专利名称：阿魏酸在制备促进皮肤伤口愈合药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从禾木科植物中提取的单体物质阿魏酸的新用途，具体涉及阿魏酸在制备具有促进皮肤伤口愈合作用药物中的应用。
背景技术：
人体自身的伤口愈合能力会由于种种外界条件受到限制，如伤口面积，年龄，或病患等因素。目前，临床处理创伤的方法普遍仍停留在皮肤移植、缝合、清创、及抗感染等治疗措施，尚缺乏有效加速伤口愈合的办法和药物。皮肤伤口愈合是一个特殊的生理学过程，该过程涉及到皮肤生长和组织再生，是一个动态的，可溶调节物、血细胞、胞外基质以及薄壁细胞互相作用的过程。皮肤伤口愈合分炎症反应，新组织形成，组织重建三个过程，其基础是炎症细胞和修复细胞的一系列活动。表皮细胞的迁移能力对于伤口愈合至关重要。炎症反应过后，伤口边缘的角质细胞慢慢迁移增殖到伤口表面，形成一层保护膜。成纤维细胞开始合成分泌细胞外基质用于组织修复。如果成纤维细胞过多会导致形成过于肥厚的伤疤，而皮肤伤口不愈或愈合较慢都与皮肤的角质细胞的迁移能力有密切的关系。皮肤中行使主要修复功能的细胞有表皮细胞、 成纤维细胞、内皮细胞等。研究表明细胞表皮生长因子能够促进皮肤细胞增殖，促进伤口愈合，但是这些物质价格比较昂贵，而且由于生长因子是一种分裂原，其在体内使用是否会引发癌变也是一个值得探讨的安全问题。从植物中提取的天然有效活性成分一般副作用较小，价格适中，安全性较高，质量易于保证，具有一定的应用前景和优势。实验研究表明阿魏酸具有广泛的生物活性和药理作用，如具有抗血小板聚集，镇痛，缓解血管痉挛等作用，但对于阿魏酸在皮肤伤口愈合方面的研究和应用，目前尚未见国内外相关文献报道。因此从细胞水平和动物水平开展阿魏酸在皮肤伤口愈合方面的作用研究具有非常重要的理论意义和应用价值。本发明创新地提出了阿魏酸在制备促进皮肤伤口愈合药物中的应用。本发明在细胞水平研究发现阿魏酸能够明显促进人表皮细胞和成纤维细胞的生长，促进人表皮细胞的迁移，能明显促进小鼠皮肤的伤口愈合时间和伤口收缩效果。本发明在皮肤伤口愈合中的应用，可以作为添加剂的形式使用，可以制成具有促伤口愈合的霜剂、乳剂、软膏、气雾剂、 溶液剂、等各类剂型。
发明内容
本发明提出了阿魏酸在制备促进皮肤伤口愈合药物中的应用。其中，阿魏酸是促进皮肤伤口愈合药物中的活性成分，其含量为0. 5%-10%质量浓度。其中，所述促伤口愈合药物可以是霜剂、乳剂、软膏、气雾剂、溶液剂。本发明中的阿魏酸可以是纯品，或包含阿魏酸成分的任何组成物或混合物或复方。其中，所述阿魏酸的含量可以是起到有效作用的任何比例范围。较佳的是，本发明中阿魏酸的含量为0. 5%-10%质量浓度。
禾木科植物中提取的阿魏酸(Ferulic Acid)分子式为CltlHltlO4,分子量为194. 19， 其结构式如式(I)所示。纯化的阿魏酸(HPLC纯度>99%)，为白色结晶，易溶于乙醇。目前未见有报道公开阿魏酸具有促进皮肤伤口愈合的作用。
式(I)-本发明进行了细胞水平实验和小鼠动物实验研究，也进行了人体皮肤伤口愈合的效果评价试验，首次公开报道了阿魏酸具有明显促进皮肤伤口愈合的作用。通过细胞水平实验和小鼠动物实验研究，本发明的实验结果表明阿魏酸具有显著促进皮肤细胞生长和迁移的作用，能使皮肤伤口愈合速度明显加快，人体实验效果评价良好，本发明首次公开了阿魏酸具有促进皮肤伤口愈合的作用效果。本发明应用中所述的阿魏酸能促皮肤伤口愈合可以作为任何添加剂的形式使用。 含有本发明活性成分阿魏酸的皮肤外用组合物或混合物或复方，可以制成具有促皮肤伤口愈合的霜剂、乳剂、软膏、气雾剂、溶液剂等各类使用剂型。
图1是阿魏酸对人表皮细胞增殖的影响示意图。图2是阿魏酸对人表皮细胞迁移的影响示意图。图3是阿魏酸对人皮肤成纤维细胞增殖的影响示意图。图4是阿魏酸对人皮肤成纤维细胞迁移的影响示意图。图5是阿魏酸对动物伤口愈合的实际效果示意图。
具体实施例方式结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实验材料与方法 1、实验材料
阿魏酸，纯度> 90% (购自郑州荔诺生物科技有限公司)，IOmg溶解于500微升DMSO溶液中，配成浓度为20mg/ml的原液，置于4°C保存。细胞实验使用时用DMEM培养液将原液稀释成所需浓度即可。2、细胞培养
人皮肤角质形成细胞(HaCaT细胞，购自美国ATCC公司)，用含10%小牛血清的1640培养基培养。人皮肤成纤维细胞(2522细胞，购自美国ATCC公司)，用含10%小牛血清的DMEM 培养基培养。培养条件37 °C，5%C02。
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3、动物实验
实验小鼠30只(C57BL/6小鼠购自上海斯莱克动物有限公司，SPF级)，体重25- 克， 实验前适应性预饲养一周，鼠房12小时光照/12小时黑暗间隔，动物给予标准饲料和水，每天由实验人员观察记录。将小鼠随机分为5组，每组6只A 空白对照组；B 阳性药物积雪苷霜软膏对照组(上海现代制药股份有限公司生产)；C 0. 5%阿魏酸实验组；D 1%阿魏酸实验组；E: 10%阿魏酸实验组。小鼠经剃发器剔去背部毛发后再用脱毛膏背部脱毛，随后用自来水清洗，隔M小时后做皮肤切口。腹腔注射戊巴比妥麻醉实验小鼠，将其背部朝上平整躺卧于工作台上，避免背部皮肤局部过度拉伸或皱缩。以小鼠无法舔舐碰触的原则，在其背部用0.8cm直径打孔器切除一圆形全层皮肤，形成机械损伤动物模型。创面自然止血，并于固定的时间点对切口敷药。空白对照组每天在伤口处凃30%甘油IOOul —次，阳性药物对照组按说明书要求直接在伤口处涂抹药物，阿魏酸实验组每天在伤口处凃30%甘油中含0. 5%、1%、10%阿魏酸的溶剂lOOul，每次溶剂要覆盖整个伤口面积，连续给药6天。每隔两天测量记录伤口尺寸大小并拍照。测量每只小鼠的伤口直径，按照平行脊椎、垂直脊椎、从左到右和从右到左，测量四次伤口大小数据，取其平均值作为该鼠伤口直径的数据。4、数据统计分析
实验数据以平均数加减标准差T 士S表示，组间差异比较采用t检验。实施例1、阿魏酸对人表皮细胞增殖的影响
96孔板中培养的HaCaT细胞，用不同浓度的阿魏酸(1 μ g/ml、10 μ g/ml、50 μ g/ml、 100μ g/ml、200l·! g/ml)处理HaCaT细胞24h后，采用MTS法检测细胞增殖活性，实验结果表明当阿魏酸作用浓度为50 μ g/ml以下时，对HaCaT细胞有明显的增殖作用，且呈剂量依赖关系，对角质细胞的生长具有明显的促进作用。结果如图1所示。其中，药物组与对照组比氺P < 0. 05,氺氺P < 0. 01。实施例2、阿魏酸对人表皮细胞迁移的影响
将HaCaT细胞接种到12孔板上，培养约M小时后待细胞长满培养皿底部时用200 μ 1 枪头沿着垂直孔径在底部细胞层上划开一道划痕，吸弃原培养液后再加入PBS每孔500 μ 1 冲洗漂浮的细胞碎片两次。实验分为两组，一组加培养基，另一组加入含50 μ g/ml阿魏酸的培养基。在显微镜下拍摄初始状态和1 后细胞的生长状况。实验结果如图2 (a)、图2 (b)、图2 (C)、图2 (d)所示，其中，图2 (a)、图2 (c) 是对照组，图2 (b)、图2 (d)是阿魏酸组50 μ g/ml浓度。图2(a)、图2 (b)是两组细胞划线后0小时的情况，图2 (c)、图2 (d)是两组细胞12小时后的迁移情况。阿魏酸(50yg/ ml)作用人表皮细胞12小时后，阿魏酸组细胞迁移的速度明显加快，促细胞伤口愈合的能力与对照组比较有明显的差异，表明阿魏酸对人表皮细胞的迁移有明显的促进作用。实施例3、阿魏酸对人皮肤成纤维细胞增殖的影响
将人皮肤成纤维细胞2522接种到96孔板中培养，用不同浓度的阿魏酸(1 μ g/ml、 10 μ g/ml、50 μ g/ml、100 μ g/ml、200 μ g/ml)处理 2522 细胞 24h 后，采用 MTS 法检测细胞增殖活性，实验结果表明当阿魏酸作用浓度为50 μ g/ml以下时，对2522细胞有明显的增殖作用，且呈剂量依赖关系，对人皮肤成纤维细胞的生长具有明显的促进作用，说明阿魏酸对促进皮肤的真皮层伤口愈合有一定的效果。见图3。其中，药物组与对照组比较，*P< 0.05，**P < 0. 01。实施例4、阿魏酸对人皮肤成纤维细胞迁移的影响
将人皮肤成纤维细胞2522接种到12孔板上，培养约48小时后待细胞长满培养皿底部时用200 μ 1枪头沿着水平孔径在底部细胞层上划开一道划痕，吸弃原培养液后再加入 PBS每孔500 μ 1冲洗漂浮的细胞碎片两次。实验分为两组，一组加培养基，另一组加入含 50 μ g/ml阿魏酸的培养基。在显微镜下拍摄初始状态和1 后细胞的生长状况。实验结果如图4 (a)、图4 (b)、图4 (c)、图4 (d)所示显示，其中，4 (a)、图4 (c)是对照组，图4 (b)、图4 (d)是阿魏酸组50 μ g/ml浓度。图4 (a)、图4 (b)是两组细胞划线后0小时的情况，图4(c)、图4(d)是两组细胞12小时后的迁移情况。阿魏酸(50 μ g/ml) 作用人皮肤成纤维细胞12小时后，阿魏酸组细胞迁移的速度与对照组相比没有明显差异， 表明阿魏酸对人皮肤成纤维细胞的迁移基本不存在促进作用，表明阿魏酸在皮肤的伤口愈合过程中能对抑制疤痕的产生能起到很好的作用效果。表皮细胞和成纤维细胞的生长和增长在皮肤伤口愈合的过程中起着非常重要的作用，表皮细胞的迁移和再上皮化对皮肤伤口愈合收缩起着重要作用，表皮细胞的迁移速度快于成纤维细胞则皮肤伤口的修复会比较平整，如果成纤维细胞的迁移速度快于表皮细胞则容易形成皮肤疤痕，因此，本发明中阿魏酸对皮肤伤口愈合的修复修用主要表现在促进表皮细胞的增殖和迁移，加快伤口收缩，是一种比较理想的伤口愈合添加剂。实施例5、阿魏酸对动物皮肤伤口愈合的实际效果
实验结果表明阳性药物组和不同浓度的阿魏酸各组与对照组比较均有明显收缩皮肤伤口的作用，从第4天开始阳性药物组和0. 5%阿魏酸组与对照组比较均有显著的差异(P < 0. 05)，而1%和10%阿魏酸组与对照组比较均有非常显著的差异(P < 0.01)，伤口愈合作用效果明显，见表1。至实验第6天、第10天实验各组与对照组的差异更加明显，均与对照组有非常显著的差异(P < 0. 01)，如表1所示。实验结果还表明，不同浓度的阿魏酸组对小鼠皮肤伤口的愈合均有明显的促进作用，且呈明显的量效关系。其中1%和10%阿魏酸浓度组的效果比阳性药物积雪苷霜软膏对照组的作用效果更为明显，实验表明相同时间阿魏酸能明显加快小鼠伤口的收缩，有显著促进小鼠皮肤伤口愈合的作用。阿魏酸对小鼠皮肤伤口愈合的实验效果如图5显示，其中图5(a)三个小鼠为对照组，每天在伤口处凃30%甘油IOOul，分别作用时间为1天、4天、6天。图5(b)为阳性药物积雪苷霜软膏对照组，每天在伤口处涂抹积雪苷霜软膏，分别作用时间为1天、4天、6天。图 5(c) (d) (e)中三组分别为涂抹质量浓度0.5%、1%、10%阿魏酸的甘油溶剂组，每天在伤口处凃含不同浓度的阿魏酸溶剂lOOul，分别作用时间为1天、4天、6天。表1各组小鼠皮肤伤口平均直径的测量结果(cm)
权利要求
1.阿魏酸在制备促进皮肤伤口愈合药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述阿魏酸是促进皮肤伤口愈合药物中的活性成分。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述阿魏酸的用量为0.5%-10%。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述促进伤口愈合药物是霜剂、乳剂、软膏、 气雾剂、溶液剂。
全文摘要
本发明公开了阿魏酸在制备促进皮肤伤口愈合药物中的作用，阿魏酸是促进皮肤伤口愈合药物中的活性成分，其用量为0.5%-10%。本发明在细胞水平研究发现阿魏酸能够明显促进人表皮细胞和成纤维细胞的生长，促进人表皮细胞的迁移，能明显促进小鼠皮肤的伤口愈合时间和伤口收缩效果。本发明在皮肤伤口愈合中的应用，可以作为添加剂的形式使用，可以制成具有促伤口愈合的霜剂、乳剂、软膏、气雾剂、溶液剂、等各类剂型。
文档编号A61K31/192GK102342926SQ20111021211
公开日2012年2月8日 申请日期2011年7月27日 优先权日2011年7月27日
发明者刘明耀, 刘连喜, 叶希韵, 李贻娟, 程蔚 申请人:华东师范大学