专利名称：银杏活性成分萃取分离方法及萃取的活性物质在治疗心脑血管疾病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及从植物中提取有效成分的方法，具体是从银杏叶中提取有效活性成分黄酮类和萜内酯类化合物的方法，及利用有效提取物银杏内酯研究其对机体血压、心脏血流动力学及单个心肌细胞收缩力的影响，属中药技术制备领域。
背景技术：
心脑血管疾病是危害人类健康的主要疾病，其发病率和死亡率有逐年增加的趋势，无论在我国还是西方发达国家，均已超过肿瘤而居于人类死因的首位。银杏叶制剂的有效成份主要为黄酮及萜内酯类，简称银杏叶提取物((ΛΕ)，萜内酯化合物可以再分为银杏内酯和白果内酯(BiIokilide)，银杏内酯再分为A、B、C、J、M五种， 白果内酯仅一种。银杏酸是银杏叶提取物毒性作用的因素，这些毒性作用包括胃肠道副作用、头痛、皮肤刺激和水肿，已有多例在接触银杏叶或果实后出现过敏反应的报告。从技术先进性角度来看，银杏叶制剂至今已经历了大约五个发展阶段，即第一代将银杏叶烘干，粉碎原生药压片；第二代将银杏叶用水提取后浓缩成膏，然后烘干、治粒压片，但对其中的主要有效成分银杏黄铜和银杏内酯没有进行控制；第三代在第二代的基础上对主要有效成分银杏黄酮和银杏内酯进行定性控制，但无有害成分银杏酸含量标示； 第四代控制有效成分银杏黄酮在44%以上，银杏内酯在6%以上，有害成分银杏酸控制在 5ppm以下。中国药有效成分银杏黄酮在以上，银杏内酯在6%以上，有害成分银杏酸控制在IOppm以下；第五代控制典2010版要求银杏叶提取物中含总黄酮醇苷不得少于对％，含总内酯不得少于6%，银杏酸含量小于IOppm;美国药典对此要求是总黄酮醇苷为 22-27%，含总内酯为5. 4-12%，银杏酸含量小于IOppm ；德国药典对此要求是总黄酮醇苷为22-27%，含总内酯为5-7%，银杏酸含量小于lOppm。由此可见，控制好总黄酮醇苷、总内酯和银杏酸的含量是银杏叶提取物质量的关键因素。银杏叶提取物主要药理作用有黄酮甙作为一种高效抗氧化物能清除自由基，抑制脂质过氧化；银杏内酯可拮抗血小板因子引起的血小板聚集、微血栓的形成，还可改变血液流变学，降低血液粘度，改变微循环障碍；增加5-羟色胺的传送，对脑部血液循环及脑细胞代谢有改善和促进作用；目前临床上主要用于1)防治冠心病、心绞痛、心肌梗死；2)防治脑血栓、脑血管痉挛，脑外伤后遗症；幻改善老年人记忆力衰退和信息处理速度的降低问题；延缓早老性痴呆的发生；4)缓解眩晕、耳鸣和因血流减少所致的视力和听力衰退。DE-A3338995和相关美国专利号4，571，407使用白果内脂，一种结构与银杏内酯相关的倍半萜内酯治疗脑病，脑水肿，脱鞘神经病和脊髓病，在中脑动脉闭合前使用白果内酯在梗塞部位，皮质和梗塞面积明显减小。美国专利号5，264, 216采用白果内酯能治疗下列病菌的某些感染阴道毛滴虫、大肠杆菌、乳酸杆菌、卡氏肺囊虫、金黄色葡萄球菌、类链球菌。银杏叶提取物具有扩张冠状动脉和脑血管作用，能够改善微循环，促进心脑组织代谢，临床上使用银杏叶制剂治疗心血管疾病已经多年，例如可以治疗高血压等心血管病，治疗机制不是十分清楚。
发明内容
本发明提供一种银杏活性成分萃取分离方法，减少有毒有机溶剂的使用，提高有效成分得出率、各单体纯度。本发明的技术方案如下本发明从干银杏叶中提取分离有效成分方法的步骤如下1)银杏叶活性成分黄酮类和萜内酯类化合物的提取银杏干叶磨粉，用70%乙醇以7倍量微沸提取两次，每次提取2小时，减压回收乙醇，水沉，过DAlOl大孔树脂柱，水洗， 40%乙醇溶液以lBV/h的速度洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，干燥粉碎即得银杏叶提取物。所得银杏叶提取物总黄酮和总内酯含量分别在和6%以上。2)、去除银杏酚酸采用溶剂法或树脂法；溶剂法将步骤1)所得洗脱液，调节PH值为5，以石油醚为萃取剂萃取5次，取水相，加一半体积95%乙醇减压蒸馏，即得低酸银杏叶提取物；树脂法银杏叶提取物粉末50%乙醇溶解(乙醇的用量以刚好使得银杏叶提取物全溶)，盐酸调节PH为5，过AB-8柱70 %乙醇洗脱，水沉IOh取清液，浓缩干燥粉碎，得低酸银杏叶提取物。3)、银杏黄酮与内酯的粗分离采用溶剂法或树脂法；溶剂法粗分离黄酮与内酯方法是取银杏叶提取物，少量乙醇溶液溶解，缓慢加入有机溶剂正丁醇，过滤，取滤液，3 %氨水溶液洗涤，浓缩回收有机相，酸化，减压干燥得内酯；减压蒸发弱碱洗涤液，盐酸酸化，结晶，减压干燥结晶，干燥结晶，得黄酮。树脂法粗分离黄酮与内酯方法是将银杏叶提取物用20%乙醇溶解，调节PH值为 4. 5，过聚酰胺树脂柱，先以蒸馏水洗柱20min，速率lBV/h，分别以10%和60%的乙醇溶液梯度洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，蒸发干燥，分别得黄酮与内酯。4)纯化内酯即银杏内酯的族分离利用高效液相色谱法纯化内酯流动相选择体积比为55 40 5的乙酸乙酯、石油醚和甲醇的混合溶剂，流速为^ml/min，上样量为 120mg。本发明上述方法制备出纯度大于98%的4种内酯；银杏叶提取物中银杏酸含量控制在Ippm以内，达到了国际标准；分离后银杏黄酮的含量达到55%以上，银杏内酯含量达到25%以上。本发明所提取的高纯度银杏内酯在治疗心脑血管疾病药物中的应用。本发明的有益效果是本发明利用高效液相色谱法制备出了纯度大于98%的4种内酯。成功的把银杏叶提取物中银杏酸含量控制在Ippm以内，实现了黄酮与内酯的分离， 分离后银杏黄酮的含量达到55%以上，银杏内酯含量达到25%以上，达到了国际标准。
图1-1是白果内酯对SD大鼠动脉血压的影响；图1-2是白果内酯对SD大鼠收缩压的影响；图1-3是白果内酯对SD大鼠舒张压的影响；
图1-4是白果内酯对SD大鼠脉压的影响；图1-5是白果内酯对SD大鼠平均动脉压的影响；图1-6是白果内酯对SD大鼠心率的影响；图2-1是白果内酯对老年SD大鼠收缩压的影响；图2-2是白果内酯对老年SD大鼠舒张压的影响；图2-3是白果内酯对老年SD大鼠脉压的影响；图2-4是白果内酯对老年SD大鼠平均动脉压的影响；图2-5是白果内酯对老年SD大鼠心率的影响；图3-1是白果内酯抑制SD大鼠离体心脏血流动力学趋势；图5-3是白果内酯对心肌细胞收缩的抑制作用具有剂量依赖性；图6-1是单个游离老年心肌细胞在加入白果内酯前后心肌收缩幅度的变化。
具体实施例方式以下结合具体实施例来说明本发明的技术方案，但不限制本发明的保护范围。实施例1 1)将银杏干叶粉碎，取银杏叶粗粉(粒度Φ0. 8-2. 0mm) 100g，70%乙醇以7倍量微沸提取2次，每次提取池，提取物质量为40. lg，对黄酮和内酯的提取率分别为80. 8%和 77. 2%2)取银杏叶乙醇提取滤出液约1000ml，减压蒸馏回收乙醇，水沉过滤，以lBV/h流速上质量为500g大孔树脂DlOl吸附柱，IOOOml水洗柱，然后用质量分数70%的乙醇水溶液梯度洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，蒸发至干，所得粗提取物总黄酮纯度达到25. 6%, 总内酯纯度达到6.3%。3)萃取法除酸，取实验所得大孔树脂洗脱液200ml，浓缩，以质量分数盐酸调节pH值至5. 12，用石油醚萃取5次，取水相，加一半水相体积95 %乙醇减压蒸馏，得浸膏， 检测银杏酚酸含量为0. 99ppm。4)银杏黄酮与内酯的粗分离取银杏叶提取物50g，少量乙醇溶液溶解，对应加入5倍质量正丁醇，过滤，取滤液，质量分数3%氨水洗涤洗涤，浓缩回收有机相，酸化，减压干燥得内酯；减压蒸发弱碱洗涤液，盐酸酸化，结晶，干燥结晶，得黄酮。药典法检测黄酮和内酯的含量分别为58. 66%和 27. 30%。5)纯化内酯实验室自制的银杏内酯粗提物，精制后，总内酯含量约为50%，其中BB、GA、GB、GC 含量约为15. 5^,14.5^,8.6^,11.8 ^银杏内酯精制过程银杏叶提取物粉末(总黄酮 >对％，总银杏内酯>6%) 3倍量50%乙醇溶解，过聚酰胺柱，10%乙醇洗脱，浓缩洗脱液， 5倍水稀释，正丁醇萃取2次，质量分数5%乙酸钠溶液洗涤2次，取有机相浓缩得银杏内酯
精制浸膏。取银杏精制浸膏以体积比为55 40 5的乙酸乙酯、石油醚和甲醇混合溶液超声溶解，经0. 45 μ m滤膜抽滤后进样，上样量为120mg，流动相流速为^ml/min，进行高效液相制备色谱分离。按制备型色谱条件洗脱，根据蒸发光散射检测器的检测信号在线收集产
5品流出液，各流出液经旋转薄膜蒸发器浓缩去溶剂后，将固体粉末进行重结晶。BB、GC用无水乙醇，GA、GB用质量分数95%乙醇溶液重结晶纯化。银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯 C、白果内酯经过一次重结晶纯度分别为98. 7%、98. 4%、98. 4%、98. 5%。实施例2(应用试验)(一 )成年大鼠大体水平的研究成年SD大鼠(由徐州医学院实验动物中心提供)，体重200 250g，雌雄不拘，月龄4 6月，随机分为4组(每组7-11只)。生理盐水组；DMSO对照组；白果内酯组；心得安组。腹腔注射10%的水合氯醛％il/kg麻醉大鼠。经颈总动脉插管，连接压力换能器，与 MedLab-U/4C501生物信号采集处理系统相连接。白果内酯(纯度达98. 5% )用DMSO溶液配置，每次加入DMSO的量不超过1%。，以ang/kg的白果内酯10-2mol/L浓度经股静脉注射给药；心得安(购自Sigma公司)以生理盐水配制，以0. 3mg/kg的心得安1 μ mol/L浓度经股静脉注射给药。以MedLab-U/4C501生物信号采集处理系统记录大鼠收缩压、舒张压及心率变化。结果经股静脉给药后，SD大鼠收缩压、舒张压、平均动脉压迅速降低，、心率迅速减慢，脉压升高，以后缓慢恢复正常。记录2分钟以内收缩压、舒张压、平均动脉压、心率下降最低值( 之内平均值)统计如下白果内酯对SD大鼠动脉血压的影响，见图1-1。以下各图*表示P < 0. 05广表示P < 0. 01。(1)白果内酯对SD大鼠收缩压的影响给药后，白果内酯组与生理盐水组(对照组)作统计学比较，收缩压明显下降， P <0.01，存在显著性差异；心得安组与生理盐水组作统计学比较，收缩压明显下降，P
<0.01，存在显著性差异；白果内酯组与心得安组作统计学比较，不存在显著性差异；白果内酯对SD大鼠收缩压的影响，见图1-2。(2)白果内酯对SD大鼠舒张压的影响给药后，白果内酯组与生理盐水组(对照组)作统计学比较，舒张压明显下降，P
<0. 01，存在显著性差异；心得安组与生理盐水组比较，舒张压明显下降，P < 0. 01，存在显著性差异；白果内酯组与心得安组比较，不存在显著性差异。白果内酯对SD大鼠舒张压的影响，见图1-3。(3)白果内酯对SD大鼠脉压的影响给药后，白果内酯组与生理盐水组(对照组)作统计学比较，脉压明显升高，P
<0. 01，存在显著性差异；心得安组与生理盐水组比较，脉压明显升高，P < 0. 05，存在显著性差异；白果内酯组与心得安组比较，不存在显著性差异。白果内酯对SD大鼠脉压的影响， 见图1-4。(4)白果内酯对SD大鼠平均动脉压的影响给药后，白果内酯组与生理盐水组(对照组)作统计学比较，平均动脉压明显下降，P < 0. 01，存在显著性差异；心得安组与生理盐水组比较，平均动脉压明显下降，P <0.01，存在显著性差异；白果内酯组与心得安组比较，不存在显著性差异。白果内酯对SD 大鼠平均动脉压的影响，见图1-5。(5)白果内酯对SD大鼠心率的影响给药后，白果内酯组与生理盐水组(对照组)作统计学比较，SD大鼠心率明显减慢，P < 0.01，存在显著性差异；心得安组与生理盐水组比较，SD大鼠心率明显减慢，P <0.01，存在显著性差异；白果内酯组与心得安组比较，不存在显著性差异。白果内酯对SD 大鼠心率的影响，见图1-6。结论本研究结果表明，白果内酯对麻醉状态SD大鼠有降低收缩压、舒张压、平均动脉压作用，脉压增大，减慢心率作用。( 二 )老年大鼠大体水平的研究老年SD大鼠由徐州医学院实验动物中心提供，体重(500 600) g，月龄18个月以上，选取收缩压> 115mmHg的SD大鼠(高血压模型)，雌雄不拘。实验方法与成年SD大鼠研究方法相同。结果经股静脉给药后，老年SD大鼠的收缩压、舒张压、平均动脉压迅速降低，心率迅速减慢，脉压升高，以后缓慢恢复正常。记录anin以内收缩压、舒张压、平均动脉压、心率下降最低值(5s之内平均值)统计如下以下各图*表示P < 0. 05广表示P < 0. 01。(1)白果内酯对老年SD大鼠收缩压的影响给药后，白果内酯组与生理盐水组(对照组)作统计学比较，老年SD大鼠收缩压明显下降，P < 0. 01，存在显著性差异；心得安组与生理盐水组作统计学比较，老年SD大鼠收缩压明显下降，P < 0.01，存在显著性差异；白果内酯组与心得安组作统计学比较，不存在显著性差异；白果内酯对老年SD大鼠收缩压的影响，见图2-1。(2)白果内酯对老年SD大鼠舒张压的影响给药后，白果内酯组与生理盐水组(对照组)作统计学比较，老年SD大鼠舒张压明显下降，P < 0. 01，存在显著性差异；心得安组与生理盐水组比较，老年SD大鼠舒张压明显下降，P<0. 01，存在显著性差异；白果内酯组与心得安组比较，不存在显著性差异。白果内酯对老年SD大鼠舒张压的影响，见图2-2。(3)白果内酯对老年SD大鼠脉压的影响给药后，白果内酯组与生理盐水组(对照组)作统计学比较，老年SD大鼠脉压明显升高，P < 0. 01，存在显著性差异；心得安组与生理盐水组比较，老年SD大鼠脉压明显升高，P<0. 05，存在显著性差异；白果内酯组与心得安组比较，不存在显著性差异。白果内酯对老年SD大鼠脉压的影响，见图2-3。(4)白果内酯对老年SD大鼠平均动脉压的影响给药后，白果内酯组与生理盐水组(对照组)作统计学比较，老年SD大鼠平均动脉压明显下降，P <0.01，存在显著性差异；心得安组与生理盐水组比较，老年SD大鼠平均动脉压明显下降，P < 0.01，存在显著性差异；白果内酯组与心得安组比较，不存在显著性差异。(4)白果内酯对老年SD大鼠平均动脉压的影响，见图2-4。(5)白果内酯对老年SD大鼠心率的影响给药后，白果内酯组与生理盐水组(对照组)作统计学比较，老年SD大鼠心率明显减慢，P < 0. 01，存在显著性差异；心得安组与生理盐水组比较，老年SD大鼠心率明显减慢，P<0. 01，存在显著性差异；白果内酯组与心得安组比较，不存在显著性差异。白果内酯对老年SD大鼠心率的影响，见图2-5。结论本研究结果表明，白果内酯对麻醉状态老年SD大鼠有降低收缩压、舒张压、平均动脉压作用，脉压增大，减慢心率作用。(三)成年大鼠器官水平的研究成年SD大鼠由徐州医学院实验动物中心提供，体重200 250g，雌雄不拘，月龄 4 6月。腹腔注射3%戊巴比妥钠GOmg · kg—1)麻醉，迅速取出大鼠心脏，剪去左心耳，置于Langendorff灌流装置上，行主动脉逆行灌注Krebs Henseleit (K H)液(NaCl 119. lmmol/L,KCl 4. 7mmol/L, MgSO4O. 94mmol/L, KH2PO4L 2mmol/L, NaHC0325. Ommol/L，葡萄糖 11. 5mmol/L, VitCO. lmmol/L，用前 10 15min 通95 % 02+5 % CO2 混和气，平衡 pH至 7. 4)， 37°C恒温，Sml/min恒流灌注。经房室瓣插入带球囊的心导管抵左室，充盈球囊使左心室舒张末压小于lOmmHg。接压力换能器并输入计算机，记录心脏收缩期左心室峰压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP)和心率(Η 。平衡30min后，测定(K H)液灌流60min及给药罐流 60mino结果白果内酯抑制SD大鼠离体心脏血流动力学趋势，见图3-1。(1)白果内酯与对照组比较，抑制SD大鼠离体心脏HR，统计学处理P < 0.01，存在显著性差异。( 白果内酯与对照组比较，抑制SD大鼠离体心脏LVSP，统计学处理P <0.01，存在显著性差异。( 白果内酯与对照组比较，提高SD大鼠离体心脏LVEDP，统计学处理P < 0. 01，存在显著性差异。见表3-1 ；*表示P < 0. 05广表示P < 0. 01。
权利要求
1.一种银杏活性成分的萃取分离方法，以干银杏叶为原料制取，包括以下工艺步骤1)银杏叶活性成分黄酮类和萜内酯类化合物的提取银杏干叶磨粉，用70%乙醇以7 倍量微沸提取两次，每次提取2小时，减压回收乙醇，水沉，过DAlOl大孔树脂柱，水洗，40% 乙醇溶液以lBV/h的速度洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，干燥粉碎即得银杏叶提取物；2)去除银杏酚酸采用溶剂法除酸，所述溶剂法除酸是浓缩步骤1)所得洗脱液，调节 PH值为5，以石油醚为萃取剂萃取5次，取水相，加一半水相体积的95%乙醇减压蒸馏，即得低酸银杏叶提取物；3)银杏黄酮与内酯粗分离采用溶剂法分离；所述溶剂法分离黄酮与内酯是取银杏叶提取物，用乙醇溶液充分溶解，缓慢加入有机溶剂正丁醇，过滤，取滤液，用3 %氨水溶液洗涤，浓缩回收有机相，酸化，减压干燥得内酯；减压蒸发弱碱洗涤液，盐酸酸化，结晶，减压干燥结晶，干燥结晶，得黄酮；4)纯化内酯，即银杏内酯的族分离利用高效液相色谱法纯化内酯流动相选择体积比为55 40 5的乙酸乙酯、石油醚和甲醇的混合溶剂，流速为^ml/min，上样量为 120mg。
2.根据权利要求1所述的银杏活性成分的萃取分离方法，其特征在于步骤2)去除银杏酚酸还可以采用树脂法除酸，具体为银杏叶提取物粉末50%乙醇溶解(乙醇的用量以刚好使得银杏叶提取物全溶)，盐酸调节PH为5，过AB-8柱70%乙醇洗脱，水沉IOh取清液， 浓缩干燥粉碎，得低酸银杏叶提取物。
3.根据权利要求1所述的银杏活性成分的萃取分离方法，其特征在于步骤幻银杏黄酮与内酯粗分离还可以采用树脂法分离，具体方法是将银杏叶提取物用20%乙醇溶解，调节PH值为4. 5，过聚酰胺树脂柱，先以蒸馏水洗柱20分钟，速率lBV/h，分别以10%和60% 的乙醇溶液梯度洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，蒸发干燥，分别得黄酮与内酯。
4.本发明所提取的高纯度银杏内酯在治疗心脑血管疾病药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种银杏活性成分萃取分离方法及萃取的活性物质在治疗心脑血管疾病药物中的应用。包括如下步骤1)银杏干叶磨粉，提取银杏叶活性成分黄酮类和萜内酯类化合物；2)去除银杏酚酸；3)分离银杏黄酮与内酯；4)高效液相色谱法纯化内酯。利用提取的高纯度银杏内酯药物分别在器官水平、大体水平和细胞水平其对成年大鼠和老年大鼠的心功能试验，首次证明白果内酯对SD成年大鼠及SD老年大鼠皆有心脏保护作用。其优点利用高效液相色谱法制备出纯度大于98％的4种内酯。成功的把银杏叶提取物中银杏酸含量控制在1ppm以内，实现了黄酮与内酯的分离，分离后银杏黄酮的含量达到55％以上，银杏内酯含量达到25％以上，达到国际标准。
文档编号A61K36/16GK102416027SQ20111040414
公开日2012年4月18日 申请日期2011年12月1日 优先权日2011年12月1日
发明者刘勇林, 孙红, 布会敏, 李保民 申请人:徐州医学院