专利名称：一种骨肽组合物及其制剂、制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物组合物，具体讲，涉及一种骨肽组合物及其制剂、制备方法和应用。
背景技术：
从动物骨中提取的提取物，其主要成分为小分子多肽类物质，是由胶原蛋白分解而来的小分子肽类混合物，具有调节骨代谢、刺激成骨细胞增殖，促进新骨形成，以及调节钙、磷代谢，增加骨钙沉积，防止骨质疏松的作用，临床上主要用于促进骨折愈合。其中，多肽提取物可通过补充和增加各种成骨因子，直接作用于成骨软骨及破骨细胞，促进骨与软骨基质的合成，加速损伤愈合与修复；同时，动物骨中的多肽提取物还可以促进体内生长激素、促甲状腺激素、甲状腺激素的分泌，同时全面促进人体代谢、间接调节骨与软骨的生长代谢，最终促进骨质形成，提高骨愈合质量。现有技术中公开了很多关于骨肽、骨肽注射剂的报道和研究。针对骨肽提取的工艺做了一系列深入的研究。例如在专利申请200510076912. 8，骨肽注射液及其制备方法， 该专利中公开了一种新的骨肽注射液制备方法及由该方法得到的产品，其制备方法如下 1).将哺乳动物骨用盐水热压煮提一次或多次，离心过滤，合并煮提液，在低温下放置1 40小时，将提取液温热后离心过滤，收集滤液备用；幻将滤液真空浓缩后加入乙醇，静置沉淀，吸出上层醇液，定容回收乙醇，得水提液；幻将水提液加等体积蒸馏水，依次通过弱酸性阳离子树脂柱、弱碱性阴离子树脂柱、珠状壳聚糖柱和壳聚糖改性活性炭柱，去杂纯化， 得纯净稀药液；4)将纯净稀药液浓缩后，加压过微孔滤膜，将滤液灌装、熔封、热压灭菌，或将所得药液通过冷冻干燥，得到冻干粉针剂。该方法制备工艺复杂，需要采用多种提取柱子，成本高，不适用于大规模的工业化生产。专利申请03111084. 3骨肽氯化钠注射液及其制备工艺，公开了一种骨肽氯化钠注射剂，该产品由骨肽溶液、氯化钠和注射用水构成，其制备工艺包括以下过程取胎牛四肢骨，加纯水于100 120°C热压提取两次，每次0. 5 2小时，提取液过滤，用HCI调pH值 3. 0 5. 5静置15 M小时，离心，取上清液用NaOH调pH值8. 0 10. 0，在_10°C _25°C 冷冻M小时以上，取出融化，离心，取上清液，用HCI调pH值至6. 5 7. 5，加热至70 IOO0C，离心，取上清液，用分子量5000 10000膜超滤，收集超滤液，制得骨肽溶液；在浓度为3%的氯化钠溶液中加入0. 05 2% g/ml的活性炭，煮沸5 30分钟，过滤脱炭，冷却至室温，0. 45um微孔滤膜过滤，加入处方量的所述的超滤液，调pH值6. 5 7. 5，用0. 22um 微孔滤膜除菌，于100 115C°C灭菌30分钟。该专利的提取方法中采用了高压提取，并且提取工艺的时程很长，会对提取物的生物活性产生影响。已有技术中未对所提取的骨肽提取物的成分进行分析，并且已有技术中的提取方法还有一系列缺陷，例如大分子物质含量高、游离脂肪酸含量高等，本发明对提取技术进行了近一步的改进，大幅度的提高了产率，大大降低了大分子物质、游离脂肪酸的含量；并且本发明还对所制备得到的骨肽提取物做了进一步的研究，研究了其组成成分，测定了其中含有的多肽物质的序列及其含量，通过测定可知，本发明的骨肽提取物中多肽物质的含量较现有技术有大幅度的提高。并且通过药理实验证明，本发明的骨肽提取物具有更好的治疗效果。
发明内容
本发明的首要发明目的在于提出一种骨肽组合物。本发明的第二发明目的在于提出该骨肽组合物的制剂。本发明的第三发明目的在于提出该骨肽组合物的制备方法。本发明的第四发明目的在于提出该骨肽组合物的用途。为了实现本发明的发明目的，采用的技术方案为本发明涉及一种骨肽组合物，其特征在于，所述的骨肽组合物包括骨多肽化合物 A 8 10重量份、骨多肽化合物B 5 8重量份、骨多肽化合物C 5 8重量份、骨多肽化合物D 4. 5 7. 5重量份、骨多肽化合物E 3 6重量份、游离氨基酸16 22重量份、核糖0. 3 5. 4重量份、微量元素0. 04 0. 12重量份、游离脂肪酸0 0. 01重量份；其中所述的骨多肽化合物A的氨基酸序列为SEQ ID NO=I ；骨多肽化合物B的氨基酸序列为SEQ ID NO 2 ；骨多肽化合物C的氨基酸序列为SEQ ID NO 3 ；骨多肽化合物D 的氨基酸序列为SEQ ID NO 4 ；骨多肽化合物E的氨基酸序列为SEQ ID NO :5。其中SEQ ID NO :1 的氨基酸序列为Arg-Glu-Asp-Arg-Val-Ala-Tyr-Phe-Phe-Glu-Pro -Arg ；SEQ ID NO :2 的氨基酸序列为Thr-Pro-Leu-Val-Gly-Lys-Thr-Thr-Trp-Pro-Leu -Lys ；SEQ ID NO 3的氨基酸序列为Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-LyS-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Gly-Leu ；SEQ ID NO 4的氨基酸序列为Lys-Leu-Leu-Gly-Val-Ala-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Pro-Arg ；SEQ ID NO 5 的氨基酸序列为Arg-Gln-Gly-Pro-Leu-Gly-Gln-Pro-Pro_Arg。本发明的第一优选技术方案为所述的骨肽组合物包括骨多肽化合物A 8. 5 10重量份、骨多肽化合物B 5. 5 8重量份、骨多肽化合物C 5. 5 8重量份、骨多肽化合物D 5 7. 5重量份、骨多肽化合物E 3. 2 6重量份、游离氨基酸16 22重量份、核糖 0. 3 5. 4重量份、微量元素0. 04 0. 12重量份、游离脂肪酸O 0. 005重量份。本发明的第二优选技术方案为所述的氨基酸包括门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、酪氨酸。本发明的第三优选技术方案为所述的微量元素包括钙、锂、钠、镁、硅、磷、钾、硫、 锰、铁和锶。本发明还涉及利用本发明的骨肽组合物制备的注射剂，包括粉针、水针和输液。其中，所述的制剂采用公知的方法制备，可制备出不同剂量的制剂以适应患者的需要。本发明还涉及该骨肽组合物的制备方法，包括以下步骤
1.取健康新鲜冷冻的哺乳动物的四肢骨，洗净，压碎；2.压碎的四肢骨用骨泥机磨成骨泥，放入提取罐中，加3 6倍量水，80 100°C 保温搅拌1 2小时，取上清液储存；将得到的骨渣加入2 4倍量水，80 100°C保温搅拌1 2小时，取上清液；合并二次得到的上清液浓缩至原料重；3.将步骤O)中得到的溶液于-5 0°C条件下，放置12 M小时，除去上层脂肪；4.溶液用盐酸调pH值4. 5 5. 5，加热煮沸15 30min，过滤，冷却后，于-5 0°c条件下放置12 Mh，去除上层脂肪，低温离心；5.酸性滤液用氢氧化钠溶液调pH值7. 5 9. 5，加热煮沸15 30min，过滤，冷却后，于-5 0°C条件下放置12 Mh，去除上层脂肪，低温离心；6.溶液用盐酸调至中性，用10000分子量的超滤器超滤，超滤液浓缩至规定体积；7.溶液用盐酸调pH值4. 5 5.0，按溶液量的0.1%加入药用活性炭，加热至 100°C搅拌吸附30min，冷却降温至30 35°C，用0. 22 μ m微孔滤膜过滤得精滤液；8.精滤液用氢氧化钠溶液调pH6. 5 7. 5，用6000道尔顿的超滤器超滤，得超滤液；9.超滤液减压干燥，即得本发明的骨肽组合物。本发明制备方法的第一优选技术方案为在步骤O)中，将所述的骨泥采用微波作用，微波功率为450W，作用时间为5 30分钟，优选5 15分钟。本发明制备方法的第二优选技术方案为所述的骨肽组合物制备方法中的浓缩均采用减压浓缩，温度为50 80°C，优选60 70°C。本发明制备方法的第三优选技术方案为在步骤中的(3)、(4)、(5)中，在0°C条件下放置12 18h，去除上层脂肪，低温离心去除沉淀。本发明制备方法的第四优选技术方案为在步骤中的⑷和(5)中，所述的离心的条件为2000 4000转/分钟，优选2000 3000转/分钟；离心10 30分钟，优选10 20分钟。本发明制备方法的第五优选技术方案为在步骤(9)中还可以添加赋形剂、稳定剂、PH值调节剂。将本发明制备得到的骨肽组合物通过高效液相色谱法进行分析，测得5种含量较高的多肽化合物，分别将其命名为骨多肽化合物A、骨多肽化合物B、骨多肽化合物C、骨多肽化合物D和骨多肽化合物E，并采用质谱法进行分析、测序，测得其氨基酸序列。同时采用高效液相色谱法测定了骨肽组合物中氨基酸的种类，采用比色法测定了其核糖的含量， 采用原子吸收分光光度法测定了其微量元素的含量，采用滴定法测定了其游离脂肪酸的含量。下面对本发明的内容进行进一步的解释和说明本发明提出了一种成分确切的骨肽组合物，经过检测，本发明的骨肽组合物中含有多肽化合物的总重量份为25. 5 39. 5，其中含量丰富的有5种多肽，本发明对含量相对丰富的多肽化合物采用高效液相色谱进行了分离，其中包括多肽化合物A 8 10重量份、 多肽化合物B 5 8重量份、多肽化合物C 5 8重量份、多肽化合物D 4. 5 7. 5重量份、 多肽化合物E3 6重量份；并且采用质谱法对5种多肽化合物的氨基酸序列进行了分析。
其中，高效液相色谱分离的条件为C18色谱柱，250mmX50. 0mm, 5u ；流动相A 含 0. 05%甲酸的水溶液；流动相B 乙腈；流速:lml/min ；柱温:40°C ；梯度洗脱
权利要求
1.一种骨肽组合物，其特征在于，所述的骨肽组合物包括骨多肽化合物A 8 10重量份、骨多肽化合物B 5 8重量份、骨多肽化合物C 5 8重量份、骨多肽化合物D 4. 5 7. 5重量份、骨多肽化合物E 3 6重量份、游离氨基酸16 22重量份、核糖0. 3 5. 4重量份、微量元素0. 04 0. 12重量份、游离脂肪酸0 0. 01重量份；其中所述的骨多肽化合物A的氨基酸序列为SEQ ID NO 1 ；骨多肽化合物B的氨基酸序列为SEQ ID NO 2 ；骨多肽化合物C的氨基酸序列为SEQ ID NO 3 ；骨多肽化合物D的氨基酸序列为SEQ ID NO 4 ；骨多肽化合物E的氨基酸序列为SEQ ID NO :5。
2.根据权利要求1所述的骨肽组合物，其特征在于，所述的骨肽组合物包括骨多肽化合物A 8. 5 10重量份、骨多肽化合物B 5. 5 8重量份、骨多肽化合物C 5. 5 8重量份、骨多肽化合物D 5 7. 5重量份、骨多肽化合物E 3. 2 6重量份、游离氨基酸16 22 重量份、核糖0. 3 5. 4重量份、微量元素0. 04 0. 12重量份、游离脂肪酸0 0. 005重量份。
3.根据权利要求1所述的骨肽组合物，其特征在于，所述的氨基酸包括门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和酪氨酸。
4.根据权利要求1所述的骨肽组合物，其特征在于，所述的微量元素包括钙、锂、钠、 镁、硅、磷、钾、硫、锰、铁和锶。
5.根据权利要求1所述的骨肽组合物，其特征在于，将所述的骨肽组合物制备成注射剂，所述的注射剂包括水针、粉针和输液。
6.根据权利要求5所述的骨肽组合物，其特征在于，所述的注射剂中还添加赋形剂、稳定剂、PH值调节剂。
7.根据权利要求1 4任一权利要求所述的骨肽组合物，其特征在于，所述骨肽组合物的制备方法包括以下步骤取健康新鲜冷冻的哺乳动物的四肢骨，洗净，压碎；(2)压碎的四肢骨用骨泥机磨成骨泥，放入提取罐中，加3 6倍量水，80 100°C保温搅拌1 2小时，取上清液储存；将得到的骨渣加入2 4倍量水，80 100°C保温搅拌 1 2小时，取上清液；合并二次得到的上清液浓缩至原料重；(3)将步骤O)中得到的溶液于-5 0°C条件下，放置12 M小时，除去上层脂肪；(4)溶液用盐酸调pH值4.5 5. 5，加热煮沸15 30min，过滤，冷却后，于-5 0°C 条件下放置12 Mh，去除上层脂肪，低温离心；(5)酸性滤液用氢氧化钠溶液调pH值7.5 9. 5，加热煮沸15 30min，过滤，冷却后， 于-5 0°C条件下放置12 Mh，去除上层脂肪，低温离心；(6)溶液用盐酸调至中性，用10000分子量的超滤器超滤，超滤液浓缩至规定体积；(7)溶液用盐酸调pH值4.5 5. 0，按溶液量的0. 加入药用活性炭，加热至100°C 搅拌吸附30min，冷却降温至30 35°C，用0. 22 μ m微孔滤膜过滤得精滤液；(8)精滤液用氢氧化钠溶液调pH6.5 7. 5，用6000道尔顿的超滤器超滤，得超滤液；(9)超滤液减压干燥，即得本发明的骨肽组合物。
8.根据权利要求7所述的骨肽组合物，其特征在于，在步骤O)中，将所述的骨泥采用微波作用，微波功率为450W，作用时间为5 30分钟，优选5 15分钟；然后再放入提取罐中提取。
9.根据权利要求7所述的骨肽组合物，其特征在于，所述的骨肽组合物制备方法中的浓缩均采用减压浓缩，温度为50 80°C，优选60 70°C。
10.根据权利要求7所述的骨肽组合物，其特征在于，在步骤中的(3)、(4),(5)中，在 0°C条件下放置12 18h，去除上层脂肪；在步骤中的(4)和(5)中，所述的离心的条件为 2000 4000转/分钟，优选2000 3000转/分钟；离心10 30分钟，优选10 20分钟。
11.权利要求1所述的骨肽组合物在制备抗炎，镇痛，促进骨折愈合药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种骨肽组合物，该骨肽组合物包括骨多肽化合物A 8～10重量份、骨多肽化合物B 5～8重量份、骨多肽化合物C 5～8重量份、骨多肽化合物D 4.5～7.5重量份、骨多肽化合物E 3～6重量份、游离氨基酸16～22重量份、核糖0.3～5.4重量份、微量元素0.04～0.12重量份、游离脂肪酸0～0.01重量份；其中对骨多肽化合物A、B、C、D、E的氨基酸序列进行了测定；本发明还涉及该骨肽组合物的制备方法及用途，该骨肽组合物的制备方法简便、易于操作、收率高，所制备的骨肽组合物的生物活性高。
文档编号A61P29/00GK102188692SQ20111011050
公开日2011年9月21日 申请日期2011年4月29日 优先权日2011年4月29日
发明者丛艳, 俞嘉林, 吴晶晶, 权晓丹 申请人:俞嘉林