专利名称：含银杏原花青素提取物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及天然产物的提取方法和提取物，具体涉及从银杏中提取原花青素的方法以及利用该方法获得的银杏原花青素提取物及其应用。
背景技术：
原花青素因其高抗氧化活性而名满全球，各国的研究人员均非常重视原花青素的开发。目前通过已报道的文献所得，研究人员已经从多种植物中提取分离得到了含量较高的原花青素，如葡萄籽、可可、玫瑰花、松树皮、莲房、越橘果实及其叶子、茶籽壳、沙枣果肉、地榆根等。原花青素是一种由若干个儿茶素类化合物聚合而成，具有黄烷-3-醇结构的植物多酚类化合物，组成原花青素的单体化合物有5对，分别是儿茶素和表儿茶素(所组成的原花青素叫做I^rocyanidin)，阿夫儿茶素和表阿夫儿茶素(所组成的原花青素叫做I^ropelargonidin)，没食子儿茶素和表没食子儿茶素(所组成的原花青素叫做 Prodelphinidin),非瑟酮醇和表非瑟酮醇(所组成的原花青素叫做isetinidin)，洋槐儿茶素和表洋槐儿茶(所组成的原花青素叫做ftOrobinetinidin)。不同植物中的原花青素，其单体组成及比例都是不同的。大部分植物原花青素以儿茶素和表儿茶素组成为主，研究最多的葡萄籽原花青素中，这两种单体组成的原花青素占到了 9成以上。其组成原花青素的5对单体结构如下
组成原花青素的5对单体结构
经研究证实，原花青素具有广泛的药理学活性，包括抗氧化和自由基清除、抗菌和抗病毒、抗肿瘤、抗炎、抗辐射等。原花青素具有较好的心脑血管保护作用，包括脑组织保护、心脏保护、抗动脉硬化、抗血小板聚集、调节血脂等。此外，原花青素还具有眼保护、胃保护、肝脏保护、肾脏保护、抗糖尿病等作用，而这些保护作用的机制与原花青素的抗氧化活性密切相关。原花青素因具有上述活性，使其可用于眼科疾病、肝脏疾病、心脑血管疾病、糖尿病、 皮肤病等的治疗，癌症的辅助治疗及美容的功效。
银杏被誉为植物界的“活化石”，银杏叶及其提取物中也存在着含量丰富的原花青素，在提取物中，原花青素的含量可达7%。德国的F. Qa'dan团队通过对银杏叶原花青素组成的研究发现，银杏原花青素的组成与葡萄籽原花青素的组成区别极大银杏原花青素由没食子儿茶素和表没食子儿茶素组成的Prodelphinidin，比例高达85% ；而由儿茶素和表儿茶素组成的Procyanidin，比例仅15%。没食子儿茶素和表没食子儿茶素的结构与儿茶素和表儿茶素的区别是在B环5’位上多出一个羟基，因此这两类化合物在本身性质和生物活性上也存在着一定的区别。从结构看，Prodelphinidin的活性应该比Procyanidin更好。
但目前还未有较好的技术来提取分离银杏原花青素，原因是银杏叶提取物主要有效成分——黄酮类成分，其不但含量高，达44%以上，为原花青素的5倍，而且其结构、极性与原花青素非常相似，使得分离起来具有相当的难度。尤其是银杏黄酮醇苷，其与活性最高的二聚体、三聚体原花青素的结构、分子量、极性均非常相似。因此，找到一种银杏原花青素的分离纯化技术，尤其是分离高活性的低聚体，对于银杏产业的进一步发展意义重大。
发明内容
本发明的目的是提供了从银杏叶中提取富含原花青素的高纯度银杏原花青素提取物的制备方法，该方法可以有效的将银杏原花青素和银杏黄酮分离开来，以获得高纯度的银杏原花青素提取物产品。
为实现上述发明目的，本发明以银杏叶为原料，经粉碎后，采用溶剂提取一 β -葡萄糖苷酶水解一大孔树脂分离一聚酰胺树脂分离的方法，具体制备方法包括如下步骤
1)银杏叶粉碎后用乙醇水溶液回流提取，获得提取液，并回收提取液中的乙醇至提取液无醇味；
2)提取液中加入β-葡萄糖苷酶，在该含酶水溶液中水解水解黄酮醇苷，获得水解溶
液；
3)水解溶液用大孔树脂吸附分离，用20 40%的乙醇水溶液进行梯度洗脱，获得乙醇洗脱液；
4)洗脱液用聚酰胺树脂进行第二次吸附分离，用水或低浓度丙酮水溶液洗脱并弃去洗脱液，再用高浓度丙酮水溶液进行洗脱，获得丙酮洗脱液；
5)丙酮洗脱液干燥后即得银杏原花青素提取物产品。
根据本发明的制备方法，其中，在乙醇溶剂提取步骤中，银杏叶粉碎至粒径0. I-Icm,用 3-12倍量的50 90%乙醇混合水溶液回流提取0. 5h^l. 5h ；将提取残渣用3_12倍量50 90%乙醇水溶液再次回流提取0. 5h^l.证，过滤，收集提取液，以此方法回流提取次数为2-3 次；合并提取液，用旋转蒸发仪减压浓缩提取液至无醇味，剩余溶液体积约为0. 5 2L，用蒸馏水稀释至3-7L，使部分沉淀溶解，过滤后，收集滤液。
根据本发明的制备方法，其中，在葡萄糖苷酶水解步骤中，向上述滤液中加入 β -葡萄糖苷酶得到含酶的水溶液，酶的加入量为5 50mg，使得含酶的水溶液中含有 β -葡萄糖苷酶的浓度为1 10 μ g/ml，在40 50°C水浴中酶水解4 8小时，过滤，收集滤液，获得酶水解溶液。采用的β-葡萄糖苷酶的酶活力为40U/mg，购置于南京都莱生物技术有限公司。
根据本发明的制备方法，还包括，加入20mg的β -葡萄糖苷酶，使得含酶的水溶液中含有浓度为4 μ g/ml，在45°C水浴中水解6小时，过滤，收集滤液，获得酶水解溶液。根据本发明的制备方法，其中，在大孔树脂分离步骤中，大孔树脂可以选用AB-8、 HPD-750、HPD-200A、HPD-100C。优选为 HPD200A。
根据本发明的制备方法，还包括树脂分离步骤中梯度洗脱处理使用20-35%的乙醇水溶液，优选为25%的乙醇水溶液。
根据本发明的制备方法，其中，在聚酰胺树脂分离步骤中，先用浓度5 30%的丙酮水溶液洗脱，弃去该丙酮洗脱溶液，再用浓度70 90%的丙酮水溶液洗脱，获得丙酮洗脱液。 本发明还提供了根据本发明的制备方法制备的高纯度银杏原花青素提取物产品，其中所述高纯度银杏原花青素提取物产品中，含有88%重量以上的银杏原花青素，小于10%重量的银杏总黄酮，小于5%重量的银杏黄酮醇苷。
本发明还提供了根据本发明的制备方法制备的银杏原花青素提取物产品，其中所述银杏原花青素提取物产品中，银杏原花青素含量为88. 7% 98. 5%，总黄酮含量为1. 5% 8. 7%,黄酮醇苷含量为0. 6% 3. 3%ο
在本发明中，采用USP^版的原花青素测定方法——盐酸正丁醇法，来测定银杏原花青素提取物中原花青素的含量。具体步骤如下
1)试剂A正丁醇与盐酸混合溶剂(体积比95 5)；
2)试剂B:2g硫酸铁铵用IOOml水和盐酸的混合溶液溶解(其中盐酸体积为17. 5ml)；
3)称取约125mg提取物，用甲醇溶解并定容至100ml。精确量取1.0ml，再用甲醇定容至20ml，得样本溶液；
4)取1.Oml样本溶液，加入6. Oml试剂A和0. 25ml试剂B,混勻，沸水浴加热40min后， 用冰水浴迅速冷却至室温；用试剂A定容至10ml，546nm处测定溶液的吸光度值，甲醇为随行空白对照，葡萄籽原花青素为对照。
由于原花青素具有很强的抗氧化活性，其可以增加机体各组织器官的抗氧化能力，对心肌缺血再灌注的大鼠心肌细胞、心脏功能；脑缺血再灌注小鼠的脑神经细胞、脑功能；青光眼大鼠视网膜细胞及其功能均具有较好的保护作用，起到了预防、保健和治疗的作用。此外，银杏原花青素还具有很好的美容抗衰老的功效。
本发明还提供了根据本发明的方法制备的银杏原花青素提取物在用于预防或治疗心脑血管疾病药物或食品中的应用。
本发明还提供了根据本发明的方法制备的银杏原花青素提取物在用于预防或治疗眼科疾病药物或食品中的应用。
本发明还提供了根据本发明的方法制备的银杏原花青素提取物用于美容抗衰老食品中的应用。
本发明还提供了根据本发明的方法制备的银杏原花青素提取物用于美容抗衰老化妆品中的应用。
本发明还提供了一种用于抗衰老、抗氧化活性、预防心脑血管疾病、预防眼科疾病和美容的药物或保健品或化妆品，可以制备银杏原花青素提取物片剂、胶囊剂和软膏剂，其含有银杏原花青素提取物，该银杏原花青素提取物中含有银杏原花青素含量88%以上，银杏总黄酮含量小于10%，银杏黄酮醇苷含量小于5%。
本发明提出的银杏原花青素提取物，其制备方法，先用β -葡萄糖苷酶对提取液中的黄酮醇苷进行降解，使极性、分子量、结构与低聚原花青素较为相似的黄酮醇苷降解为苷元和糖类成分，再利用大孔树脂分离、聚酰胺树脂梯度洗脱分离的方法，有效的将原花青素成分和黄酮类成分分离开来，最终获得高纯度的银杏原花青素产品。该方法操作简单、对仪器设备的要求低、成本较低、适合工业化生产。 具体实施方案
下面的实施例，用于进一步说明和描述本发明，但并不意味着本发明仅限于此。实施例中取值为本发明所述范围的任一具体数值，均为可实施。
以下实施例中所用的银杏原花青素、黄酮醇苷、总黄酮的含量测定方法
原花青素含量根据USP^版，用盐酸正丁醇法测定原花青素的含量；
黄酮醇苷含量根据ChP2010版方法测定黄酮醇苷的含量；
总黄酮含量根据ChP2000版银杏叶提取物中总黄酮的含量测定方法测定总黄酮的含量。
实施例1:银杏原花青素提取物的制备
以银杏叶为原料，经粉碎后，采用溶剂提取一 β -葡萄糖苷酶水解一大孔树脂分离一聚酰胺树脂分离的方法，具体制备方法包括如下步骤
1)银杏叶粉碎至粒径0.1-lcm，用3-12倍量的50 90%乙醇水溶液回流提取0. 5tT 1. 5h，过滤，收集提取液；将提取残渣用3-12倍量的50 90%乙醇水溶液再次回流提取 0. 5h^l.证，过滤，收集提取液(以此方法回流提取次数为2-3次)；合并提取液，用旋转蒸发仪减压浓缩提取液至无醇味，剩余溶液体积约为0. 5 2L，加入蒸馏水稀释至3-7倍量体积，过滤，收集滤液(即提取液)；
2)上述提取液中加入5-50mg的β-葡萄糖苷酶，控制含酶水溶液中β-葡萄糖苷酶的浓度为1 10 μ g/ml，水解黄酮醇苷，其水解条件在40 50°C水浴中水解4 8小时，过滤，收集滤液，获得酶水解溶液；
3)酶水解溶液用大孔树脂吸附分离，大孔树脂可以选用AB-8、HPD-750、HPD-200A、 HPD-100C,梯度洗脱处理使用20 40%的乙醇水溶液，优选使用25%的乙醇水溶液，获得乙醇洗脱液；
4)上述乙醇洗脱液用聚酰胺树脂进行第二次吸附分离，先用水或浓度5 30%的丙酮水溶液洗脱，优选使用20%的丙酮水溶液，弃去该洗脱溶液；再用浓度70 90%的丙酮水溶液洗脱，优选使用80%的丙酮水溶液，收集该丙酮洗脱液。
5)上述丙酮洗脱液经旋转蒸发仪减压浓缩干燥后，得到银杏原花青素提取物产品。
制备的银杏原花青素提取物，原花青素的含量为88. 7 98. 5%，总黄酮含量小于10%， 黄酮醇苷含量小于5%。
实施例2:银杏原花青素提取物的制备
以银杏叶为原料，经粉碎后，采用溶剂提取一 β -葡萄糖苷酶水解一大孔树脂分离一聚酰胺树脂分离的方法，具体制备方法包括如下步骤
1)银杏叶粉碎至粒径0.1-lcm，加入10倍体积70%的乙醇水溶液，回流提取lh，过滤， 收集提取液；将提取残渣用10倍体积70%的乙醇水溶液再次回流提取lh，过滤，收集提取液；合并上述两次提取液，用减压干燥装置浓缩提取液至无醇味，剩余溶液体积约为投料量的1倍量体积，加入蒸馏水稀释至5倍量体积，过滤；
2)上述稀释后的提取液中加入20mg左右的β-葡萄糖苷酶，控制含酶水溶液中β-葡萄糖苷酶的浓度为4 μ g/ml，水解黄酮醇苷，其水解条件在45°C水浴中水解6小时，过滤， 收集滤液(即得酶水解溶液)；
3 )将上述滤液(酶水解溶液)用HPD200A大孔树脂进行吸附，再用25%的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收至无醇味；
4)将上述洗脱液用聚酰胺树脂吸附，用水洗脱，弃去该洗脱溶液；再用80%的丙酮水溶液洗脱，收集80%丙酮洗脱液；
5)上述80%丙酮洗脱液经浓缩、干燥后，得到银杏原花青素提取物产品。
制备的银杏原花青素提取物，含98. 5%重量的银杏原花青素，1. 5%重量的总黄酮，0. 6% 重量的黄酮醇苷。
实施例3 大孔树脂吸附分离中大孔树脂筛选研究
1)取2kg银杏叶，粉碎至粒径小于1cm，加入20L70%的乙醇水溶液，回流提取lh，过滤，收集提取液；将上述提取残渣用20L 70%的乙醇水溶液再次回流提取lh，过滤，收集提取液；合并上述两次提取液，用减压干燥装置浓缩提取液至无醇味，剩余溶液体积约为2L， 加入蒸馏水稀释至10L，过滤，收集滤液；
2)将上述滤液用表1中的大孔树脂吸附分离原花青素，再用30%的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收至无醇味；
3)将上述洗脱液上样于30 60目聚酰胺树脂进行第二次吸附分离，再用80%的丙酮水溶液洗脱，收集洗脱液；
4)回收上述洗脱部位，并测定其原花青素和总黄酮的含量。具体结果见表1，其中以 HPD-200A纯化效果最佳。
表1大孔树脂吸附分离用不同大孔树脂比较
权利要求
1.一种银杏原花青素提取物的制备方法，包括以下步骤1)银杏叶粉碎后用乙醇水溶液回流提取，获得提取液，并回收提取液中的乙醇至提取液无醇味；2)提取液中加入β -葡萄糖苷酶，在该含酶水溶液中水解，获得酶水解溶液； 3)水解溶液用大孔树脂吸附分离，用20 40%的乙醇水溶液进行梯度洗脱，获得乙醇洗脱液；4)洗脱液用聚酰胺树脂进行第二次吸附分离，用水或低浓度丙酮水溶液洗脱并弃去洗脱液，再用高浓度丙酮水溶液进行洗脱，获得丙酮洗脱液；5)丙酮洗脱液干燥后即得银杏原花青素提取物产品。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是步骤1)所述的银杏叶粉碎至粒径 0. I-Icm,每公斤银杏叶加入3-12倍量50 90%乙醇水混合溶液回流提取0. 5h^l. 5h，过滤，收集提取液；将提取残渣用3-12倍量50 90%乙醇水溶液再次回流提取0. 5h^l. 5h， 过滤，收集提取液；合并提取液，用减压干燥装置浓缩提取液至无醇味，剩余溶液体积约为 0. 5 2L，加入蒸馏水稀释至3 7L，过滤，收集滤液。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是步骤2)，提取液中加入β-葡萄糖苷酶， 得到含有浓度1 10 μ g/ml β -葡萄糖苷酶的含酶水溶液，在40 50°C水浴中水解4 8小时，过滤，收集滤液，获得酶水解溶液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是步骤2)，提取液中加入β-葡萄糖苷酶， 得到含有浓度4 μ g/ml β -葡萄糖苷酶的含酶水溶液，在40 50°C水浴中水解4 8小时，过滤，收集滤液，获得酶水解溶液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是步骤3)中分离用大孔树脂可以选用 AB-8、HPD-750、HPD-200A、HPD-100C。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是步骤3)中分离用大孔树脂为HPD200A。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是步骤3)中用20-35%的乙醇水溶液进行梯度洗脱。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征是步骤3)中用25%的乙醇水溶液进行梯度洗脱。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是步骤4)中，先用浓度5 30%的丙酮水溶液洗脱，弃去丙酮洗脱溶液，再用浓度70 90%的丙酮水溶液洗脱，获得丙酮洗脱液。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征是步骤4)中先用20%的丙酮水溶液洗脱， 弃去丙酮洗脱溶液，再用浓度80%的丙酮水溶液洗脱，获得丙酮洗脱液。
11.根据权利要求1至10任一项所述的制备方法制备的银杏原花青素提取物，其中所述银杏原花青素提取物含有银杏原花青素含量达到88%以上，银杏总黄酮含量小于10%， 银杏黄酮醇苷含量小于5%。
12.根据权利要求11所述的银杏原花青素提取物，其中银杏原花青素含量达到90%以上。
13.根据权利要求12所述方法制备的银杏原花青素提取物，其中银杏原花青素含量达到95%以上。
14.根据权利要求12所述方法制备的银杏原花青素提取物，其中银杏原花青素含量达到98%以上。
15.根据权利要求11所述的银杏原花青素提取物在制备用于预防或治疗心脑血管疾病药物或食品中的应用。
16.根据权利要求11所述的银杏原花青素提取物在制备用于预防或治疗眼科疾病药物或食品中的应用。
17.根据权利要求11所述的银杏原花青素提取物在制备用于美容抗衰老食品中的应用。
18.根据权利要求11所述的银杏原花青素提取物在制备用于美容抗衰老化妆品中的应用。
19.一种用于抗衰老、预防心脑血管疾病、预防眼科疾病和美容的功能食品，其含有权利要求11银杏原花青素提取物。
20.一种用于预防心脑血管疾病、预防眼科疾病的药物，其含有权利要求11银杏原花青素提取物。
全文摘要
本发明涉提供一种银杏原花青素提取物，该提取物中原花青素含量为88.7～98.5%，总黄酮含量不超过10%，黄酮醇苷含量不超过5%。本发明还提供制备上述提取物的制备方法，其包括下列内容采用乙醇水溶液提取、β-葡萄糖苷酶水解、大孔树脂吸附分离、聚酰胺树脂吸附分离等步骤得到的提取物。本发明提供的银杏原花青素提取物可作为用于预防或治疗心脑血管疾病、眼科疾病、抗氧化活性、美容抗衰老为目的的保健食品、药品或化妆品。
文档编号A61K31/352GK102558128SQ20111038433
公开日2012年7月11日 申请日期2011年11月28日 优先权日2011年11月28日
发明者乔洪翔, 叶剑锋, 姚建标, 孙柳燕, 盛卫国, 陈玲芳 申请人:浙江康恩贝制药股份有限公司, 浙江现代中药与天然药物研究院有限公司