专利名称：一种层粘连蛋白受体的配体胃窦粘膜蛋白-18在肿瘤治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种层粘连蛋白受体的配体，更具体地说是一种含该配体胃窦粘膜蛋白-18的重组蛋白在制备治疗肿瘤药物中的应用，属于生物工程领域。
背景技术：
胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤，严重危害人群健康。其发病率和致死率仅列于肺癌之后，位居癌症死因的次位。胃癌的形成是一个多步骤的复杂过程，与肿瘤细胞的生物学特性、机体的免疫状况以及肿瘤微环境都有着不可分割的重要关系，分泌蛋白在其中起到了至关重要的作用。·
目前，手术切除是胃癌的主要治疗方法。对于晚期不能手术切除等患者，化疗是主要的治疗方法。但是化疗是毒性治疗，在杀死癌细胞的同时正常细胞也不能幸免。因而，肿瘤的靶向治疗应运而生。肿瘤分子靶向治疗是针对可能导致细胞癌变的环节，从分子水平来阻止这种恶性生物学行为，从而抑制肿瘤细胞的生长，甚至使其完成消退的一种全新的生物治疗模式。近几年来，新型分子靶向药物先后投放市场，在临床实践中取得了显著的疗效，从而把癌症的治疗推向了一个前所未有的新阶段。目前治疗胃癌的主要祀向药有西妥昔单抗(Etuximab, Erbitux)、曲妥珠单抗(Trastuzumab,Herccptin),吉非替尼(Gefitnib, Iressa)。这些祀向药物有的是作用于细胞表面受体胞外区的抗体，通过阻滞配体与靶受体的结合，抑制生长因子激活细胞有丝分裂信号的下传；有的是作用于受体胞内区的小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，通过抑制磷酸化反应阻断向下游传导的增殖信号，从而抑制肿瘤细胞的增生。但是，这些靶向化学药品的缺点是十分明显的。其一，迄今为止，尚未见哪一种靶向药物具有肿瘤治疗的特异性，尤其是胃癌的临床治疗存在着用药剂量过大的问题。其二，现有的靶向药物缺乏对肿瘤细胞特异受体或通路的选择性作用，对正常细胞的受体或通路也有一定的影响。因此，寻找生物体内内源性的功能调节分子是肿瘤治疗药物研发的重要领域。层粘连蛋白受体(Laminin receptor, LR)属于非整合素家族，广泛存在于许多细胞表面。层粘连蛋白(Laminin，LN)是LR的主要配体，LR —般识别LN分子中的糖链。LN是细胞外基质中的一个重要的糖蛋白，正常生理功能是使细胞粘着于基底膜上；在肿瘤组织中LR参与了肿瘤细胞的粘附和转移。LR是由37kDa的前体通过翻译后加工，经过酰基化后，依靠分子内疏水作用形成同聚或异二聚体，才转变为成熟的LR，但具体过程不详(Buto S, Tagliabue E, Ardini E, et al. Formation of the 67-kDa lamininreceptor by acylation of the precursor. Journal of cellular biochemistry 1998 ；69(3) :244-51.) 0 LR在细胞分化过程中表达下降，而细胞因子及炎症因子剌激则会促进它的表达，但是两种具有抗肿瘤活性的细胞因子TNFa和IFNy却可以降低它的表达。LR表达水平与肿瘤转移正相关(al-Saleh W，Delvenne P，van den Brule FA,Menard S，Boniver J，Castronovo V. Expression of the 67 KD laminin receptor inhuman cervical preneoplastic and neoplastic squamous epithelial lesions animmunohistochemical study. The Journal of pathology 1997 ；181 (3) :287-93.)。然而，LR的生物功能是多样的，其配体并不仅限于LN —种。LR既可以与40S核糖体亚基相结合，也能有效地与细胞膜基质蛋白结合，进一步促进整合素的信号传导功能。因此，发掘LR的配体是研究LR功能和肿瘤相关性的重要方向。胃窦粘膜蛋白-18(Antrum mucosal protein, AMP-18),又被称为 CA11、Foveolin、Gastrokine-I (GKNl),是一个新近发现的由胃腺体上皮细胞合成的自分泌蛋白质，分子量约为18kDa。AMP-18基因全长6407个碱基对，mRNA长750个碱基，编码有185个氨基酸组成的蛋白质，N端有一个20个氨基酸构成的信号肽序列。AMP-18的表达具有高度的组织特异性，专一地表达于胃粘膜，在人体其他组织中没有或极低表达(Shiozaki K, Nakamori S, Tsujie M, et al. , Human stomach-specific gene, AMP-18,is down-regulated in gastric cancer.Int J Oncol 2001,19(4) :701-7)。 AMP-18的缺失与胃癌的发生和发展有密切关系，AMP-18在肿瘤细胞或肿瘤组织中表达下调或缺失，而在正常组织中呈高表达(OrientalKA, McGregorF, ButlerS, et al. Gastrokine Iis abundantly and specifically expressed in superficial gastric epithelium, down-regulated in gastric carcinoma, and shows high evolutionary conservation.The Journal of pathology 2004 ；203 (3) :789-97 ；Yoshikawa Y, Mukai H, Hino F, AsadaK, Kato I.Isolation of two novel genes, down-regulated in gastric cancer. JpnJ Cancer Res 2000 ；91(5) :459-63 ；HeQY, Cheung YH, Leung SY, Yuen ST, Chu KM, ChiuJF. Diverse proteomic alterations in gastric adenocarcinoma. Proteomics 2004 ；4(10) :3276-87)。胃幽门螺旋杆菌感染是导致胃癌的重要原因之一，在幽门螺旋杆菌感染的组织中 AMP-18 的表达明显降低(Nardone G, Martin G, Rocco A, et al. Molecularexpression of Gastrokine I in normal mucosa and in Helicobacter pylori—relatedpreneoplastic and neoplastic gastric lesions. Cancer biology & therapy 2008 ；7(12) :1890-5)。综上所述，AMP-18对保持胃细胞的正常状态有重要意义。可以推测，它是通过正常胃组织分泌到周围环境中然后作用于其受体而起作用的。我们在研究中通过检测AMP-18转染的细胞的培养基，发现AMP-18确实可以分泌到细胞外(图2A)，是一个分泌蛋白。而且，当在培养基中加入外源的AMP-18蛋白仅5分钟后，用免疫荧光的方法就可以检测到AMP-18可以定位于胃组织来源的BGC-823细胞膜，而不能定位于非胃癌来源的Hela细胞膜上(图2B)，说明在胃组织来源的BGC-823细胞膜上有AMP-18的受体。通过蓝色非变性电泳(BN PAGE)和质谱技术鉴定,我们发现了层粘连蛋白受体(Laminin receptor, LR)与AMP-18在同一膜复合体中，可能为AMP-18的受体。在正常胃组织中，细胞体内的AMP-18可能通过激活其受体LR，使细胞维持正常状态。但在胃癌组织中，由于癌细胞不表达或低表达AMP-18，使其所处的微环境中缺乏足够浓度的自分泌AMP-18，这样癌变细胞膜上的LR受体没有得到相应的激活，就无法维持正常的细胞功能。如果在胃癌细胞的微环境中提供外源的AMP-18蛋白，就有可能通过其受体LR及下游相关通路的活化，调节细胞的功能，抑制胃癌细胞的生长。所以，AMP-18有可能成为潜在的治疗胃癌的药物之一，LR有可能成为潜在的治疗癌症的靶标之一。
发明内容
本发明的第一个目的是提供AMP-18在制备治疗肿瘤药物中的应用。本发明的第二个目的是提供LR作为靶标在制备治疗肿瘤药物中的应用。为了实现上述目的，本发明思路和具体技术方案为利用原核表达体系克隆表达重组AMP-18蛋白，将其加入细胞培养基中，应用MTT (检测细胞生存生长)、流式细胞仪检测细胞周期等方法检测AMP-18对胃癌细胞的生长行为的影响。利用胃癌细胞系BGC-823诱导的裸鼠肿瘤模型，将重组蛋白AMP-18注射在肿瘤旁，观察肿瘤的生长和恶性程度，以确定AMP-18在活体内的作用。采用免疫共沉淀，LR抗体阻断免疫荧光实验验证LR是否为AMP-18的受体。采用LR沉默方法观察LR的缺失对AMP-18抑制胃癌细胞系BGC-823增殖的影响。具体地，本发明涉及以下几个方面I)本发明涉及LR的一个配体AMP-18蛋白，其具有序列表中SEQ ID No. I所示的
氨基酸序列。2)本发明涉及LR的一个配体AMP-18蛋白，其通过活化受体LR抑制肿瘤细胞的增殖，从而用于靶向癌症治疗。3)用本发明所述序列构建入表达载体转化宿主制备的AMP-18及其同系物，以及用本领域以及方法纯化得到的天然AMP-18，或者是从已知氨基酸序列制备AMP-18及其同系物，都可以用到抗癌的靶向治疗方法中。4)本发明所述的AMP-18的抑癌作用是通过活化受体LR进行的。任何与AMP-18具有对LR同样的活化作用的蛋白、多肽或其他物质，都可以用到抗癌的靶向治疗方法中。5)本发明涉及一种治疗方案，该方法通过向哺乳动物施用治疗有效量的含AMP-18的组合物治疗癌症，其中所述的组合物是上述第三项和第四项中的同系物和一种或多种药学上可接受的载体或赋型剂组成。6)本发明涉及一种治疗方案，该方法施用的治疗有效量的AMP-18的组合物是通过活化LR而起到治疗胃癌的目的，该方法也可以应用到带有LR的其他组织来源的癌症。7)本发明涉及的受:体LR,其具有序列表中SEQ ID No. 3所不的氣基酸序列。本发明的优点及有益效果(I)本发明用AMP-18制备抗肿瘤药物，具有很好的抑瘤作用。(2)本发明中AMP-18药物的作用靶标是LR，对于表达LR的肿瘤具有很好的抑瘤作用。
图I显示的是纯化的重组蛋白AMP-18和将宿主细胞通过同样流程得到的对照溶液的蛋白质电泳图像。M :分子量标记；1 AMP-18 ；2 :对照溶液。图2显示的是AMP-18为分泌蛋白并且AMP-18能结合于胃癌细胞来源的BGC-823细胞膜上。图2A是免疫印迹检测转染AMP-18细胞上清和细胞裂解液。EV和AMP-18分别表示空载体组和含AMP-18的载体转染组。图2B是外源AMP-18分别与BGC-823和Hela细胞共培养的免疫荧光图。
图3显示的是LR是AMP-18的受体。图3A是免疫共沉淀法验证AMP-18与LR的相互作用。图3B是免疫荧光法证明AMP-18和LR在BGC-823细胞膜上共定位。图3C是抗体阻断联合免疫荧光实验显示LR抗体阻断AMP-18定位于细胞膜上。图4显示的是外源性AMP-18对BGC-823细胞生长的抑制作用。图4A是用AMP-18重组蛋白或对照溶液处理BGC-823细胞，然后用MTT方法检测细胞生长曲线以及IC50计算；图4B是流式细胞法分别检测AMP-18和对照溶液对细胞周期的影响。图5显示的是外源性AMP-18在体内对于肿瘤细胞生长的抑制作用。图5A和图5B是AMP-18或对照溶液处理后肿瘤形态和大小的改变；图5C是肿瘤组织经AMP-18处理后HE染色。图6显示的是MTT法检测LR在AMP-18抑制细胞增殖过程的作用。图6AAMP-18对LR层面的BGC-823细胞的作用。上图所示LR(-)和EV是分别带有LR的RNAi载体和空载体转染的细胞。图6B是AMP-18对细胞膜上没有LR的肿瘤细胞HeLa的作用。上图为膜蛋白的免疫印迹图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明做进一步说明，以使本领域技术人员可以更清楚地得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。实施例I AMP-18重组蛋白的制备以正常胃组织cDNA为模板，根据AMP-18成熟肽的基因序列(SEQ ID No. 2)设计特异引物，上下游引物5’端分别引入BamHI和SalI酶切位点上游引物5’ -TGAAGGATCCAACTATAATATCAACGTC-3’ ；下游引物5’ -AAATGTCGACGTTCTCCACCGTGTCTCC-3’。PCR 扩增出AMP-18成熟肽序列的编码基因，经胶回收后进行BamHI和SalI双酶切。酶切片段经双胶回收后与以经过BamHI/Sall双酶切的载体pQE30a 16°C连接过夜，化学转化感受态细胞JMlOQ0挑单克隆提取质粒进行双酶切验证，阳性克隆进行测序，验证序列无误。接种培养测序正确的阳性菌至0D600为O. 8左右，加入lmmol/L IPTG诱导4小时。诱导后的菌体经超声并离心，上清用Ni-NAT亲和层析柱(GE公司)进行纯化，用含20mM和50mM咪唑的溶液洗柱后，用含300mM咪唑洗脱AMP-18蛋白，SDS-PAGE电泳(图I)检测蛋白质的纯度，并切取条带进行MALDI-T0F/T0F鉴定。用Bradford法定量。图2显示纯化后的重组蛋白为单一条带，纯度很高。质谱鉴定结果也证实表达产物为 AMP-18。实施例2 AMP-18的自分泌和膜定位一、免疫印迹检测AMP-18在细胞和培养基中的表达将克隆在载体pEGFP-Nl (Invitrogen公司)上的真核表达质粒EGFP-AMP-18及其空载体 EV 用 Lipofectamin 2000 的方法(Invitrogen 公司)转染至 BGC-823 细胞,37。。、5% CO2培养24hrs后收集细胞及培养基。培养基经超滤管(Millipore公司)离心浓缩50倍。利用免疫印迹法检测AMP-18蛋白的信号。结果如图2A所示，在EGFP-AMP-18转染的细胞及培养基中均可检测到AMP-18的信号，而EV转染的细胞及培养基中均检测不到AMP-18的信号。这说明AMP-18蛋白质可以被细胞分泌。
二、免疫荧光实验定位外源AMP-18将实施例I中表达的外源AMP-18与BGC-823细胞或Hela细胞培养5min后，用含3. 7%甲醛的PBS固定。PBS漂洗后，用含O. 2% TritonX-IOO的PBS孵育打孔5min。PBS漂洗后，用I % BSA封闭lhr，将细胞与I : 100稀释的AMP-18多抗(北京华大蛋白质研发中心有限公司)孵育2hrs。用含O. 05% TritonX-IOO的PBS漂洗后，用绿色FITC 二抗(中杉金桥生物技术有限公司)与细胞孵育，用含O. 05% TritonX-IOO的PBS再次漂洗，用O. 25 μ g/ml DAPI (碧云天公司)染核，PBS漂洗后封片。用Confocal显微镜来观察AMP-18的定位情况。结果如图2B所示，AMP-18只结合于BGC-823细胞膜上，而在其它的亚细胞器上并未检测到该蛋白的信号。用同样的方法处理HeLa细胞系时，并没有在其细胞膜或其它亚细胞器检测到AMP-18的信号。这些结果说明了 BGC-823细胞膜上有AMP-18的受体，而HeLa细胞膜上没有该蛋白的受体。
实施例3 LR是AMP-18的作用受体一、免疫共沉淀法验证AMP-18与LR的相互作用用实施例I中制备的重组AMP-18或对照溶液处理BGC-823细胞5min后提取细胞膜蛋白。收获约5 X IO7细胞，用PBS漂洗2次后用O. IXPBS在4°C孵育5min。收集细胞并在液氮和37°C水浴中反复冻融5次，每次5min。将细胞4°C 35000g离心30min，取上清4°C 150000g离心2hrs，沉淀即为细胞膜组分，用裂解液(50mM Hepes-HCl (pH 7. 4) U50mMNaClU % NP40、10%甘油、ImM EDTA以及I %蛋白酶抑制剂cocktail)裂解，冰浴30min，4°C、12, OOOg离心30min,上清转移至新的eppendorf管中。定量后,取3mg的蛋白质用裂解液稀释至Iml,加入40 μ I预先用裂解液平衡好的Protein A Sepharose柱料,4°C孵育2hrs, IOOOg离心5min后，弃沉淀,上清Iml转至新的eppendorf管中；将预处理过的蛋白质样品平均分成两份，加入2μ g AMP-18抗体，4°C孵育过夜；分别向两份样品中加入40 μ I用裂解液平衡过的Protein A Sepharose柱料,继续在4°C孵育lh, IOOOg离心5min ;沉淀用Iml裂解液洗漆,颠倒混勻后IOOOg离心5min,弃上清；重复步骤5三次，IOOOg离心5min后，尽量吸走上清液；用Glycine (pH < 3. 0) 50ml洗脱柱料上的蛋白，10 μ I样品与等体积
2X loading buffer 混合后，95°C煮样品 IOmin, 12，OOOg 离心 2min,取上清用 SDS-PAGE 分离免疫复合物，然后用免疫印迹的方法分别用AMP-18抗体和LR抗体(北京华大蛋白质研发中心有限公司)来鉴定结合蛋白。结果如图3A所示，AMP-18的抗体所捕获的AMP-18蛋白复合物中含有AMP-18和LR，表明AMP-18和LR相互作用形成复合物。二、免疫荧光实验验证AMP-18与LR共定位用实施例I中制备的重组AMP-18与用无血清培养基培养的BGC-823孵育5min，将细胞固定，打孔，封闭，室温孵育不同宿主来源的AMP-18(鼠源)和LR(兔源)的抗体2hrs，漂洗后，用FITC标记的鼠二抗(绿色)和TRITC标记的兔二抗(红色，中杉金桥生物技术有限公司)孵育Ihr后漂洗染核，在激光扫描共聚焦显微镜下观察。结果如图3B所示，AMP-18 (绿色)和LR(红色)在空间上是共定位的。三、抗体阻断联合免疫荧光实验当BGC-823细胞密度为80 %时，用生理盐水洗涤细胞，并用无血清培养基培养24hrs。将LR抗体(I 00)与BGC-823孵育Ihr后，用培养基漂洗2次。再将该细胞与重组AMP-18孵育5min，行免疫荧光实验。在荧光显微镜下观测AMP-18在BGC-823细胞膜上的分布状态。结果如图3D所示，当LR抗体加入后，AMP-18与BGC-823细胞膜的结合就被抑制，揭示AMP-18和LR抗体实际上竞争同一结合位点，证明LR是AMP-18的受体。实施例4重组AMP-18蛋白抑制肿瘤细胞增殖体外采用MTT实验、流式细胞仪检测细胞周期实验，体内采用裸鼠研究重组AMP-18对肿瘤细胞增殖的影响。一、MTT 实验MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细·胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。具体步骤如下I.细胞悬液制备取生长至接近汇合、状态良好的细胞，经Iml O. 25%的胰蛋白酶(含O. 02% EDTA的PBS配制，Tripsin粉末购自invitrogen)消化、制备细胞悬液,计数细胞；2.接种向96孔板中每孔接种100 μ I细胞悬液共3000-5000个细胞，置于37°C，5% C02的细胞培养箱中培养；3.处理将细胞用生理盐水洗涤两次，用无血清的培养基培养24hrs后，根据实验需要将不同浓度的重组AMP-18蛋白和相应的对照溶液处理细胞；4.检测每24hrs作为一个时间点，共检测三至四次，每个时间点取3个平行孔。在检测时，分别向3个平行孔中加入10μ I MTT试剂(含O. 5% 3-(4，5_二甲基噻唑-2)-2，5- 二苯基四氮唑溴盐(碧云天公司)的PBS溶液)，混匀并放入37°C ,5% C02培养箱中继续培养4h后，弃含MTT的培养液，放回细胞培养箱中保存。待最后一个时间点样品与MTT反应结束后，向每个孔中加入100 μ I DMSO(北京化工厂)；将96孔板置于室温下摇床上IOmin后，用酶标仪读取570nm的光吸收值(以630nm作为参考波长)。5.绘制生长曲线取每个时间点(0h、24hrs、48hrs、72hrs)作为横坐标,其570nm光吸收值的平均数与Oh时平均数的相对值作为纵坐标，绘制细胞生长曲线。结果如图4A所示，将AMP-18稀释成不同浓度加入细胞培养基中，72hrs后进行MTT检测。通过计算，AMP-18的IC50为O. 995 μ g/ml。将I μ g/ml工作浓度的重组AMP-18蛋白或相同体积的对照溶液与BGC-823细胞孵育至72h，AMP-18处理可显著抑制BGC-823的增殖。二、流式细胞仪检测细胞周期将BGC-823细胞以80%的密度种于60mm的培养皿中培养过夜。将细胞用生理盐水洗涤两次，并用无血清培养基培养24hrs。用I μ g/ml的AMP-18蛋白和相同体积的对照溶液分别培养细胞48hrs。细胞经胰蛋白酶消化后，用PBS洗涤两次，细胞计数。取300 μ IPBS重悬细胞，向细胞中逐滴加入700 μ I预冷的无水乙醇，4°C避光固定过夜。800g离心lOmin，去上清，PBS洗两遍。重悬细胞于50 μ I含100U/ml RNA酶的PBS中，37°C 30min避光。加溴化炳盯(pi)染色液至50 μ g/ml 30min避光。流式细胞仪分析。结果如图4B所示，我们得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1 %，5%及G2/M%。对照组中，G0/G1期占49. 7%、S期占40. 2%、G2/M期占10. 1% ;当细胞经过AMP-18处理后，G0/G1期比例明显上升(65.3% )、S期显著下降(22. 1% )、G2/M期基本不变(12. 6% )，说明AMP-18可以引起细胞周期G0/G1期的阻滞现象。三、裸鼠实验每50万个BGC-823细胞皮下注射入4_6周龄balb/c裸鼠(北京肿瘤医院)两后肢，共5只裸鼠。一周后，每个肿瘤约2*2mm。将重组AMP-18以IOOul lug/ml隔天局部注射于裸鼠左侧肿瘤，6次为一疗程，右侧肿瘤注射对照溶液为实验对照组。17天后取肿瘤组织进行测量，结果如图4A所示，AMP-18治疗组肿瘤(体积和重量)明显小于对照组。肿瘤组织经福尔马林固定后，切片，HE染色，结果如图4B所示，与对照处理组相比，经AMP-18处理后，肿瘤细胞胞浆明显可见，核质比变小，核仁不可见，即细胞恶性程度降低，增殖指数下 降。上述体外和体内实验显示，重组AMP-18具有有效的抑制肿瘤的作用。以其作为治疗肿瘤药物的有效成分结合药剂学上公知的载体或赋型剂，根据生物药剂的常规制备方法即可制备成治疗肿瘤的药物。实施例5 AMP-18是通过LR而抑制肿瘤细胞增殖的
一、MTT法检测AMP-18对LR沉默细胞增殖的影响。用实施例2中的MTT法检测用RNAi沉默LR表达的细胞在AMP-18处理后的生长情况，以检验LR是否参与AMP-18抑制肿瘤细胞增殖的过程。结果如图6A所示，用对照溶液处理的EV (RNAi空载体)和LR(_)细胞的增长速率基本相同；用AMP-18处理EV时，可以显著抑制该细胞的增殖，而AMP-18并没有改变LR(-)细胞的增殖速率。结果提示，在LR表达缺失的细胞系中，AMP-18几乎失去了对细胞增殖的抑制作用，即AMP-18确实是通过LR受体发挥其抑制肿瘤细胞增殖的作用的，LR就是AMP-18的受体。二、MTT法检测AMP-18对细胞膜上没有LR细胞的增殖的影响。用实施例2中的MTT法检测LR不表达的Hela细胞在AMP-18处理后的生产情况，以检验LR是否参与AMP-18抑制肿瘤细胞增殖的过程。结果如图6B所示，Hela细胞膜上没有LR的表达。当将I μ g/ml工作浓度的重组AMP-18蛋白或相同体积的对照溶液与Hela细胞孵育至72h，AMP-18处理组与对照组的生长曲线类似，Hela细胞的生长不受AMP-18的抑制。
权利要求
1.ー种蛋白质，其特征在于，其具有序列表中SEQ ID No. I所示氨基酸序列。
2.根据权利要求I所述的蛋白质，其特征在于，其是由SEQID No. I所示氨基酸序列经氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸衍生序列。
3.权利要求I所述的蛋白质，其特征在于，其是具有序列表中SEQID No.3所示氨基酸序列的层粘连蛋白受体(LR)的ー种配体。
4.权利要求I所述的蛋白质，其具有抑制肿瘤增长的作用。
5.权利要求4所述的抑制肿瘤增长的作用是通过其受体LR而进行的。
6.一种重组蛋白质，其特征在于，其具有序列表中SEQ ID No. I所示氨基酸序列。
7.权利要求6所述的重组蛋白，其是在大肠杆菌中表达的可溶蛋白。
8.权利要求6所述的重组蛋白，其在制备治疗肿瘤药物中的应用。
9.权利要求8所述的制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述药物含有权利要求2所述的氨基酸序列。
10.权利要求8所述的制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述药物是具有与权利要求I和权利要求6同样的对LR起的活化作用的蛋白、多肽或其他物质。
11.权利要求8-10所述的药物，其特征是和一种或多种药学上可接受的载体或赋型剂组成组合物。
12.权利要求8-10所述的药物，其作用靶标是LR。
13.权利要求8-10所述的药物，其适应的对象为膜上帯有LR的的肿瘤。
全文摘要
本发明提供了一种层粘连蛋白受体(LR)的配体胃窦粘膜蛋白-18，其具有序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。重组的该配体蛋白能够与胃粘膜上皮细胞表面的LR相结合，抑制胃癌肿瘤细胞的生长，可用于制备治疗肿瘤的药物。
文档编号A61P35/00GK102827266SQ20111016003
公开日2012年12月19日 申请日期2011年6月14日 优先权日2011年6月14日
发明者不公告发明人 申请人:北京华大蛋白质研发中心有限公司