胞都属于此类型。目前中国生物制品生产上培养贴壁依赖性 细胞如Vero、ST细胞等多采用传统转瓶培养或静置培养，该工艺因具有技术成熟投资量小 的特点而被广泛应用，但其生产中细胞所能增殖的区域仅限于培养瓶的有限面积，培养的 环境条件难以监测和控制，因此细胞密度低，而且劳动强度大，操作过程不易控制，发生污 染，疫苗产量及质量受到极大限制。1967年，Van Wezal首次开发了微载体系统，创建了生物反应器微载体培养细胞 工艺，使动物细胞培养进入高密度培养阶段。微载体是直径为60-50 μ m的微珠。由于微载 体本身所占体积和质量不大，但有很大的有效面积可供细胞附着，大大提高了生产效率。微 载体最早使用的材料是离子交换凝胶(DEAE-S印hadexA-50)，轻微搅动即可悬浮于培养基 中。这种载体对细胞具有一定毒性，并且对培养液PH值也有一定影响。后来根据细胞生长 特点，对微载体进行了改良，使其带有电荷或其它介质，更利于细胞的附着和生长。目前微 载体己有葡聚糖微载体、聚苯乙烯微载体、中空玻璃微载体、交联明胶微载体、纤维素微载 体、聚苯烯酞胺微载体等多种不同制造材料类型。其中，使用较多的是Cyotdex型系列微载 体(Cytodexl，Cytodex2, CytodeX3)，它们都是带有不同基团的葡聚糖交联而成的大分子。 Cytodexl整个载体带有正电荷，用于传代细胞如Vero、CH0细胞的培养；CytodeX2仅表面带 有正电荷；CytodeX3不带电荷，其外表被胶原层包裹，胶原是豚鼠皮肤的提取物，同样适于 细胞的附着生长。第一个工业化应用微载体的是1980年Meignier等用于口蹄疫病毒疫苗 的制造，及后来的小儿麻痹疫苗的生产制造。
采用生物反应器/微载体系统培养动物细胞，细胞贴附于微载体上，悬浮于培养 基中，逐渐分裂生长成单层细胞。该培养模式把单层培养和悬浮培养融合起来，具有以下优
点(1)表面积/体积比大，单位体积培养细胞的产率高。如Img Cytodexl微载体表 面积可达5-6cm2，较传统的单层细胞培养面积大大增加。(2)改良后的微载体无毒性，其大小和表面性质更适宜细胞生长，而且具有一定的 透明度，便于显微镜观察细胞生长情况。(3)微载体悬浮于培养基中，细胞生长环境均一，简化了培养条件的监测和控制， 同时培养基利用率高。(4)采样重演性好，收获过程不复杂，劳动强度小，占用空间小，操作简便，所需人 员少，工艺容易放大生产。目前通过ST细胞静态培养增殖猪细小病毒(PPV)病毒液，已被广泛应用，然而目 前所用转瓶系统培养ST细胞生产疫苗的工艺，虽技术简单，但劳动强度大，即使简单的换 液都需付出巨大的劳动，且染菌风险大。应用生物反应器系统和微载体培养贴壁细胞具有 高比表面积、细胞产量高，悬浮培养系统便于监测、控制和取样，生产规模容易放大，不易染 菌等优点，工业上被广泛应用于生产如狂犬病毒、脊髓灰质炎病毒等疫苗。但是，利用生物反应器系统和微载体培养ST细胞生产PPV疫苗存在着猪细小病毒 液培养产量偏低、不易规模放大、成本过高、疫苗质量不稳定等缺陷，这些缺陷严重影响或 制约了该方法在实际生产中的应用，有待改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法中所 存在的猪细小病毒液培养产量偏低、不易规模放大、成本过高、疫苗质量不稳定等缺陷，提 供一种新的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，该制备方法利用生物反应器微载体悬浮培养 ST细胞高效生产猪细小病毒液，对生产工艺参数进行了优化，该方法具有所生产的猪细小 病毒液病毒滴度高，能够规模化工业生产、成本低、疫苗质量稳定等优点。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，包括(1)将猪细小病毒弱毒株接种ST细 胞，培养得到生产种毒；( 将处理后的微载体加入到生物反应器的细胞生长液中，搅拌； (3)将ST细胞接入到生物反应器的微载体中进行搅拌，进行细胞的繁殖培养；(4)将猪细小 病毒生产种毒感染生物反应器中悬浮培养的ST细胞，进行病毒的繁殖培养；(5)收获繁殖 的病毒液，灭活，配苗，即得。本发明制备方法中，所述的猪细小病毒弱毒株可以是猪细小病毒弱毒L株，其微 生物保藏号是CGMCC No. 3352 ；其中，步骤⑵中所述的微载体可以是Cyotdex型系列微载体，更优选为 Cytodex-I型微载体，所述的预处理方式包括硅化、水化和平衡；优选的，步骤( 中将预处理后的微载体按照每升细胞生长液中含有5_7g的微载 体的配比比例加入到细胞生长液中；步骤( 中所述的搅拌速度优选为40rpm;所述的搅拌 时间为20-40min，优选为30min。
本发明考察了 ST细胞的不同培养方式对细胞密度的影响，实验结果发现，采用灌 注培养的细胞密度明显高于批式培养的细胞密度，本发明在进行ST细胞培养时优选采用 灌注培养的细胞培养方式。此外，在灌注培养中，本发明发现细胞接种浓度对于细胞的生长 速度和稳定性等有显著影响，本发明通过大量的实验最终发现，当ST细胞以IXio5AiL浓 度接种到生物反应器中的微载体上时，第7天细胞密度就可达1 X IOVmL,细胞状态稳定，维 持时间长，利于病毒繁殖。本发明人通过大量的实验发现，搅拌速度对于细胞的贴壁影响非常大。本发明通 过大量的实验发现，步骤(3)中所述的搅拌采用以下搅拌速度时最有利于细胞的贴壁首 先在转速为SOrpm的速度下搅拌1-3分钟，再将转速调整为50-60rpm ；更优选为首先在转 速为SOrpm的速度下搅拌1-3分钟，再将转速调整为50rpm。其中，步骤(3)中所述的培养温度优选为37°C，培养液的pH值优选为7. O。本发明还发现，步骤中猪细小病毒生产种毒感染细胞的剂量对于病毒液的病 毒滴度有着一定的影响，本发明通过实验筛选发现，将猪细小病毒生产种毒以感染复数为 0. OOlMOI、0. OlMOI、0. 05M0I感染生物反应器中悬浮培养的ST细胞有利于提高病毒液的病 毒滴度，尤其是将猪细小病毒毒生产种毒以感染复数为0. OlMOI感染生物反应器中悬浮培 养的ST细胞进行灌注培养法培养可以有效提高病毒液的病毒滴度。其中，所述步骤(4)中 所述的灌注培养温度优选为35°C，培养液的pH值优选为7. 4，所述的搅拌速度为50-60rpm。本发明根据ST细胞生长代谢及病毒增殖的特点，对搅拌式生物反应器灌注培养 技术应用于猪细小病毒疫苗生产进行研究，对各技术参数进行优化和筛选，使细胞增殖时 培养环境稳定，并在接种病毒后细胞仍能得到足够的营养和平衡的环境；同时乳酸和氨 等有毒代谢产物得以不断排除，本发明方法的细胞维持时间长，细胞活力高(> 90% )、 活细胞密度大(彡lX107cellS/mL)，有利于病毒的持续繁殖，所制备的猪细小病毒 TCID50 ^ 108_°。生产过程衔接紧密、顺畅，规模放大容易，生产周期短，占用场地小，环境污 染少且易于处理，猪细小病毒的收获方便质量易于实现均衡稳定，可显著降低生产成本、提 高疫苗产量和质量。
图1本发明生物反应器微载体培养ST细胞生产猪细小病毒病毒液的工艺流程图。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实验材料1.细胞ST细胞(购自中国兽医药品监察所)。2.毒种猪细小病毒L株，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，微生物保藏号CGMCC No. 3352。3.微载体Cytodex-l，Pharmacia 公司产品。
4.试剂活细胞计数试剂盒(CCK-8)，日本同仁化学研究所产品。实施例1 微载体的处理1.硅化取数ml硅油，将搅拌瓶内壁浸湿，回收多余的硅油，烘干搅拌瓶后，用自 来水洗九次，双蒸水洗三次，烘干备用。2.水化按培养的终体积称取微载体适量，使微载体Cytodexl的终浓度为^ig/ ml，放入搅拌瓶中，用无Ca2+、Mg+2-PBS 100ml/g，室温浸泡过夜或37°C浸泡!3hr，弃去PBS， 再用无Ca2+、Mg2+-PBS 50ml/g洗一次，弃去，最后加入无Ca2+、Mg2+-PBS 50ml/g，高压灭菌， 115°C,IOpsi,15min。3.平衡弃去搅拌瓶中的PBS，加入高糖细胞生长液100ml/g，室温过夜，临用前再 用上述培养液洗一次。实施例2 生物反应器微载体培养ST细胞1、细胞复苏从液氮罐中取出ST细胞冻存管，迅速放入盛有36°C -37°C水中，摇 动冻存管，尽快解冻；用吸管吸出细胞悬液，装入无菌离心管中，补加IOmL细胞生长液(含 5%小牛血清的MEM培养液)，吹打使细胞悬浮；将细胞悬液离心，IOOOrpm离心10分钟，弃 上清；加入细胞生长液适当稀释后，移入细胞培养瓶中，置37°C培养箱培养，6小时后更换 细胞生长液一次，再继续培养。2、细胞的传代与培养取生长良好的致密单层ST细胞，吸出细胞生长液，用PBS洗 涤1-2次；再加入浓度为0. 25%的胰酶消化液，37°C消化5分钟，待细胞层松散、细胞圆缩 时，吸出细胞消化液，加入少量细胞生长液吹打细胞，制成均勻细胞悬液，将适量细胞悬液 移入灭菌细胞瓶，每瓶补加适量生长液，置37°C恒温培养，形成良好细胞单层时，用于继续 传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养。3、细胞毒种的繁殖用维持液(1%小牛血清的MEM培养液)将猪细小病毒L株毒 种按1-5%比例接种到步骤2形成的细胞单层培养，细胞70-100%病变时收获病毒液；再将 此病毒液作为种毒，在细胞上继续进行传代复壮，作为生产种子。4、ST细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养生物反应器(B. Braun公司， BiostatUD50生物反应器)按总体积的50-70%加入无菌细胞生长液(5%小牛血清的MEM 培养液)，且每升无菌细胞生长液中按5-7g/L浓度加入微载体，启动生物反应器，40rpm搅 拌30min后，取步骤2中培养好的ST细胞单层，用EDTA-胰酶细胞消化液制备细胞悬液，细 胞计数后按IX IO5个/ml的密度接种到生物反应器中，调整转速为SOrpm搅拌1_3分钟， 再将转速保持为50rpm，反应器温度逐步调整至37°C，反应液的pH值控制为7. 0，一直保持 该条件进行细胞培养。应用活细胞计数试剂盒(CCK-8)测定细胞活力，经测定活细胞密度 彡lX107cells/mL，细胞活力彡90%。5、制苗毒液的繁殖接种后的第7天，微载体上的细胞长满80-90%，空球率低于 5 %，满球率大于85%，培养细胞处于对数生长期，且细胞计数达到IX Kfcells/mL以上； 此时，将罐体温度调整为35°C，用正压排出罐中液体，加入2L PBS洗涤细胞，搅拌10分钟后 排出，重复洗涤2次。再用蠕动泵加入适量毒种，并补足维持液至工作体积。将步骤3中获得的猪细小病毒病毒液以感染复数为0. 01M0I直接感染ST细胞，控 制搅拌速度为50-60rpm。接毒后每隔一定时间取生物反应器中的微载体，用显微镜观察细胞病变情况，并检测样品TCID50 ；当为载体上的细胞全部脱落，且OD值呈明显上升趋势，停 止反应器搅拌，待微载体全部沉到反应器底部后，收获上清和微载体。经检测，本实施收获 的猪细小病毒TCID50彡IO8 0 ；作为对照，应用细胞转瓶生产猪细小病毒TCID50 ( 107_°。6、收获病毒液的处理病毒液和微载体经3次冻融后，离心去除细胞碎片， 置-20°C保存备用。上述方案中，生物反应器参数调节1)温度ST细胞增殖培养时控制温度设定为37°C，接种PPV后控制温度设定为 35 "C。2)pH值ST细胞增殖培养时控制pH设定为7. 0，接种病毒液后控制pH设定为7. 4。 PH波动为士0. 1。3)溶氧培养初期使用压缩空气调节溶氧值，控制溶氧设定为60%。溶氧波动为 士 10%;培养中后期，当细胞密度大于IO6ceIlsAiL时，使用氧气和氮气调节溶氧值，控制溶 氧设定为50%。溶氧波动范围为30%-80%。4)灌流量每天取样测定罐体收集液的葡萄糖浓度，以葡萄糖残余浓度为参考调 整液体的灌流量。实施例3 猪细小病毒病灭活苗的制备1、收获病毒液毒价测定将实施例2中收获的细胞病毒液混合后取样，测定 毒价，收获的猪细小病毒TCID50彡108_°;而应用细胞转瓶生产(对照)猪细小病毒 TCID50 ( IO7 002、灭活按病毒液总量的0.02%向病毒液中加入二乙烯亚胺溶液，充分振荡后， 于30°C、100r/min摇床上灭活72h，然后加入1 %硫代硫酸钠溶液，终止灭活。并作无菌检 验及灭活检验。3、油佐剂灭活疫苗的配制按照注射用白油94份、司本-80 6份和硬脂酸铝1. 5 份的比例配制油相；按照96ml抗原加入吐温-80及0. 01 %加入硫柳汞的比例配制水 相；水相和油相按照1 1. 5比例进行乳化，制成油包水单相苗。试验例1生物反应器微载体培养ST细胞生产猪细小病毒病毒液的各工艺参数的 优化试验(1)搅拌速度对细胞贴壁的影响设置了 6组试验试验1组将ST细胞按密度1 X IO5个/ml接入到生物反应器的微载体中进行培 养，首先在转速为SOrpm的速度下搅拌3分钟，再将转速调整为40rpm ；试验2组将ST细胞按密度1 X IO5个/ml接入到生物反应器的微载体中进行培 养，首先在转速为SOrpm的速度下搅拌3分钟，再将转速调整为50rpm ；试验3组将ST细胞按密度1 X IO5个/ml接入到生物反应器的微载体中进行培 养，首先在转速为SOrpm的速度下搅拌3分钟，再将转速调整为60rpm ；试验4组将ST细胞按密度1 X IO5个/ml接入到生物反应器的微载体中进行培 养，首先在转速为SOrpm的速度下搅拌3分钟，再将转速调整为SOrpm ；试验5组将ST细胞按密度1 X IO5个/ml接入到生物反应器的微载体中进行培 养，首先在转速为SOrpm的速度下搅拌3分钟，再将转速调整为IOOrpm ；
试验6组将ST细胞按密度1 X IO5个/ml接入到生物反应器的微载体中进行培 养，首先在转速为SOrpm的速度下搅拌3分钟，再将转速调整为150rpm ；对6组的细胞贴壁情况进行监测，取样进行细胞计数，结果显示，搅拌速度对细胞 贴壁影响很大，试验2组(50rpm)最有利于细胞贴壁，当搅拌速度达150rpm左右时，细胞几 乎不贴壁。表1不同转速的游离细胞数比较
权利要求
1.一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，包括(1)将猪细小病毒(Porcin印arvo viurs)弱毒株接种ST细胞，培养得到生产种毒；(2)将处理后的微载体加入到生物反应器 的细胞生长液中，搅拌；C3)将ST细胞接入到生物反应器的微载体中，搅拌，进行细胞的繁 殖培养；(4)将猪细小病毒生产种毒感染生物反应器中悬浮培养的ST细胞，进行病毒的繁 殖培养；( 收获繁殖的病毒液，灭活，配苗，即得。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的猪细小病毒弱毒株是猪细小 病毒弱毒L株，其微生物保藏号是CGMCC No. 3352。
3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的微载体是Cyotdex 型系列微载体，优选为Cytodex-I型微载体；所述的预处理方式包括硅化、水化和平衡。
4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤中将预处理后的微载体按 照每升细胞生长液中含有5_7g的微载体的配比比例加入到细胞生长液中。
5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤中所述的搅拌速度为 40rpm ；所述的搅拌时间为20_40min，优选为30min。
6.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤⑶中所述的搅拌包括首先在 转速为SOrpm的速度下搅拌1-3分钟，再将转速调整为50_60rpm ；优选的，在转速为SOrpm 的速度下搅拌1-3分钟，再将转速调整为50rpm。
7.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(3)采用灌注培养法进行细胞 的繁殖培养，包括将培养温度逐步调整至37°C，培养液的pH值控制为7. O。
8.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤中将猪细小病毒生产种毒 以感染复数为0. 001M0I、0. 01M0I、0. 05M0I感染生物反应器中悬浮培养的ST细胞进行培 养；优选的，步骤(4)中将猪细小病毒生产种毒以感染复数为0. OlMOI感染生物反应器中悬 浮培养的ST细胞，搅拌，采用灌注培养法进行病毒的繁殖培养。
9.按照权利要求8所述的制备方法，其特征在于步骤中所述的灌注培养温度为 350C，培养液的pH值为7. 4，所述的搅拌速度为50-60rpm。
10.权利要求1-9任何一项制备方法制备得到的猪细小病毒灭活疫苗。
全文摘要
本发明公开了猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，包括(1)将猪细小病毒弱毒株接种ST细胞，培养得到生产种毒；(2)将处理后的微载体加入到生物反应器中的细胞生长液中，搅拌；(3)将ST细胞接入到生物反应器中的微载体中进行细胞的繁殖培养；(4)将猪细小病毒生产种毒感染生物反应器中悬浮培养的ST细胞进行病毒的繁殖培养；(5)收获繁殖的病毒液，灭活，配苗，即得。本发明方法细胞维持时间长，细胞活力高、活细胞密度大，有利于病毒的持续繁殖，所制备的病毒液病毒滴度高。本发明方法的生产过程衔接紧密、顺畅，规模放大容易，猪细小病毒的收获方便，质量稳定，可显著降低生产成本、有效提高疫苗产量和质量。
文档编号A61P31/20GK102091329SQ201110032529
公开日2011年6月15日 申请日期2011年1月30日 优先权日2011年1月30日
发明者任德强, 姜力, 张婷婷, 张明艳, 张智明, 戴秀莉, 柴华, 武佳斌, 王彬, 王琪, 藏玉婷 申请人:哈药集团生物疫苗有限公司