专利名称：辅助放射线治疗的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于辅助放射线治疗的药物组合物。
背景技术：
癌症是目前我国十大死因之首，是国内医疗上的重大问题，医界都在积极地发展治疗方式或发现新药来克制癌症。其中，放射治疗成为最佳的非侵入性癌症治疗方法，对器官组织不会造成外科手术的破坏，且本身具有一定的治疗效果，不用考虑测试药物产生不可预知的作用；因此，放射治疗可以成功地应用在治疗不同种类的癌症，放射治疗可单独使用，或配合手术、化学治疗使用，减少癌症的局复发或远处转移。然而在放射治疗进行时，不单只有癌细胞受损伤及死亡，照射范围内的正常细胞亦会受影响而出现副作用；结合化学治疗时，所引起的副作用可能会更大。放射治疗最常见的副作用就是恶心、呕吐、疲倦、皮肤反应、白血球或血小板数目下降、食欲不振，这些症状在治疗身体任何部位都会发生。另外，局部反应可能的副作用包括头颈部放疗后引起口干、口腔黏膜发炎、急性中耳炎；胸腔放射治疗后引起肺纤维化、肺炎；腹部和骨盆腔放射治疗后引起的腹泻、大小肠的放射性肠炎和膀胱炎，上述这些反应甚至可能造成功能丧失的慢性副作用。放疗的副作用常导致病人生理上的极度不适，大大的降低生活质量，致使有些换纸无法完成疗程而选择放弃治疗。因此寻求各种可能增加疗效与减轻副作用的辅助性疗法为目前放射医学的当务之急；其中，健康食品应用在癌症放射治疗过程中，藉以减缓病人的不适，并提高治愈机会，成为医学发展的一种新趋势。樟芝，学名为Antrodia camphorate (Zang & Su) S. -H ffu, Ryvarden & T. T. Chang,又称为Antrodia cinnamomea,属于台湾国宝级的珍贵药用真菌,经常被应用于养生保健的用途，一般民间对于樟芝的称呼有樟燕、牛樟燕、牛樟芝或红樟芝，民间尚有樟燕、樟郝、樟内菇、牛樟芝、红樟、红樟芝等称呼，是台湾特有的菇菌类，全世界只生长在台湾山区海拔450-1500米之间的牛樟树干腐朽的心材内壁或枯死倒伏的牛樟木材阴暗潮湿的表面，非常的珍贵稀少，因此又被称为台湾森林中的宝石。樟芝为台湾特有药用菇，传统民俗疗法为保肝治癌的高效药方。传统上通过经验得知有关樟芝成份中含有的多糖体可活化细胞、改善体质，增强人体内的免疫调节，其中另一主要有效成份——三萜类化合物，应用于抗癌或抗发炎及具有保肝功能的铲平，亦已在市场行销中广为认可，因而樟芝有药用真菌之王的美
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发明内容
本发明的目的是提供一种用于辅助放射线治疗的药物组合物，所述药物组合物包含有效剂量的樟芝或樟芝萃取物，所述药物组合物具有抑制放射线引起的正常细胞死亡以及加速放射线治疗后的肿瘤细胞死亡的效果。本发明所述放射线包含业界熟知的惯用光射线光源，例如钴60 ;所述放射线照射强度优选5Gy/分钟，照射剂量为10-40Gy，优选20Gy。
本发明所述的正常细胞为排出肿瘤细胞的一切体细胞，例如免疫细胞。肿瘤细胞包括但不局限于大肠癌细胞或乳癌细胞。更进一步地，本发明所述樟芝或其萃取物具有抑制免疫细胞的IL-12 a、IL_4或TREM-I基因表现，以及促进肿瘤细胞的IL-I β、iNOS或TNF基因表现的作用。本发明所述樟芝萃取物，包括但不限于樟芝菌丝体萃取物、樟芝子实体萃取物、以及樟芝发酵液。本发明所述药物组合物，进一步包含药物上可接受的佐剂、载体或赋形剂。适当的药物载体可包含惰性成分，所述惰性成分不会与本发明的化合物发生实质反应。用于口服施药的适当药物载体包含例如无菌水、生理食盐水、抑菌食盐水(包含约O. 9% mg/ml苯基醇的食盐水)、磷酸缓冲液食盐水、汉克溶液、林格式乳糖液及其它相似载体。用于口服药物，可依照现有技术，将其制作成粉末状、颗粒状、锭状、液状、胶状或膏状。本发明的药物 组合物可以食品、饮品、药品、试剂或营养补充品的形式提供，或是藉由静脉、肌肉、上皮、腹腔、吸入、口含、口服、经皮等途径施用。本发明所述的有效剂量，指该化合物剂量在提供给一对象后能获得有益的效果；或者，该化合物的剂量能在体内或体外获得预期的活性。以本发明为例，抑制正常细胞死亡的有效樟芝或樟芝萃取物的浓度为50 μ g/ml至200 μ g/ml,较佳地为100 μ g/ml至150 μ g/ml ;加速肿瘤细胞死亡的有效樟芝或樟芝萃取物的浓度为50 μ g/ml至200 μ g/ml。本发明的辅助放射线治疗的药物组合物，在其对于免疫细胞的放射线保护力试验中，以100 μ g/ml及150 μ g/ml樟芝粉末共同培养24与48小时后，均有减缓放射线对细胞伤害的效果，抑制幅度约为37-56%。而樟芝粉末作用时间的长短对保护效应的影响，则可由樟芝粉末作用48小时后的50 μ g/ml组才出现免疫细胞放射线抗性得到证实。至于在肿瘤细胞抑制效果方面，结果显示樟芝粉末并不影响放射线对HT-29大肠癌细胞的毒杀作用，甚至对放射线敏感性较强的BT-474细胞有增强放射线毒杀效应的协同效果。
图I为本发明试验所用樟芝粉末的制作过程示意图。图2为有效放射线剂量的示意图。图3为樟芝粉末处理24小时后,樟芝作用有效浓度的不意图。图4为樟芝粉末处理24小时后经放射线作用，樟芝作用有效浓度的示意图。图5为樟芝粉末共同培养24与48小时后的免疫细胞的不意图。图6为樟芝粉末共同培养24与48小时后的免疫细胞抑制率的不意图。图7为樟芝粉末共同培养24与48小时后的HT-29细胞数的示意图。图8为樟芝粉末共同培养24与48小时后的HT-29细胞抑制率的示意图。图9为樟芝粉末共同培养24与48小时后的BT-474细胞的示意图。图10为樟芝粉末共同培养24与48小时后的BT-474细胞抑制率的示意图。图11为樟芝粉末共同培养24小时后的免疫细胞，IL-12 a、IL-4和TREM-I基因表现倍率的关系示意图。图12为樟芝粉末共同培养48小时后的免疫细胞，IL-12 a、IL-4和TREM-I基因表现倍率的关系示意图。
图13为樟芝粉末共同培养24小时后的免疫细胞，CCL2、ILlO和IL_6基因表现倍率的关系不意图。 图14为樟芝粉末共同培养48小时后的免疫细胞，CCL2、ILlO和IL_6基因表现倍率的关系不意图。图15为樟芝粉末共同培养24小时后的免疫细胞，IL-I β、iNOS和TNF基因表现倍率的关系示意图。图16为樟芝粉末共同培养48小时后的免疫细胞，IL-I β、iNOS和TNF基因表现
倍率意图。图17为樟芝粉末共同培养24小时后的HT-29细胞，IL-I β、iNOS和TNF基因表现倍率不意图。图18为樟芝粉末共同培养48小时后的HT-29细胞，IL-I β、iNOS和TNF基因表现倍率不意图。图19为樟芝粉末共同培养24小时后的BT-474细胞，IL-HiNOS和TNF基因表现倍率不意图。图20为樟芝粉末共同培养48小时后的BT-474细胞，IL-I β、iN0S和TNF基因表现倍率不意图。图21为樟芝粉末共同培养48小时后，不同细胞对辐射照射作用诱发粒线体膜电位变化(内质性细胞凋亡路径)的示意图。其中，图2、3 和 4 中，* ;# = P < O. 05 ;** ；## = p < O. 01 ;*** ；### = p < O. 001 ；
图 5 和 6 中，* = P < O. 05 ;** = P < O. 01 ;图 9 和 10 中，* = P < O. 05 ;图 21 显示流式细胞仪试验的结果，右下框中的数字为显著变化表现的细胞比例(% )。
具体实施例方式一、樟芝的制备樟芝经培养产生樟芝发酵浓缩液，樟芝生产过程如附图I所不。本发明米用樟芝浓缩酶冻干粉以及樟芝菌丝体所混合制成的樟芝粉末。其中有效产品所包含的活性成分包括多糖体、胺基丁酸(GABA)、类超氧化物歧化酶(SOD like)、腺苷、植物固醇等。二、小鼠的脾脏免疫细胞与肿瘤细胞的制备将小鼠处死后取脾脏，以Iml针筒及23G针头用含初生小牛血清(fetalcalfserum, FCS, Sigma)的 RPMI 1640 细胞培养基(RPMI+5% FCS, Sigma)冲出脾脏细胞。之后吸取细胞悬浮液至15ml离心管，于4°C、1800rpm离心3分钟，倒去上清液后加入红血球溶解缓冲液(RBC lysis buffer，O. 15M氯化铵+LOmM碳酸氢钾+0. ImM乙二胺四乙酸二钠)以溶解红血球，经离心后以RPMI悬浮细胞液备用。三、试验设计及分组I X IO6个脾脏免疫细胞与不同浓度樟芝共同培养24或48小时后，给予60Co —次照射20Gy放射线剂量，之后即收集细胞进行细胞计数套组(cell countingkit-8 ；CCK8 ；Dojindo Molecular Technologies, Inc. , Rockville,MD)存活率染色试验。另组经同样处理的细胞则在收集后分成两部分，分别加入TrizolRNA核酸抽取剂(TRlzol Reagent,Invitrogen)冷冻保存,并用流式细胞仪检测，以供后续RNA核酸及蛋白质的表现测定用。上述两组体外试验均分别以未处理细胞作为正常对照组，以仅用钴60照射的细胞作为阳性对照 组。另分别以大肠癌(HT-29)及乳癌(BT-474)细胞株，两种具有不同放射线敏感性的肿瘤细胞经上述相同过程处理，作为樟芝对放射线毒杀肿瘤细胞反应的参考。四、细胞存活率试验经放射线处理后的细胞于4°C、1800rpm离心5分钟，倒去上清液后，移至96孔微量分析盘(Orange Scientific, Belgium)中与分别的培养液进行培养(5X104cells/100 μ 1/well)，再加入细胞计数套组(Cell Counting Kit-8, CCK8, Dojindo,Rockville,Maryland)试剂,静置于37°C下作用4小时,在405nm波长下以酶免疫微盘分析仪(ELISA reader, Anthos Zenyth 3100, ffals, Aus)检测存活率。五、纯化细胞的mRNA 与逆转录(Reverse Transcription)将IO6细胞以磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后于4 °C、3000rpm离心5分钟，加入Trizol (GIBC0 BRL) Iml后均匀混合，静置5-10分钟，加入三氯甲烷0. 2ml后摇晃，于4°C、12000rpm离心15分钟，取上清液加入异丙醇0. 5ml后混匀，再于4°C、12000rpm离心10分钟，倒去上清液之后以75%酒精清洗RNA沉淀，完全移去上清液，以焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解RNA沉淀，以分光光度计测RNA浓度及260/280比率。取定量的样本RNA于70°C下作用5分钟，以破坏RNA的二级结构，再加入MuMLV RT buffer, 2. 5mM dNTP (BRL)，0. IMDTT(BRL),Rnasin(Promaga),MuMLV RTase,六聚物(hexamers)与焦碳酸二乙酯水配成总体积25 μ I混合液，于37 V反应60分钟后于90°C作用5分钟使酶去活化，加入175 μ I灭菌水溶解cDNA。六、实时定量反转录聚合酶连锁反应(Real-Time Quantitativereversetranscriptase polymerase cain reaction, Q-PCR)依照实验基因表现量进行校正，将样本cDNA进行不同比例稀释。取4μ I稀释的cDNA作为模板，加入1μ I IOOnM Trem-I引子(primer)及5μ I实时荧光定量PCR试剂(SYBR Green PCR Master Mix, Bio-Rad),总反应体积为 10 μ I。反应条件50°C,2min ；95°C, IOmin ;95°C，15sec ;60°C，lmin，进行45个循环，PCR产物以iQ5及时聚合酶连锁反应检测系统(iQ5 Real-Time PCRDetection System, Bio-Rad)检测，并带入标准曲线公式计算其分子数。七、流式细胞仪分析所需抗体细胞凋亡Annexin V-FITC (BD Pharmingen , San Jose, CA), PE RabbitAnti-ActiveCaspase-3 (CPP32, BD Pharmingen , San Jose, CA) JC-I 粒腺体膜电位检测套组(Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit,BD Pharmingen ,San Jose,CA)。八、流式细胞仪侦测细胞表面与细胞内蛋白试验将IO6细胞以磷酸盐缓冲液清洗后于4°C、3000rpm离心5分钟，倒去上清液，加入2. 4G2阻断性(Blocking)单株抗体100 μ 1，静置冰上作用20分钟；加入磷酸盐缓冲液清洗后离心，倒去上清液，以特殊荧光染色的单株抗体50 μ I静置冰上作用60分钟，以磷酸盐缓冲液清洗后离心，最后加入Iml磷酸盐缓冲液悬浮细胞液，再利用FACSort (流速细胞仪)测定样本中不同类型细胞的荧光强度，并以分析软件(Cell Quest TM)进行分析。胞内染色则加入 0. 5ml 细胞固定及通透液(BD Cytofix/Cytoperm , BD Pharmingen)后，于 4°C下作用30min,之后离心丢弃上清液,加入IX的细胞通透清洗液(BD Perm/Wash Buffer,BDPharmingen)清洗，之后步骤则与细胞表面染色相同。实施例I确定放射线伤害剂量与条件最优化首先将免疫细胞分别以平均剂量5Gy/min的6tlCo照射共10、20及40Gy的放射线剂量，并在之后5分钟及I小时测试其存活率。结果如图2所显示，在IOGy照射后的I小时，细胞数量有较明显的下降(P < O. 01);而20及40Gy照射后5分钟及I小时的细胞存活率则均呈现显著下降(P < O. 001)，因此在之后实验均选择20Gy为有效作用剂量。另外进行樟芝粉末作用最优化剂量筛选试验，将10、100及1000 μ g/ml樟芝作用24小时后，经放射 线照射及未照射的组别分别进行存活率观察。图3显示较高剂量100及1000 μ g/ml樟芝粉末作用即影响免疫细胞存活率(P < O. 01);然而经樟芝粉末作用再以放射线照射的免疫细胞则显示，仅100 μ g/ml樟芝粉末作用后能有效提升细胞对放射线的保护力(P < O. 01)(图4)。因此后续实验以100 μ g/ml左右为有效剂量范围。实施例2樟芝粉末减缓放射线细胞毒性的评估本发明中分别评估50、100、150及200 μ g/ml樟芝粉末作用24及48小时后，对放射线引发细胞伤害的保护性；正常细胞为阴性对照组，经放射线照射之细胞为阳性对照组。结果如图5和6所显示，脾脏免疫细胞经放射线照射后存活率均有下降，而以100及150 μ g/ml樟芝粉末共同培养24与48小时后的免疫细胞，对放射线的抗性均有明显增加。樟芝粉末作用24小时后以100 μ g/ml组的减缓放射线伤害效用最高达44% (p < O. 05);作用48小时后则更以150 μ g/ml组高达56%的放射线抗性为最佳(p < O. 01)。且作用48小时后50 μ g/ml的樟芝粉末即影响免疫细胞对放射线的抗性增加(P < O. 05)，然而200 μ g/ml组的效果反而不明显；显示其100-150μ g/ml可能为其减缓放射线伤害效用的有效范围。图7、8、9和10则显示进一步以肿瘤细胞测樟芝粉末对放射线影响的效应，图7和8显示樟芝粉末并不影响放射线对HT-29大肠癌细胞的毒杀作用，樟芝粉末作用24小时后仅50 μ g/ml组有些许上升，然并无统计上的差异，其余各组以及作用48小时的组别则均无显著变化。另外BT-474乳癌细胞的实验结果则显示，樟芝粉末非但不影响放射线对肿瘤细胞的毒杀作用，甚至增强放射线作用的效果，在作用48小时后的200μ g/ml组对放射线毒杀效应有明显的加成，加成效应高达92% (P < O. 05)(图9、10)。实施例3樟芝粉末调节放射线照射后细胞的基因表现评估本发明进一步以实时定量反转录聚合酶连锁反应(real-time PCR)分析细胞激素表现的结果，所检测的基因及其功能如下表I所列表I
Rnl8s ref gene，线粒体功能相关 GAPDH ref gene,基本代谢酶
权利要求
1.一种辅助放射线治疗的药物组合物，所述药物组合物具有抑制放射线引起的正常细胞死亡或加速放射线照射后的肿瘤细胞死亡的效果，其特征在于包含有效剂量的樟芝或樟芝萃取物。
2.如权利要求I所述的辅助放射线治疗的药物组合物，其特征在于所述樟芝或樟芝萃取物包含樟芝粉末或樟芝菌丝体。
3.如权利要求I所述的辅助放射线治疗的药物组合物，其特征在于所述放射线剂量为IOGy 至 40Gy。
4.如权利要求I所述的辅助放射线治疗的药物组合物，其特征在于所述正常细胞为免疫细胞。
5.如权利要求I所述的辅助放射线治疗的药物组合物，其特征在于所述肿瘤细胞为大肠癌细胞或乳癌细胞。
6.如权利要求I所述的辅助放射线治疗的药物组合物，其特征在于抑制正常细胞死亡的樟芝或樟芝萃取物的有效剂量为50 μ g/ml至200 μ g/ml。
7.如权利要求6所述的辅助放射线治疗的药物组合物，其特征在于抑制正常细胞死亡的樟芝或樟芝萃取物的有效剂量为100 μ g/ml至150 μ g/ml。
8.如权利要求I所述的辅助放射线治疗的药物组合物，其特征在于加速肿瘤细胞死亡的樟芝或樟芝萃取物的有效剂量为50 μ g/ml至200 μ g/ml。
全文摘要
本发明公开一种用于辅助放射线治疗的药物组合物，所述药物组合物包含有效剂量的樟芝或其萃取物。所述药物组合物具有抑制放射线引起的正常细胞死亡或加速放射线照射后的肿瘤细胞死亡的效果。
文档编号A61P35/00GK102813680SQ20111016553
公开日2012年12月12日 申请日期2011年6月20日 优先权日2011年6月7日
发明者郑柏青, 罗彩月, 黄俊智 申请人:丽丰实业股份有限公司