专利名称：一种卵黄抗体的制备方法、用该方法制得的卵黄抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种卵黄抗体的制备方法、用该方法制得的卵黄抗体及其应用。
背景技术：
中华蜜蜂已被列入国家畜禽遗传资源保护名录，也是辽宁省十大畜禽遗传资源保护品种之一，是我国宝贵的地方蜂种资源，饲养中蜂也已成为山区农民发家致富的有效途径。中蜂对保持我国植物生态系统具有不可替代的作用，研究表明一旦中蜂灭绝，我国将有 30%的植物灭绝，目前因中蜂的减产，导致一些国家级二级保护植物濒临灭绝。近年来各地为加强中蜂业的发展，已经建立了中蜂保护区，然而，目前因中蜂囊状幼虫病的发生，已经给中蜂业造成了毁灭性的打击。1972年中蜂囊状幼虫病在广东大流行，不到半年蔓延至大半个中国，中蜂损失约百万群，严重制约了中蜂产业的发展。目前虽然有中药用于中蜂囊状幼虫病的治疗，但中药治疗主要是通过免疫调节作用，间接抗病毒，并不能直接杀死病毒， 相对起效慢，尤其是对重病蜂群治愈效果较差，同时由于中药的药味会使蜜蜂不能很好的采食，甚至发生逃逸。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种卵黄抗体的制备方法、用该方法制得的卵黄抗体及其应用，可用于治疗中蜂囊状幼虫病，且疗效显著。本发明涉及的一种卵黄抗体的制备方法，其具体步骤如下
1、中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗的制备
将中蜂囊状幼虫病毒用BCA法检测浓度，用ΡΗ=7. Γ7. 8的磷酸盐缓冲液将病毒浓度稀释至0. 2^0. 3毫克/毫升，按稀释后的囊状幼虫病毒溶液体积的0. 3^0. 4%加入甲醛灭活M 48小时后，按稀释后的囊状幼虫病毒溶液体积的4 8%的加入吐温-80，做水相；司本-80与10号白油按体积比1: 9^1: 19混合，灭菌，做油相；水相与油相体积比为 1 3 2 3，先将油相在800(Tl0000rpm搅拌，再缓慢加入水相，1000(Tl2000rpm搅拌4 6分钟，进行无菌检验后，制得中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗，所制疫苗为油包水型；
2、卵黄抗体的制备
用制备的中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗免疫产蛋鸡，首次免疫肌肉注射0. 5 1毫升，之后第1^15天，第观 30天免疫加强1次，剂量加大至首次注射剂量的2、倍，经三次免疫后，用间接ELESA法测定抗体效价，当效价达到28以上时，收集鸡蛋，储于4、°C，以后每隔3(Γ35天免疫一次所述产蛋鸡，以保证有效抗体效价在28以上；对收集到的鸡蛋用水合法提取卵黄抗体IgY。上述的卵黄抗体的制备方法，所述的中蜂囊状幼虫病毒通过以下步骤得到
1、用RT-PCR检测阳性的患病幼虫与ρΗ=7. Ο. 8的磷酸盐缓冲液先混勻，每Ig患病幼虫加磷酸盐缓冲液广anl，磨碎后的混合液加入氯仿，氯仿与所述混合液的体积比1 0. 8 1 1. 5，在37 40°C下勻浆8 10 min,然后800 1200 rpm离心8 lOmin，分别收集上清液和沉淀物；
2、取上清液，在上清液中加入与其体积比为1:0.8^1:1. 5的氯仿，在37、0°C水浴中振摇8 10 min，然后80(Tl200 rpm离心8 10 min，分别收集上清液和沉淀物;
3、上清液继续用步骤2处理2、次，分别收集上清液和沉淀物；
4、将所得沉淀物收集在一起，用ρΗ=7.Ο. 8的磷酸盐缓冲液溶解，每Ig沉淀物加广2ml磷酸盐缓冲液，然后80(T1200 rpm离心8 10 min，取上清液，与之前经过多次处理的上清液混合，然后5000 8000 rpm离心25 30min，取上清液，10000^15000rpm离心25 30 min,再取上清液，35000^45000 rpm离心50 60 min,弃去上清液，将最后离心得到的沉淀物用磷酸盐缓冲液溶解，得到中蜂囊状幼虫病毒。上述的卵黄抗体的制备方法，采用水合法提取卵黄抗体IgY时具体步骤为 用蒸馏水将卵黄液稀释，其中卵黄抗体与蒸馏水的体积比为1:9 1:10，搅拌
15 30min，用0. Imol / L的HCL调节PH= 5. 0 5. 2后，放置4 8°C冰箱6 12小时；然后以4 8°C，800(Tl0000 r / min离心25 30min，用医用纱布过滤，取上清液，浓缩。用上述方法制备得到的卵黄抗体。上述的卵黄抗体在防治中蜂囊状幼虫病的药物中应用。上述的卵黄抗体在防治中蜂囊状幼虫病的药物中应用，其具体步骤如下 将效价调整到25的卵黄抗体溶液，通过直接溶解糖或喷雾的方式给予蜜蜂，饲喂量为
15^25毫升/天/框，隔天饲喂1次，连续饲喂三周。用该方法制得的卵黄抗体在治疗中蜂囊状幼虫病的药物中，具有作用迅速、疗效确切、治愈率高、特异性强、起效快、不复发等优点，其直接针对相应抗原发生迅速的结合反应，因而使用后可产生立竿见影的效果，尤其用于周边已有疾病发生时的紧急预防，使用方便，见效快、安全。卵黄抗体除具有抗体共同优点外，更有许多独特优点，表现在原料易得，生产成本低，使用方便，无药物残留，不易失效，便于贮存等特点。通过该方法制得的卵黄抗体，用于中蜂囊状幼虫病治疗，临床试验结果表明，对已经通过RT-PCR检测和临床确诊的80箱感染中蜂囊状幼虫病毒的蜂群进行治疗，发病较轻的蜂群6、天，不再有幼虫拖出，2周左右开始出现新的封盖幼虫，而其他蜂群在13天左右陆续不再有幼虫拖出，并在21天左右出现新的封盖幼虫，一个月左右77箱蜜蜂全部治愈， 治愈率96. 25%以上。
具体实施例方式实施例1
一、中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗的制备
用RT-PCR检测阳性的患病幼虫与pH7. 6的磷酸盐缓冲溶液先混勻，每Ig患病幼虫加磷酸盐缓冲液lml，磨碎后的混合液加入氯仿，与上述混合液的体积比1:0.8，在371下勻浆10 min，然后1000 rpm离心lOmin，分别收集上清液和沉淀物；取上清液，在上清液中加入与其体积比为1:0. 8的氯仿，在37°C水浴中振摇10 min，然后1000 rpm离心10 min, 分别收集上清液和沉淀物，上清液继续用此法处理两次，分别收集上清液和沉淀物；将所得沉淀物收集在一起，用PH7. 6磷酸盐缓冲液溶解，每Ig沉淀物加Iml磷酸盐缓冲液，然后1000 rpm离心10 min，取上清液，与之前经过多次处理的上清液混合，然后5000 rpm离心 30 min，取上清液，15000 rpm离心25 min，再取上清液，35000 rpm离心60 min，弃去上清液，将沉淀物用磷酸盐缓冲液溶解，用RT-PCR进行检测，检测阳性，证明得到中蜂囊状幼虫病毒。将得到的病毒用BCA法检测浓度，用pH7. 6磷酸盐缓冲液将病毒浓度稀释至0. 25 毫克/毫升，按稀释后的囊状幼虫病毒体积的0. 3%加入甲醛灭活M小时后，按稀释后的囊状幼虫病毒体积的4%的加入吐温-80，做水相；司本-80与10号白油按体积比1 14混合， 在121. 3°C温度下灭菌，做油相；水相与油相体积比为2:3，先将油相在SOOOrpm搅拌，再缓慢加入水相，12000rpm搅拌4分钟，进行无菌检验后，制得中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗，所制疫苗为油包水型。二、卵黄抗体的制备
用制备的中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗免疫产蛋鸡，首次免疫肌肉注射0. 5毫升，之后第14天，第观天免疫加强1次，剂量加大1倍，经三免后，用间接ELESA法测定抗体效价，效价达到28以上，就可以收集鸡蛋，储于4°C，以后每隔35天免疫一次上述产蛋鸡， 以保证有效抗体效价在28以上；对收集到的鸡蛋用水合法提取卵黄抗体IgY，具体方法为 用蒸馏水将卵黄液稀释，其中卵黄抗体与蒸馏水的体积比为1 :9，搅拌15min，用0. Imol / L的HCL调节PH至5.0后放置4°C冰箱6小时；然后以4°C，10000 r / min离心25min， 用医用纱布过滤，取上清液，用浓缩仪(millipoe 30kd)浓缩，即制得卵黄抗体。三、上述的卵黄抗体在防治中蜂囊状幼虫病的药物中应用
对已经通过RT-PCR检测和临床确诊的30箱感染中蜂囊状幼虫病毒的蜂群进行治疗， 将效价调整到25的卵黄抗体溶液作为药物通过直接溶解糖的方式给予蜜蜂，饲喂量为15 毫升/天/框，隔天饲喂1次，连续饲喂21天。除了 2箱因管理不善、失王、工蜂产卵外，未进行持续治疗外，其他剩下的观箱蜜蜂，在治疗后第13天不再有幼虫拖出，21天开始出现新的封盖幼虫，截止31天28箱蜜蜂全部治愈，治愈率96. 25%。实施例2
一、中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗的制备
用RT-PCR检测阳性的患病幼虫与pH7. 4的磷酸盐缓冲溶液先混勻，每Ig患病幼虫加磷酸盐缓冲液1. 5ml，磨碎后的混合液加入氯仿，与上述混合液的体积比1:1. 2，在39°C下勻浆8 min，然后1200 rpm离心8min，分别收集上清液和沉淀物；取上清液，在上清液中加入与其体积比为1:1.2的氯仿，在39°C水浴中振摇8 min，然后1200 rpm离心8 min，分别收集上清液和沉淀物，上清液继续用此法处理三次，分别收集上清液和沉淀物；将所得沉淀物收集在一起，用PH7. 4磷酸盐缓冲液溶解，每Ig沉淀物加1. 5ml磷酸盐缓冲液，然后1200 rpm离心8 min，取上清液，与之前经过多次处理的上清液混合，然后6000 rpm离心27 min, 取上清液，12000 rpm离心27 min，再取上清液，40000 rpm离心55 min，弃去上清液，将沉淀物用磷酸盐缓冲液溶解，用RT-PCR进行检测，检测阳性，证明得到中蜂囊状幼虫病毒。将得到的病毒用BCA法检测浓度，用pH7. 4磷酸盐缓冲液将病毒浓度稀释至0. 2 毫克/毫升，按稀释后的囊状幼虫病毒体积的0. 35%加入甲醛灭活36小时后，按稀释后的囊状幼虫病毒体积的6%的加入吐温-80，做水相；司本-80与10号白油按体积比1: 19混合，在121. 3°C温度下灭菌，做油相；水相与油相体积比为1 2，先将油相在9000rpm搅拌，再缓慢加入水相，IOOOOrpm搅拌6分钟，进行无菌检验后，制得中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗，所制疫苗为油包水型。二、卵黄抗体的制备
用制备的中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗免疫产蛋鸡，首次免疫肌肉注射0. 75毫升，之后第14天，第四天免疫加强1次，剂量加大1. 5倍，经三免后，用间接ELESA法测定抗体效价，效价达到28以上，就可以收集鸡蛋，储于6°C，以后每隔32天免疫一次上述产蛋鸡，以保证有效抗体效价在28以上；对收集到的鸡蛋用水合法提取卵黄抗体IgY，具体方法为用蒸馏水将卵黄液稀释，其中卵黄抗体与蒸馏水的体积比为1:10，搅拌20!^11，用 0. Imol / L的HCL调节PH至5.1后放置6°C冰箱9小时；然后以6°C，9000r / min离心 27min,用医用纱布过滤，取上清液，用浓缩仪(millipoe 30kd)浓缩，即制得卵黄抗体。三、上述的卵黄抗体在防治中蜂囊状幼虫病的药物中应用
对已经通过RT-PCR检测和临床确诊的25箱感染中蜂囊状幼虫病毒的蜂群进行治疗， 将效价调整到25的卵黄抗体溶液作为药物通过直接溶解糖的方式给予蜜蜂，饲喂量为20 毫升/天/框，隔天饲喂1次，连续饲喂21天。在治疗后第8天不在有幼虫拖出，18天开始出现新的封盖幼虫，截止35天，25箱蜜蜂全部治愈，治愈率100%。实施例3
一、中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗的制备
用RT-PCR检测阳性的患病幼虫与pH7. 8的磷酸盐缓冲溶液先混勻，每Ig患病幼虫加磷酸盐缓冲液anl，磨碎后的混合液加入氯仿，与上述混合液的体积比1 1. 5，在40°C下勻浆9 min，然后800 rpm离心9min，分别收集上清液和沉淀物；取上清液，在上清液中加入与其体积比为1:1.5的氯仿，在40°C水浴中振摇9min，然后800 rpm离心9 min，分别收集上清液和沉淀物，上清液继续用此法处理四次，分别收集上清液和沉淀物；将所得沉淀物收集在一起，用PH7. 8磷酸盐缓冲液溶解，每Ig沉淀物加2ml磷酸盐缓冲液，然后800 rpm离心 9 min，取上清液，与之前经过多次处理的上清液混和，然后8000 rpm离心25 min，取上清液，10000 rpm离心30 min，再取上清液，45000 rpm离心50 min，弃去上清液，将沉淀物用磷酸盐缓冲液溶解，用RT-PCR进行检测，检测阳性，证明得到中蜂囊状幼虫病毒。将得到的病毒用BCA法检测浓度，用pH7. 8磷酸盐缓冲液将病毒浓度稀释至0. 3 毫克/毫升，按稀释后的囊状幼虫病毒体积的0. 4%加入甲醛灭活48小时后，按稀释后的囊状幼虫病毒体积的8%的加入吐温-80，做水相；司本-80与10号白油按体积比1 9混合， 在121. 3°C温度下灭菌，做油相；水相与油相体积比为1 3，先将油相在IOOOOrpm搅拌，再缓慢加入水相，IlOOOrpm搅拌5分钟，进行无菌检验后，制得中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗，所制疫苗为油包水型。二、卵黄抗体的制备
用制备的中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗免疫产蛋鸡，首次免疫肌肉注射1毫升， 之后第15天，第30天免疫加强1次，剂量加大2倍，经三免后，用间接ELESA法测定抗体效价，效价达到28以上，就可以收集鸡蛋，储于8°C，以后每隔30天免疫一次上述产蛋鸡，以保证有效抗体效价在28以上；对收集到的鸡蛋用水合法提取卵黄抗体IgY，具体方法为用蒸馏水将卵黄液稀释，其中卵黄抗体与蒸馏水的体积比为1 :9. 5，搅拌30min，用0. Imol / L 的HCL调节PH至5.2后放置8°C冰箱12小时；然后以8°C，8000r / min离心30min，用医用纱布过滤，取上清液，用浓缩仪(millipoe 30kd)浓缩，即制得卵黄抗体。
三、上述的卵黄抗体在防治中蜂囊状幼虫病的药物中应用
对已经通过RT-PCR检测和临床确诊的25箱感染中蜂囊状幼虫病毒的蜂群进行治疗， 将效价调整到25的卵黄抗体溶液作为药物通过喷雾的方式给予蜜蜂，饲喂量为25毫升/ 天/框，隔天饲喂1次，连续饲喂21天。在治疗后第6天不再有幼虫拖出，17天开始出现新的封盖幼虫，在第23天因1箱蜜蜂失王与邻近箱合并，剩下的M箱蜜蜂全部治愈，治愈率 98. 76%ο
权利要求
1.本发明涉及的一种卵黄抗体的制备方法，其特征在于1.1中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗的制备将中蜂囊状幼虫病毒用BCA法检测浓度，用ΡΗ=7. Γ7. 8的磷酸盐缓冲液将病毒浓度稀释至0. 2^0. 3毫克/毫升，按稀释后的囊状幼虫病毒溶液体积的0. 3^0. 4%加入甲醛灭活M 48小时后，按稀释后的囊状幼虫病毒溶液体积的4 8%的加入吐温-80，做水相；司本-80与10号白油按体积比1: 9^1: 19混合，灭菌，做油相；水相与油相体积比为 1 3 2 3，先将油相在800(Tl0000rpm搅拌，再缓慢加入水相，1000(Tl2000rpm搅拌4 6分钟，进行无菌检验后，制得中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗，所制疫苗为油包水型；1.2卵黄抗体的制备用制备的中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗免疫产蛋鸡，首次免疫肌肉注射0. 5^1毫升，之后第1^15天，第观 30天免疫加强1次，剂量加大至首次注射剂量的2、倍，经三次免疫后，用间接ELESA法测定抗体效价，当效价达到28以上时，收集鸡蛋，储于4、°C，以后每隔3(Γ35天免疫一次所述产蛋鸡，以保证有效抗体效价在28以上；对收集到的鸡蛋用水合法提取卵黄抗体IgY。
2.根据权利要求1所述的卵黄抗体的制备方法，其特征在于所述的中蜂囊状幼虫病毒通过以下步骤得到2. 1用RT-PCR检测阳性的患病幼虫与ρΗ=7. Ο. 8的磷酸盐缓冲液先混勻，每Ig患病幼虫加磷酸盐缓冲液广anl，磨碎后的混合液加入氯仿，氯仿与所述混合液的体积比 1 0. 8 1 1. 5，在37 40°C下勻浆8 10 min,然后800 1200 rpm离心8 lOmin，分别收集上清液和沉淀物；2. 2取上清液，在上清液中加入与其体积比为1:0. 8^1:1. 5的氯仿，在37、0°C水浴中振摇8 10 min，然后800 1200 rpm离心8 10 min，分别收集上清液和沉淀物；2. 3上清液继续用步骤2处理2、次，分别收集上清液和沉淀物；2.4将所得沉淀物收集在一起，用ρΗ=7. Ο. 8的磷酸盐缓冲液溶解，每Ig沉淀物加广2ml磷酸盐缓冲液，然后80(T1200 rpm离心8 10 min，取上清液，与之前经过多次处理的上清液混合，然后5000 8000 rpm离心25 30min，取上清液，10000^15000rpm离心25 30 min,再取上清液，35000^45000 rpm离心50 60 min,弃去上清液，将最后离心得到的沉淀物用磷酸盐缓冲液溶解，得到中蜂囊状幼虫病毒。
3.根据权利要求1所述的卵黄抗体的制备方法，采用水合法提取卵黄抗体IgY时其特征在于 用蒸馏水将卵黄液稀释，其中卵黄抗体与蒸馏水的体积比为1:9 1:10，搅拌 15 30min，用0. Imol / L的HCL调节PH= 5. 0 5. 2后，放置4 8°C冰箱6 12小时；然后以4 8°C，800(Tl0000 r / min离心25 30min，用医用纱布过滤，取上清液，浓缩。
4.如权利要求1或2或3所述方法制备得到的卵黄抗体。
5.按照权利要求4所述的卵黄抗体在防治中蜂囊状幼虫病的药物中应用。
6.根据权利要求5所述的卵黄抗体在防治中蜂囊状幼虫病的药物中应用，其特征在于将效价调整到25的卵黄抗体溶液，通过直接溶解糖或喷雾的方式给予蜜蜂，饲喂量为 15^25毫升/天/框，隔天饲喂1次，连续饲喂三周。
全文摘要
一种卵黄抗体的制备方法、用该方法制得的卵黄抗体及其应用，其技术方案是以中蜂囊状幼虫为病毒增殖模型增值病毒，并用增值的病毒制备中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗，用制备的灭活疫苗连续三次免疫产蛋鸡，用间接ELESA法测定抗体效价，效价达到28以上收集鸡蛋，用水合法提纯卵黄抗体。用这种卵黄抗体对感染中蜂囊状幼虫病毒的蜂群进行治疗，治愈率96.25%达以上，并且使用方便、特异性强、起效快、不复发、无药物残留。
文档编号A61K39/42GK102504023SQ201110343389
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月3日 优先权日2011年11月3日
发明者和绍禹, 宋英今, 张大利, 徐晓丽, 王立辛, 袁小波, 费东亮, 韩喜彬, 马鸣潇 申请人:辽宁医学院