结合A-beta淀粉样蛋白的多肽与应用的制作方法

专利名称：结合A-beta淀粉样蛋白的多肽与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种结合A-beta淀粉样蛋白的多肽与应用。
技术背景
阿尔茨海默病Alzheimer’ s Disease，以下简称AD，俗称老年性痴呆，是由β-淀粉样蛋白单体分子(β-Amyloid 40/42 (Α β 40/42，以下简称A β ))聚集形成具毒性作用的聚集物引起的老年人主要以记忆力下降和脑部形成老年斑为特征的神经退行性疾病。医学统计表明，我国和欧美国家中60岁以上老年人有5 6%患有阿兹海默病。该病已被列为导致死亡的第四大疾病，仅次于心脏病、癌症和中风。我国现有60岁以上人口约一亿，按照 60岁以上人口中老年性痴呆患病率为5%估算，全国可能有老年性痴呆患者约500万。该病已给家庭和社会带来巨大的负担。研究人员估计，如果防治措施得不到改善，原处于死亡病因第4位的老年性痴呆症将成为21世纪老年人健康的头号杀手，将会有三分之一的65 岁以上老人患老年性痴呆症。目前，对AD的临床治疗只是应用一些神经营养和消炎类药物进行对症治疗，尚没有任何特异性治疗AD的药物面世。
基于Αβ的致病机理，目前对AD治疗制剂的研究主要从三个方面入手通过抑制酶促反应降低Αβ产生、抑制Αβ的聚集及细胞毒性和加快Αβ的清除。Αβ主要由39-42 个氨基酸残基组成，其中A β 42聚集较快、细胞毒性较大，为主要的AD致病因素。它来自于分子量为 110-135KD 的前体蛋白(Amyloid Precursor Protein，APP)。APP 经 β 分泌酶的作用产生Αβ的氨基端，经胞膜内Y分泌酶作用产生Αβ的羧基端。在正常情况下，在β 分泌酶作用之前，α分泌酶在Aβ中间的Lysl6-Leul7处将APP裂解为API^sa和嵌在膜上较短的羧基片段C83。APPsa具有生长调节和神经营养的作用，能够延长神经元的存活， 稳定和加强突触的结构，增强神经元的功能等。在机体异常的情况下，β、Y分泌酶活性增强，或α分泌酶活性降低，将会产生较多量的Αβ。业已报道，许多物质包括无机化合物、有机化合物、多肽、蛋白及抗体等对Αβ的聚集和细胞毒性都有不同程度的抑制作用。报道的多肽大多是A β的中间疏水片段或C末端的衍生物，它们含有与A β结合的区域以及阻止 Αβ聚集的区域。另有几种由噬菌体显示技术筛选出来的多肽体外可以抑制Αβ的聚集和细胞毒性，但尚未见有在体内发挥作用的报道。
在脑组织中，Αβ可有几个途径排出或降解⑴经胰岛素降解酶(IDE)、脑啡肽酶 (NEP)、内皮素转化酶(ECE)、血管紧张素转换酶(ACE)作用将A β降解；( 经过LRP受体排出至血液循环系统；C3)经脑内小胶质细胞和星形胶质细胞吞噬降解；(4)经其它途径排出神经系统。正常情况下，脑组织中Αβ的产生和排出或降解保持着动态平衡。当脑组织中Αβ产生过多，或清除过慢，就会导致Αβ水平升高，诱发AD的发生。因而，能够增加Αβ 清除的制剂也具有潜在的AD治疗作用。发明内容
本发明的一个目的是提供一种结合A-beta淀粉样蛋白的多肽。
本发明提供的多肽，是如下1)或2)
1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；
2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列1衍生的多肽。
上述蛋白中，一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述2)所示的多肽为如下a、b、c中的任意一种
a、由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的多肽；
b、由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的多肽；
C、由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的多肽。
本发明的另一个目的是提供一种抑制Αβ细胞毒性制剂。
本发明提供的抑制Αβ细胞毒性制剂，其活性成分为上述多肽。
在上述抑制Αβ细胞毒性制剂中，所述细胞具体为SH-SY5Y细胞，所述Aβ具体为 Αβ42。
抑制Αβ细胞毒性为抑制Αβ对细胞的毒性。
本发明的第三个目的是提供一种促进小胶质细胞清除Αβ的制剂。
本发明提供的促进小胶质细胞清除A β的制剂，其活性成分为上述多肽。
在上述促进小胶质细胞清除A β的制剂中，所述小胶质细胞具体为BV-2细胞；所述Αβ具体为Αβ42。
本发明的第四个目的是提供一种治疗阿尔茨海默病的产品。
本发明提供的产品，其活性成分为上述多肽；所述产品具体为药物。
上述多肽在抑制Αβ的细胞毒性和/或制备抑制A β细胞毒性制剂中的应用也是本发明保护的范围；所述细胞具体为3^￥5￥细胞，所述4 0具体为A β 42。
上述多肽在促进小胶质细胞吞噬A β或制备促进小胶质细胞清除A β的制剂中的应用也是本发明保护的范围；所述A β具体为A β 42。
上述多肽在制备治疗阿尔茨海默病的产品中的应用也是本发明保护的范围；所述产品具体为具体为药物。
上述多肽在制备治疗阿尔茨海默病的产品的效果体现在提高空间记忆能力、减少脑内老年斑的数量和降低Aβ含量；所述Aβ具体为Αβ40或Αβ42。
本发明的实验证明，本发明的多肽分子量小，可特异性结合Αβ 42，并抑制Αβ 42 的细胞毒性，保护SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞免受A β 42毒性的影响。将该多肽注射到AD 转基因小鼠(API^SWe/PSldE9双转基因)的脑侧室进行动物记忆实验，结果表明，其可以明显改善小鼠的空间记忆能力，减少脑内老年斑的数量并降低Αβ40和Αβ 42的水平。该多肽易穿过血脑屏障，并且相比其它大分子蛋白如抗体等抗原性较差，副作用较小，在阿尔茨海默病的预防和治疗方面具有广泛的应用前景。


图1为XD4与A β 42结合的ELISA测定
图2为经置换、缺失或插入氨基酸的)(D4与A β结合的ELISA测定
图3为)(D4抑制A β 42的细胞毒性
图4为)(D4抑制由A β 42导致的ROS的产生
图5为)(D4抑制由A β 42导致的NO的产生
图6为)(D4抑制由Αβ 42导致的细胞内钙离子浓度的升高
图7为注射)(D4多肽的AD转基因小鼠的水迷宫实验
图8为注射)(D4多肽的AD转基因小鼠脑部老年斑的变化
图9为注射)(D4多肽的AD转基因小鼠脑部老年斑面积的变化
图10为注射)(D4多肽的AD转基因小鼠脑中可溶性A β 40水平
图11为注射)(D4多肽的AD转基因小鼠脑中可溶性A β 42水平
图12为注射)(D4多肽的AD转基因小鼠脑中不溶性Aβ 40和Αβ 42水平
图13为)(D4促进细胞对A β的吞噬具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的PBS缓冲液PH值为7. 2的缓冲液(配方为5. 84g NaCl, 4. 72g Na2HPO4, 2. 64g NaH2PO4. 2H20，用水配成 1 升，调 pH 为 7. 2)；
下述实施例中的所有的实验数据除了水迷宫记忆实验外都是通过3次独立的实验获得的，实验数据表示为平均数加减标准差。数据的统计分析是应用One-way ANOVA软件进行，对于多组重复记忆力测定数据的比较分析则应用重复数据的Two-way AN0VA。
实施例1、多肽)(D4及其衍生物的获得
1、多肽)(D4的获得
根据阿尔茨海默病AD的发病原理，治疗AD的根本方法应是减少β淀粉样蛋白 (Αβ)的产生、抑制Αβ的聚集、细胞毒性或加快Αβ的清除。本发明应用噬菌体显示技术， 以A β 42单体为筛选底物，将1 X IO8种七肽进行了四轮淘选，应用噬菌体ELISA从中筛选出了多条可与Αβ42明显结合的多肽，通过比对多条肽链与Αβ 42的结合特性以及对Αβ聚集和细胞毒性的影响，最终选择出多肽》)4。
多肽)(D4 的序列为Pro_IIe-Lys-Thr-Leu-Pro-Met (序列 1)。
多肽)(D4为七肽，由上海吉尔生化有限公司按常规方法合成制备(制备方法参见 Weng C C, Peter D W. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis :A Practical Approach. Oxford :University Press,2000. 1-8 ；Atherton Ε, Sheppard R C. Solid Phase Peptide Synthesis :A Practical Approach. Oxford :IRL Press, 1989) ；XD495%, XD4 保存于-20°C，避免反复冻融。
同时合成连接有6个组氨酸作为标签的多肽》)4。
2、多肽)(D4衍生物的获得
XD4的衍生物为将)(D4的氨基酸经置换、缺失或插入其它氨基酸得到的多肽，具体如下
)4-ΔΜ:为将)(D4(序列1)的多肽缺失蛋氨酸得到的多肽，氨基酸序列为 Pro-Ile-Lys-Thr-Leu-Pro (序列 2，PIKTLP)，也可人工合成；5
XD4-PM/TQ 为将)(D4(序列1)的脯氨酸和蛋氨酸分别置换成苏氨酸和谷氨酰胺得到的多肽，氨基酸序列为=Thr-Ile-Lys-Thr-Leu-Pro-Gln (序列3，TIKTLPQ)，也可人工合成；
XD4-N 为将)(D4 (序列1)中插入天冬酰胺得到的多肽，氨基酸序列为=Pro-Ile-L ys-Thr-Asn-Leu-Pro-Met (序列 4，PIKTNLPM)，也可人工合成。
同时合成连接有6个组氨酸作为标签的多肽)(D4- Δ Μ、XD4-PM/TQ和)(D4-N。
实施例2、多肽)(D4的应用
一、XD4及其衍生物与A β 42的特异性结合
1、)(D4与A β 42的特异性结合
分别将PBS缓冲液配制的A β 42 (American Peptide Co.，62-0-80B)及阴性对照多肽(序列为SMSARQL由吉尔生化(上海)有限公司合成)以1 μ g/孔包被96孔氨基化酶标板，4°C过夜。以BSA封闭酶标板上未与多肽结合的空白位点，然后分别加入连接有6 个组氨酸作为标签的由实施例1得到的XD4 1,0. 5,0. 25,0. 125,0 μ g/孔，室温(25°C )作用池。洗涤后，加入能与组氨酸标签结合的偶联HRP的抗体，室温作用lh。洗涤后，加入底物TMB，显色20分钟后，以多功能酶标仪测定450nm处的吸光度。
在相同的条件下重复三次，结果见图1，其中，左侧的柱形图A β 42为)(D4与A β 42 的特异性结合，右侧的柱形图对照多肽为》)4与阴性对照多肽的特异性结合；图中数据为三次的平均值，error bar为SD。
从左侧的柱形图可以看出，1、0. 5、0· 25、0· 125、0μ g/孔XD4分别与A β 42结合后的 0D450nm 为 0. 37,0. 35,0. 25,0. 14,0. 08 ；
从右侧的柱形图可以看出，1、0. 5,0. 25,0. 125、0 μ g/孔)(D4分别与阴性对照多肽结合后的 0D450nm 为 0. 08,0. 09,0. 06,0. 07,0. 06 ；
可以看出，与阴性对照多肽相比，XD4可与Αβ 42特异性结合。
2、XD4的衍生物与A β 42特异结合
分别将上述由实施例1得到的多肽Π)4- Δ Μ、XD4-PM/TQ, XD4-N连接组氨酸标签， 然后按照上述1的试验方法检测与A β 42的结合特性，各多肽每孔加入1 μ g/孔，用ELISA 方法测定OD值。
结果见图2，其中，左侧的柱形图A β 42为)(D4的衍生物与A β 42的特异性结合，右侧的柱形图对照多肽为》)4的衍生物与阴性对照多肽的特异性结合；
从左侧的柱形图可以看出，》)4-ΔΜ、XD4-PM/TQ, )(D4-N分别与Aβ 42结合后的 0D450nm 为 0. 30、0· 25、0· 23 ；
从右侧的柱形图可以看出，XD4-AM, XD4-PM/TQ, XD4-N分别与阴性对照多肽结合后的 0D450nm 为 0. 04,0. 03,0. 04 ；
表明)(D4某个氨基酸经置换、缺失或在多肽中增加氨基酸后仍保留与A β 42结合的能力(与阴性对照相比，*，P < 0. 01)。
二、XD4抑制A β 42的细胞毒性
UXD4体外抑制A β 42的细胞毒性
用含10%胎牛血清的培养基(MEM, Invotrigen, 12561-056)将 SH-SY5Y 细胞(中国医学科学院肿瘤细胞库，产品号为SH-SY5Y)配成单个细胞悬液，以每孔10000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔体积100 μ L0细胞于37°C培养M小时，培养箱(X)2浓度为5%。 每孔加入如下样品
未孵育A β 42 (Α β) A β 42蛋白的终浓度是1 μ M ；
未孵育A β 42与XD4的混合物(Α β XD4 = 1 1) :Α β 42蛋白的终浓度是1 μ Μ, XD4的终浓度是1 μ M ；
未孵育Αβ42与)(D4的混合物(Αβ XD4 = 1 10) :Α β 42蛋白的终浓度是 1 μ Μ, XD4的终浓度是10 μ M ；
孵育Αβ42(Μ小时孵育Αβ) Aβ 42蛋白的终浓度是1 μ M ；
孵育A β 42与XD4的混合物04小时孵育A β XD4 = 1 1) =A β 42蛋白的终浓度是ι μ Μ, XD4的终浓度是1 μ M ；
孵育A β 42与XD4的混合物04小时孵育A β XD4 = 1 10) :Α β 42蛋白的终浓度是ι μ Μ, XD4的终浓度是10 μ M ；
上述孵育为将A β 42在37°C孵育Mh。
以PBS为对照；
将上述7组细胞继续培养48小时后，每孔加MTT溶液(Sigma，产品目录号为 M5655、溶剂为PBS, 5mg/mL) 10 μ L，37°C孵育3小时，终止培养，每孔加100 μ L晶体溶解液 (10% SDS和5%异丁醇溶解在0. OlM HCL中)，37°C孵育过夜(1 )，使结晶物充分溶解。 在多功能酶联免疫检测仪上以570nm波长测定各孔光吸收值。减去本底后，以样品的吸光度除以不加样品的细胞对照的吸光度作为细胞的活性指标，并分析样品之间的差异显著情况。
结果如图3所示(*，P < 0. 05)，
未孵育A β 42 (Α β )组的细胞活性为70. 88% ；
未孵育A β 42与XD4的混合物(Αβ XD4 = 1 1)组的细胞活性为82. 03% ；
未孵育A β 42与XD4的混合物(Αβ XD4 = 1 10)组的细胞活性为87. 79% ；
孵育A β 42 (24小时孵育A β )组的细胞活性为76. 46% ；
孵育A β 42与)(D4的混合物( 小时孵育A β XD4 = 1 1)组的细胞活性为 79. 84% ；
孵育A β 42与XD4的混合物04小时孵育A β XD4 = 1 10)组的细胞活性为 81. 24% ；
从上述可以看出，孵育后的A β 42细胞毒性减小，)(D4未表现出显著降低A β 42毒性的作用。与单独的未孵育Αβ 42样品相比，)(D4的加入可显著提高细胞的活性，即表明)(D4 可以抑制A β 42的细胞毒性。
2.XD4抑制由Aβ 42导致的ROS的产生
按照上述1中的培养SH-SY5Y细胞24h，然后应用如下三组培养基培养细胞12h
A β 42组含有10 μ M A β 42的无血清培养基(Hyclone，产品目录号 SH30022. 01B)；
Αβ42 XD4(摩尔比)=1 1 组含有 10 μ M Aβ 42 禾口 10 μ M XD4 的无血清培养基(Hyclone，产品目录号:SH30022. 01B)；
Αβ42 XD4(摩尔比)=1 10 组含有 10 μ M Aβ 42 和 100 μ M XD4 的无血清培养基(Hyclone，产品目录号:SH30022. 01B)；
除去培养基，应用PBS洗涤细胞三次，加入IOmM的2'，7' -dichlorofIuorescein diacetate (DCFH-DA，碧云天生物技术研究所，产品目录号S0063)，37°C孵育20min，应用 PBS洗涤细胞三次去除多余DCFH-DA。在多功能酶联免疫检测仪上以激发光为488nm发射光为525nm测定荧光强度。ROS的产生量以相对于细胞空白对照的百分比表示。
结果如图4所示，A β 42组的相对荧光强度为142. 46% ；
Αβ42 )(D4(摩尔比)=1 1组的相对荧光强度为139. 7% ；
Αβ42 )(D4(摩尔比)=1 10组的相对荧光强度为111. 99% ；
可以看出，A β 42可使细胞的ROS产生升高，加入)(D4后可使ROS水平显著下降 (与单独加入A β 42的样品相比，*，P < 0. 05)。
3、)(D4抑制由A β 42导致的NO的产生
按照上述1中的培养SH-SY5Y细胞24h，然后应用如下三组培养基培养细胞12h
Αβ 42组含有10 μ M Αβ 42的无血清培养基(Hyclone，产品目录号 SH30022. 01B)；
Αβ42 XD4(摩尔比)=1 1 组含有 10 μ M Aβ 42 禾口 10 μ M XD4 的无血清培养基(Hyclone，产品目录号:SH30022. 01B)；
Αβ42 XD4(摩尔比)=1 10 组含有 10 μ M Aβ 42 和 100 μ M XD4 的无血清培养基(Hyclone，产品目录号:SH30022. 01B)；
除去60μ L培养基，加入等体积的Griess试剂(1 % sulfanilamide，0. 1 % naphthylethylene diamine 溶于 2. 5% 的磷酸溶液)，室温(25°C )作用 lOmin。测定 M5nm 处的光吸收(以细胞对照的OD值作为100%，计算各样品的OD相对值)。
结果见图5，A β 42组的OD相对值为204% ；
Aβ 42 )(D4(摩尔比)=1 1 组的 OD 相对值为 180. 63% ；
Aβ 42 )(D4(摩尔比)=1 10 组的 OD 相对值为 140. 65% ；
可以看出，Αβ 42可使细胞的NO产生升高，加入)(D4后可使NO水平显著下降(与单独加入A β 42的样品相比，*，P < 0. 05)。
4、)(D4抑制由Αβ42导致的细胞内钙离子浓度的升高
按照上述1中的培养SH-SY5Y细胞24h，然后应用如下三组培养基培养细胞12h
Αβ 42组含有10 μ M Αβ 42的无血清培养基(Hyclone，产品目录号 SH30022. 01B)；
Αβ42 XD4(摩尔比)=1 1 组含有 10 μ M Aβ 42 禾口 10 μ M XD4 的无血清培养基(Hyclone，产品目录号:SH30022. 01B)；
Αβ 42 XD4(摩尔比)=1 10 组含有 10 μ M Aμ Mβ 42 禾口 100 μ M XD4 的无血清培养基(Hyclone，产品目录号:SH30022. 01B)；
力口入 fluorochrome Fluo-3/acetoxymethyl ester (Fluo-3/AM，碧云天生物技术研究生，产品目录号为S1056)，置暗处37°C 30min。在多功能酶联免疫检测仪上以激发光为485nm，发射光为538nm测定荧光强度。
结果见图6，Aβ 42组的相对荧光强度为M7. 25% ；
Αβ42 )(D4(摩尔比)=1 1组的相对荧光强度为165. 07% ；
Αβ42 )(D4(摩尔比)=1 10组的相对荧光强度为156. 70% ；
可以看出，Αβ 42可使细胞内钙离子浓度升高，加入)(D4后可使细胞内钙离子浓度显著下降(与单独加入A β 42的样品相比，*，P < 0. 05)。
因为AD的发生也与R0S、N0、细胞钙离子浓度失衡等有关，同时这些实验也可从某些方面解释Η)4抑制A β 42的细胞毒性作用。
三、XD4改善AD病的效果体现
1、改善AD转基因小鼠的记忆能力
实验方法
1)脑侧室注射将8月龄大的转APP和PSl基因(API^SWe/PSldE9)的AD雌性小鼠 (转 APP 和 PSl 基因(APPswe/PSldE9)小鼠购自 Jackson Lab (Bar Harbor, ME，美国，产品目录号为004462)，繁殖后经过鉴定得到含有APP和PSl基因的小鼠为转APP和PSl基因 (APPswe/PSldE9)的AD小鼠)，随机分为注射多肽)(D4 (AD+XD4)和注射PBS组(AD+con)，每组8只。同时以8只年龄相同的同窝野生型小鼠做为对照组(转APP和PSl基因(APPswe/ PSldE9)小鼠购自Jackson Lab, Bar Harbor，ME，美国，产品目录号为:004462,繁殖后经过鉴定得到不含有APP和PSl基因的小鼠为野生型小鼠；WT+con)。
将上述三组小鼠进行如下处理
脑内注射前1 对小鼠禁食不禁水。首先将小鼠麻醉，麻醉剂量为25g小鼠腹腔注射0. ImL浓度为10%的水合氯醛。将小鼠固定在立体定位仪上，参照标准图谱(Academic Publish)进行脑立体定位侧室注射给药。小鼠脑室注射定位参数为前囱后1. 8mm,中线旁开士 1. 8mm，硬膜下2. 5mm。用无菌水溶解)(D4至lmg/ml，注射速度0. 2 μ Ι/min，注射剂量为5yL。注射完留针5min。每隔7天注射一次，共注射4次。于最后一次注射后5天，对小鼠进行水迷宫记忆能力检测。
2)记忆力训练小鼠水迷宫训练之前放在室温25°C，湿度46%的环境适应3天。 所有行为学检测试验中均采用随机双盲的方式。训练前，除去平台，在水槽中央轻轻放入， 让其自由游动60s。测定每组小鼠游泳象限偏好，选择对面水槽的壁，作为该小鼠初始释放位置。第一次训练前让小鼠站在平台(平台直径10厘米)上15s，让它记忆一下池(直径 1.1米)中台的空间位置。平台放在第二象限中部，并且平台的上表面距水面1.5厘米。池水中加入奶粉，以增加动物的视觉反差，利于图像记录。将小鼠面朝池壁，轻轻放入水中，让其在水槽中游泳。小鼠在台上站立^就停止计时，认为上台，训练时间每次最长为90s。期间应用软件(购自中国医科院药物所)记录其轨迹以及从入水到爬上平台的时间，即潜伏期。如果小鼠在90s内找到平台则让其在平台上停留10s。如果小鼠在90s内找不到平台， 则在90s后由实验人员引导其上平台，并让其在平台上停留10s。连续训练5天，每天训练 2次，两次之间的间隔为3-4h。然后间隔Mh，撤掉平台，让小鼠在水中寻找平台90s。以录像和软件系统记录5天训练和探索实验的结果，并以重复量数二因子变异数分析(two-way AN0VA, repeated measures)处理实验结果。
实验结果如图7所示，随着训练时间的增长，对照组小鼠找到平台的潜伏期逐渐缩短；具体如下注射》)4的AD小鼠找到平台的潜伏期在训练到第3、4、5天时，与注射PBS 对照的AD小鼠相比具有显著差异(与注射PBS AD小鼠组相比，*，P <0.05)，表明注射 )(D4后的AD小鼠空间记忆能力明显好于注射PBS的对照组(图7A)。撤掉台后注射)(D4的AD小鼠找到平台的潜伏期也明显小于AD对照组(图7B)。注射)(D4的AD小鼠穿过平台所在位置的次数显著高于AD对照组(图7C)，并且注射)(D4后的AD小鼠在目标象限中所在的时间显著高于AD对照小鼠(图7D)。这些结果表明注射)(D4后的AD小鼠空间记忆能力明显好于未注射的AD对照组。
2.XD4降低AD转基因小鼠脑内老年斑的数量
应用ThS荧光染色实验测定)(D4对AD转基因小鼠脑内老年斑的影响
1)将上述1的注射多肽)(D4 (AD+XD4)组、注射PBS组(AD+con)、野生型(WT+con) 组小鼠心脏灌流，取脑组织，应用组织冷冻液及液氮进行冷冻处理。并保存于-80°C。用时以冷冻切片机进行切片，切片厚度16 μ m，每隔9个切片取一个进行染色观察。
2)应用lmg/ml ThS (Sigma，产品目录号T1892_25G，以70%乙醇配制)浸染切片 lOmin，然后以70%乙醇冲洗3次。
3)应用荧光显微镜采集图像(Olympus BX60)(激发波长488nm，4X物镜)。
检测结果见图8，其中图8A为注射PBS的AD小鼠脑皮层，图8D为注射PBS的AD 小鼠海马，图8B为注射多肽)(D4 AD小鼠脑皮层；图8E为注射多肽)(D4 AD小鼠海马；图8C 为野生型小鼠的皮层，图8F为野生型小鼠的海马；可以看出，注射PBS的AD小鼠脑皮层(图 8A)和海马(图8D)中的老年斑数量明显多于注射多肽)(D4 AD小鼠脑皮层(图8B)和海马中(图8E)老年斑数量。
应用软件系统(visiopharm)测定注射多肽)(D4 (AD+XD4)组(n = 8)、注射PBS组 (AD+con或control) (η = 8)的海马和皮层(每只动物每个部位检测10-12张切片)的老年斑面积。结果如图9所示，统计学分析表明，注射多肽)(D4(AD+XD4)组的海马和皮层的老年斑面积所占比例(视野中老年斑面积占整个视野的比例)分别为3.3%和2.1% ；注射 PBS组(AD+con)的海马和皮层的老年斑面积所占比例分别为12. 2%和10.9% ；
可以看出，注射多肽)(D4的小鼠老年斑面积占切片面积的比例显著减少(与注射 PBS 组相比，*，P < 0. 01)。
3.XD4降低AD转基因小鼠脑内Αβ 40和Αβ 42水平
上述1的注射多肽)(D4(AD+XD4)组、注射PBS组(AD+con)实验小鼠的脑组织在含有蛋白酶抑制剂的pH7. 2PBS(蛋白酶抑制剂，Calbiochem公司，产品目录号为=539131, 100倍稀释)中勻浆。然后以15000rpm离心30min，收集上清。沉淀加入5M的盐酸胍(以 tris-HCl缓冲液配制，pH8. 0)。然后离心处理，收集上清。
溶于和不溶于PBS的Αβ 40和Αβ 42水平由试剂盒(Invotrigen，USA，产品目录号分别为KHB3441和KHB3482)以ELISA方法测定OD值和A β标准曲线。A β水平按照每克脑组织含有的Αβ量(ng或mg)表示。Αβ 40和Αβ 42的标准曲线的函数分别为
y = 625x-14. 8 ;y = 636. 62χ-7. 150 χ 为 OD 值，y 为 A β 40 或 A β 42 的质量。
结果见图10-12，图10中，注射)(D4多肽的AD转基因小鼠(AD+XD4)、注射PBS多肽的AD转基因小鼠(AD+con)脑中可溶性A β 40的含量分别为28. 2ng/g脑蛋白和119ng/ g细胞蛋白；
图11中注射Η)4多肽的AD转基因小鼠(AD+XD4)、注射PBS多肽的AD转基因小鼠 (AD+con)脑中可溶性A β 42的含量分别为0. 91ng/g脑蛋白和2. 35ng/g脑蛋白；
图12中为注射)(D4多肽的AD转基因小鼠(AD+XD4)、注射PBS多肽的AD转基因10小鼠(AD+con)脑中不溶性A β 40含量分别为5. 8mg/g脑蛋白和9. 5mg/g脑蛋白，不溶性 A β 42含量分别为7. 5mg/g脑蛋白和11.2mg/g脑蛋白；
结果表明AD小鼠注射)(D4后脑内可溶性A β 40 (图10)和A β 42 (图11)水平及不溶性Aβ 40和Αβ 42水平(图12)都明显低于不注射)(D4的AD小鼠。
四、》)4促进细胞对六3的吞噬
用含10%胎牛血清的DMEM培养基(DMEM，Invotrigen，产品目录号为21969)将 BV-2细胞(中国医学科学院肿瘤细胞库，产品目录号为BV-2)配成单个细胞悬液，以每孔 10000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔体积100 μ L0细胞于37°C培养M小时，培养箱 CO2浓度为5 %，然后分别加入如下三种物质
Αβ42 Αβ42蛋白的终浓度是0. ΙμΜ ；
Αβ42 )(D4(摩尔比)=1 20 :Α β 42蛋白的终浓度是0. 1 μ M ; )4的终浓度为 2μΜ ；
Αβ42 )(D4(摩尔比)=1 50 :Α β 42蛋白的终浓度是0. 1 μ M ; )4的终浓度为 5μΜ ；
Αβ42 )(D4(摩尔比)=1 200 :Α β 42蛋白的终浓度是0. 1 μ M ; )4的终浓度为 20 μ M ；
对照多肽(序列为SMSARQL由吉尔生化(上海)有限公司合成)Αβ 42蛋白的终浓度是0. 1 μ M ；对照多肽的终浓度为20 μ M ；
细胞继续培养4小时后，收集细胞。应用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液(蛋白酶抑制剂，Calbiochem公司，产品目录号为539131，100倍稀释。细胞裂解液，北京博奥森生物技术有限公司，产品目录号为C-0013)处理细胞，收集细胞提取液。应用Αβ检测盒 (Invotrigen, USA，产品目录号分别为:KHB3441和KHB3482)测定细胞内的Αβ 42水平。
结果见图13，
加入A β 42的细胞中A β 42含量为54. 7ng/g细胞蛋白；
加入A β 42 )(D4(摩尔比)=1 20的细胞中A β 42含量为69. lng/g细胞蛋白；
加入A β 42 )(D4(摩尔比)=1 50的细胞中A β 42含量为75. 3ng/g细胞蛋白；
加入A β 42 )(D4(摩尔比)=1 200的细胞中A β 42含量为82. 6ng/g细胞蛋白；
加入多肽对照(阴性对照多肽)的细胞中Αβ 42含量为61. 2ng/g细胞蛋白；
随着加入的)(D4浓度升高，BV-2细胞内的A β 42水平逐渐升高，表明)(D4具有促进小胶质细胞吞噬A β的作用(与只加入A β 42的细胞样品相比，*，P < 0. 05 ；#,Ρ < 0. 01)。
研究显示，)(D4在体外可以明显抑制A β的细胞毒性并增加小胶质细胞对A β的吞噬作用。应用AD转基因动物进行的体内实验结果表明，)(D4可以明显改善小鼠的空间记忆能力，减少脑内老年斑的数量，并降低A β 40和A β 42的水平。)(D4分子量很小，易穿过血脑屏障发挥疗效，并且抗原性较差，副作用较小，是一条极具AD治疗潜力的多肽。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种多肽，是如下1)或2)1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列1衍生的多肽。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于2)所示的多肽为如下a、b、c中的任意一种a、由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的多肽；b、由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的多肽；c、由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的多肽。
3.一种抑制Αβ细胞毒性制剂，其活性成分为权利要求1或2所述多肽；所述细胞具体为3!1-3￥5￥细胞，所述六0具体为A β 42。
4.一种促进小胶质细胞清除A β的制剂，其活性成分为权利要求1或2所述多肽；所述小胶质细胞具体为BV-2细胞；所述A β具体为A β 42。
5.一种治疗阿尔茨海默病的产品，其活性成分为权利要求1或2所述多肽；所述产品具体为药物。
6.权利要求1或2所述多肽在抑制Aβ的细胞毒性和/或制备抑制A β细胞毒性制剂中的应用；所述细胞具体为3^￥5￥细胞，所述4 0为具体Αβ42。
7.权利要求1或2所述多肽在促进小胶质细胞吞噬Aβ或制备促进小胶质细胞清除 Αβ的制剂中的应用；所述Αβ具体为Αβ42。
8.权利要求1或2所述多肽在制备治疗阿尔茨海默病的产品中的应用；所述产品具体为药物。
全文摘要
本发明公开了一种结合A-beta淀粉样蛋白的多肽与应用。本发明提供的多肽，是如下1)或2)1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列1衍生的多肽。本发明的实验证明，该多肽易穿过血脑屏障，并且相比其它大分子蛋白如抗体等抗原性较差，副作用较小，在阿尔茨海默病的治疗方面具有广泛的应用前景。
文档编号A61P25/28GK102516357SQ20111039665
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月2日 优先权日2011年12月2日
发明者刘瑞田, 薛頔, 赵敏 申请人:清华大学