专利名称：地锦草乙醇提取物在制备扩血管药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种地锦草乙醇提取物的应用，尤其涉及地锦草提取物在制备扩血管药物中的应用。
背景技术：
高血压是全球性常见的心血管疾病，患病率高，相关并发症导致的死亡率和病残率又位于人类疾病的前列，对人类健康危害极大，给社会和家庭带来极大的负担[1]。据全国普查结果和我国心血管病调查报告显示，1991年我国高血压的发病率为11. 9%，而到2004 年发病率则上升到18. 8% ；目前我国高血压患者已经超过1. 6亿，而且还在快速增长趋势， 给社会造成了巨大负担。高血压作为心脑血管事件的重要危险因素，如不合理有效的治疗， 任其发展，必将导致心、脑、肾、血管等靶器官损害，引发心脑血管事件。高血压治疗的目的不仅仅是降低血压，更重要的是保护靶器官，降低心血管病的发生率、病死率和致残率， 改善病人生活质量，延长患者寿命。现有降血压药物只能缓解症状，且药物依赖性较强，副作用大。而中药毒副作用较小，且资源丰富，开发应用前景广阔。近十年来，从天然产物中寻找新的有生理活性的成分或先导化合物以开发新药或保健食品成了全球关注和研究的热点；寻求新一代低毒、多靶点天然降血压药物资源并对其功能因子进行剖析，进而开发生产出扩血管的新药可望成为治疗高血压、冠心病等血管性疾病的新途径。地锦草为大戟科大戟属地锦(Aopoi^ia Awsi/^a Willd)或斑地锦(五maculata L.)的干燥全草。历版《中国药典》和《本草纲目》均收载地锦草。主要化学成分为黄酮类， 如槲皮素及其单糖苷、异槲皮苷、黄芪苷等；香豆素类，有东莨菪素、伞形花内酯、泽兰内酯； 有机酸类，有没食子酸及棕榈酸等。已研究证实，地锦草具有抗菌、止血、抗氧化、保肝、抑制肾功能损伤、抗肿瘤、降血压等作用[1’ 2]。临床实践和实验研究已证实，地锦草对细菌性痢疾、慢性结肠炎、腹泻、子宫出血、支气管出血、胃出血等具有良好的疗效。但是，地锦草作为清热解毒药是否可以单独用于心脑肾等血管性并发症的治疗迄今为止尚不清楚。地锦草扩血管药物的制备与开发，将能丰富我国的新药市场，提高人民的健康生活水平，也必将产生良好的经济效益。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供了中药地锦草乙醇提取物在制备扩血管药物中的应用。所述地锦草乙醇提取物在制备降低血压药物中的应用。所述地锦草乙醇提取物与药用赋形剂组合制备成制剂。所述制剂的剂型为固体制剂。所述固体制剂为片剂、胶囊剂、滴丸剂中的任一种。所述胶囊剂为软胶囊。所述制剂的给药形式为口服给药。
为观察地锦草乙醇提取物对动脉的直接调节作用，本发明采用离体血管张力测定方法，以排除活体实验中各种神经、体液因素对地锦草扩血管作用的影响。结果发现，地锦草乙醇提取物对离体主动脉环具有浓度依赖性舒张作用，该作用是由内皮依赖性NO-CGMP 途径介导的，其机制可能通过以下3种机制发挥作用(1)激活Akt-eNOS信号通路促进内皮细胞释放一氧化氮(NO)的机制；(2)通过钙池操纵的Ca2+内流(store-operated Ca2+ entry, SOCE)激活eNOS来促进内皮细胞释放NO的机制；(3)部分与血管平滑肌上大电导钙激活钾通道开放有关。根据以上研究发现，地锦草乙醇提取物具有内皮依赖性扩张动脉的新的药理作用，可舒张血管平滑肌，适用于治疗高血压和冠心病等血管性疾病。本发明的潜在效果是(1)对传统中药地锦草的新的药理作用进行二次开发，拓展地锦草的药用范围；(2)利用地锦草的扩血管作用，将地锦草乙醇提取物应用于制备治疗高血压等血管性疾病的药物。说明书附图
图1为示出地锦草乙醇提取物(EEH)对苯肾上腺素(PE)预收缩的内皮完整(+Endo)和内皮去除(-Endo)主动脉环舒张反应的影响(A)及一氧化氮合成酶抑制剂L-NAME和鸟苷酸环化酶抑制剂ODQ预处理后对EEH使PE预收缩内皮完整主动脉环产生的舒张反应的影响 (B)的图表；
图2为示出无钙液中(A)和L型钙通道阻断剂diltiazem预处理后(B)EEH使PE预收缩内皮完整主动脉环产生舒张效应的影响的图表；
图3为示出钙池操纵的Ca2+内流(strore-operated Ca2+ entry，S0CE)调节剂预处理后EEH对PE预收缩内皮完整主动脉环舒张功能的影响的图表；
图4为示出Akt信号阻断剂wortmarmin预处理后EEH对PE预收缩内皮完整主动脉环舒张功能的影响的图表；
图5为示出不同钾通道阻断剂预处理后EEH对PE预收缩内皮完整主动脉环舒张功能的影响的图表；
图6为示出环氧合酶抑制剂吲哚美辛预处理后EEH对PE预收缩内皮完整主动脉环舒张功能的影响的图表。
具体实施例方式下面结合实施例和附图对本发明详细说明。实施例1大鼠离体主动脉环的制备 1.实验药物
地锦草购于山东泰安中药材有限公司，经泰山医学院中药教研室鉴定；地锦草乙醇提取物(EEH)由泰山医学院药物研究所制备。药材加入8倍量乙醇，回流提取2次，每次50 min,合并滤液，过滤，浓缩，冷冻干燥至干。2.实验步骤
清洁级雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，体重25(T300 g，由山东济宁鲁抗公司提供， 动物合格证号SCXK鲁20080002。迅速游离SD大鼠胸主动脉，置于4°C含95% O2和5% CO2,混合气体预饱和的K-H液中，剔除周围结缔组织，剪成2-3 mm长的血管环。根据实验需要，采用棉签磨擦血管环内表面去除内皮细胞，将部分血管环制备成去内皮的模型。将血管环悬挂于经37 °C预热容量为5 mL K-H液的浴槽内，一端固定，一端通过张力换能器连接Medlab生物信号采集系统。 在持续通95% O2和5% CO2混合气体的状态下，调节其基础张力至1. 0 g，并在37°C下稳定60 min，期间每15 min换液1次。用60 mmol .L—1 KCl刺激达峰值，然后用K-H液冲洗， 重复3次，以诱发血管环的最大收缩幅度。待血管环重新稳定后，用1 μπιο ·!/1苯肾上腺素(phenyl印hrine，ΡΕ)收缩血管环达峰值，加入1 μ mol Γ1乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)检验血管内皮完整性。加ACh后使PE预收缩的血管环舒张80%以上，可认为内皮完整；若加ACh后使PE预收缩的血管环不舒张或舒张10%以下，则认为内皮去除。以1 μ mol · Γ1 PE诱发最大收缩幅度为100%，以加入药物后的血管张力幅度与PE诱发最大收缩幅度之间的比率反映血管张力的变化。实施例2地锦草乙醇提取物(EEH)对离体主动脉环舒张功能的影响根据实例1的方法，血管环稳定后观察
(I)EEH对PE预收缩动脉环张力的影响(n = 6)
以PE (1 μ mol · L—1)预收缩血管达稳态后，采用累积加药法，每3 min加入地锦草乙醇提取物1次，观察累积加入EEH (0. Γ100 μ g -πιΓ1)对内皮完整和内皮去除血管环的作用。(2) L-NAME对EEH诱导的舒张反应的影响(/ = 6)
内皮完整的主动脉环用一氧化氮合酶抑制剂L-NAME (10 μ mol · L—1)预处理20 min 后，再用PE (1 μ mol .L—1)预收缩血管达稳态后，累计加入EEH (0. TlOO yg-mL-1)观察血管张力的变化。(3) ODQ对EEH诱导的舒张反应的影响(/ = 6)
内皮完整的主动脉环用鸟苷酸环化酶抑制剂ODQ (10 μ mol · L—1)预处理20 min后， 再用PE (1 ymol .Γ1)预收缩血管达稳态后，累计加入EEH观察血管张力的变化。(4)结果
地锦草乙醇提取物呈现出内皮依赖性血管舒张作用(见图1A)，该作用可被10 μ mol · Γ1 L-NAME和10 μ mol · Γ1 ODQ阻断(炉<0. 01)，说明其内皮依赖性舒张血管作用是由NO-cGMP途径介导的(见图1B)。实施例3细胞外钙离子内流和细胞内钙离子释放对EEH诱导的主动脉环舒张功能的影响
根据实例1的方法，血管环稳定后观察
(I)EEH对无钙液中PE预收缩动脉环张力的影响(m = 6)
在无钙液中，以1 ymol "Γ1 PE预收缩大鼠主动脉环，采用累积加药法，每3 min加入地锦草乙醇提取物1次，观察不同浓度EEH (0.广100 μ g -πιΓ1)对内皮完整血管环舒张作用的影响。(2) L-型钙通道阻断剂diItiazem对EEH诱导的血管舒张作用的影响(/ = 6)
内皮完整的主动脉环用L-型钙通道阻断剂diltiazem (10 μ mol化4)预处理20 min 后，再用PE (1 μ mol .L—1)预收缩血管达稳态后，累计加入EEH (0. TlOO yg-mL-1)观察血管张力的变化。
(3)胞内钙池操纵的Ca2+内流(SOCE)调节剂对EEH诱导的血管舒张作用的影响(/ =6)
内皮完整的主动脉环分别用SOCE激活剂thapsigargin (1 μ mol化―1)和SOCE抑制剂 GcT (10 μπιοΙ.Γ1) and 2-APB (75 μ mol .171)预处理 20 min 后，再用 PE (1 μ mol .171) 预收缩血管达稳态后，累计加入EEH (0.广100 μ g · mL—1)观察血管张力的变化。(4)结果
在无钙液中，EEH诱导的浓度依赖性血管环舒张效应明显被减弱(炉<0. 01)(见图2A)。 然而，L-型钙通道阻断剂diltiazemdO μ mol · L—1)预处理对EEH诱导的血管环舒张无明显影响(见图2B)。说明在EEH诱导的血管舒张中Ca2+内流不是经过L-型钙通道而是通过其他途径实现的。近来的研究表明[3]，SOCE在血管舒张和激活eNOS方面发挥重要作用。 然而，Dimmeler等报道[4]，非钙依赖性Akt_eN0S信号可激活eNOS。为证实EEH的血管舒张作用与钙依赖性之间的关系，用SOCE调节剂观察了其对血管舒张作用的影响。使用SOCE 激活剂thapsigargin (通过抑制肌质网/内质网Ca2+AIPase激活S0CE，an activator of SOCE via inhibition of sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase)予页处理内皮完整血管环20 min后，发现EEH的舒张血管作用被明显阻断(炉<0. 01)(见图3)。同样，SOCE抑制剂Gd3+和2-APB也明显阻断EEH诱导的血管舒张作用(炉<0. 01)(见图3)。 以上结果表明，地锦草乙醇提取物的舒张血管作用是通过激活SOCE-eNOS-cGMP信号途径来实现的。实施例4 Akt/eNOS信号通路对EEH诱导的主动脉环舒张功能的影响
根据上述实验结果，发现地锦草乙醇提取物是通过介导SOCE-eNOS-cGMP信号通路来发挥血管舒张作用的。然而，非钙依赖性Akt/eNOS信号通路是否参与其中目前尚不清楚。 因此，我们对地锦草乙醇提取物诱导的血管舒张作用与Akt信号分子的关系进行了考察。 且根据实例1的方法，血管环稳定后观察
(1)渥曼青霉素(wortmarmin)对EEH诱导的血管舒张作用的影响(/ = 6) 内皮完整的主动脉环用Akt信号阻断剂wortmannin (100 nmol · Γ1)预处理20 min 后，再用PE (1 μ mol .L—1)预收缩血管达稳态后，累计加入EEH (0. TlOO yg-mL-1)观察血管张力的变化。(2)结果
研究表明，生理状态下Akt磷酸化及其下游eNOS的磷酸化是内皮细胞合成NO的重要途径M。Dimmeler等报道[4]，非钙依赖性Akt-eNOS信号可激活eNOS。从蛋白质水平来看，eNOS具有Akt作用底物的一般特征，并受Akt的调控。为了验证地锦草乙醇提取物的血管舒张作用是否与非钙依赖性Akt信号途径有关，用Akt抑制剂观察了其对血管舒张作用的影响。用Akt抑制剂wortmannin预处理内皮完整血管环，发现wortmannin明显阻断 EEH诱导的血管舒张作用(炉<0.01)(见图4)。以上结果表明，地锦草乙醇提取物诱导的血管舒张作用是通过介导Akt-eNOS-cGMP信号途径实现的。实施例5钾通道对EEH诱导的主动脉环舒张作用的影响根据实例1的方法，血管环稳定后观察
(I)EEH对钾离子通道的影响
内皮完整血管环经钾通道阻断剂TEA 100 μ mol · Γ1,格列苯脲(glibenclamide) 10μ mol · L—1预处理20 min后，再用PE (1 μ mol · L—1)预收缩血管达稳态后，累计加入EEH (0.广100 μ g · mL-1)观察血管张力的变化。
(2)结果
血管平滑肌上主要有4种钾通道大电导钙激活钾通道(BKca )；电压依赖性钾通道( Kv)；内向整流钾通道(Kir) ；ATP敏感钾通道(Katp )。是血管平滑肌上运载外向电流的优势通道，在调节血管平滑肌舒缩和小动脉肌源性紧张方面有着重要作用，高血压时血管平滑肌的BK。a敏感性增高，但并不引起舒张反应，而是减弱阻力血管的收缩增强趋势；Katp 在一些血管平滑肌细胞生理状态下基础钾离子电流的形成中非常重要，可能涉及到血管张力的调节，在心血管疾病时Katp的表达会发生改变te_8]，近年研究显示钾通道已是原发性高血压基因治疗的新靶点。本实验结果发现，TEA和glibenclamide处理后EEH的舒张血管作用均被部分阻断(炉< 0.01)(见图5)。说明地锦草乙醇提取物舒张血管机制部分与血管平滑肌上大电导钙激活钾通道有关，而与ATP敏感钾通道无关。
实施例6环氧合酶途径对EEH诱导的主动脉环舒张作用的影响根据实例1的方法，血管环稳定后观察
(1)吲哚美辛(indomethacin)对地锦草乙醇提取物诱导的血管舒张作用的影响(/ =
6)
内皮完整血管环经环氧合酶抑制剂吲哚美辛10 μ mol · L—1预处理20 min后，再用PE (1 μ mol · L-1)预收缩血管达稳态后，累计加入EEH (0.广100 μ g · mL-1)观察血管张力的变化。(2)结果
探讨环氧合酶是否参与地锦草乙醇提取物的血管舒张作用，内皮完整的血管环用 indomethacin预处理后，发现地锦草乙醇提取物使PE预收缩的血管产生舒张的作用无明显的变化(见图6)。说明地锦草乙醇提取物的舒张血管作用与环氧合酶途径无关。本发明涉及的部分参考文献褚小兰，范崔生.地锦类中草药的化学成分和药理研究概况[J].中国野生植物资源，1998，17 (2) 18 ；张仁侠，张炳盛，孙永庆，等.斑地锦降压作用的初步研究[J].中国医药导报， 2009，6(34): 114-115 ；Parekh AB, Putney Jff, Jr. Store-operated calcium channels. Physiological Reviews,2005, 85， 757-810;Dimmeler S, Fleming I, Fisslthaler B, et al. Activation of nitric oxide synthase in endothelial cells by Akt—dependent phosphorylation. Nature, 1999, 399, 601-605.Fulton D, Gratton JP, McCabe TJ, et al. Regulation of endothelium-derived nitric oxide production by the protein kinase Akt. Nature, 1999，399( 10) : 597- 601.RenY, Xu X, Wang X. Altered mRNA expression of ATP-sensitive and inward rectifier potassium channel subunits in streptozotocin-induced diabetic rat heart and aorta. J Pharmacol Sci, 2003， 93 (4) : 4782483 ；[7]Chatterjee S, Al-Mehdi AB, Levitan I, et al. Shear stress increases expression of a Katp channel in rat and bovine puirnonary vascular endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol, 2003， 285 (4): C959-C967 ；RenYJ, Xu XH, Zhong CB, et al. Hypercholesterolemia alters vascular functions and gene expression of potassium channels in rat aortic smooth muscle cells. Acta Pharmacol Sin, 2001， 22 (3): 274—278。
权利要求
1.地锦草乙醇提取物在制备扩血管药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的地锦草乙醇提取物在制备扩血管药物中的应用，其特征在于地锦草乙醇提取物在制备降低血压药物中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的地锦草乙醇提取物在制备扩血管药物中的应用，其特征在于地锦草乙醇提取物与药用赋形剂组合制备成制剂。
4.根据权利要求3所述的地锦草乙醇提取物在制备扩血管药物中的应用，其特征在于所述制剂的剂型为固体制剂。
5.根据权利要求4所述的地锦草乙醇提取物在制备扩血管药物中的应用，其特征在于所述固体制剂为片剂、胶囊剂、滴丸剂中的任一种。
6.根据权利要求5所述的地锦草乙醇提取物在制备扩血管药物中的应用，其特征在于所述胶囊剂为软胶囊。
7.根据权利要求3所述的地锦草乙醇提取物在制备扩血管药物中的应用，其特征在于所述制剂的给药形式为口服给药。
全文摘要
本发明公开了中药地锦草乙醇提取物在制备扩血管药物中的应用，本发明的中药地锦草可与药效学允许的药用赋形剂组合制备成制剂，制剂主要为固体制剂，主要包括片剂、胶囊剂(含软胶囊)、滴丸剂。本发明研究证实，地锦草乙醇提取物具有浓度依赖性扩张动脉的新的药理作用，该作用通过内皮依赖性方式产生，其机制与Akt-和SOCE-eNOS-cGMP信号途径和部分与血管平滑肌上大电导钙激活钾通道开放有关。本发明利用地锦草提取物的扩血管作用，将地锦草用于不同血管性疾病的治疗，拓展了传统中药地锦草的药用范围，可用于心脑血管疾病治疗药物的制备。
文档编号A61K36/47GK102429952SQ20111040374
公开日2012年5月2日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年12月8日
发明者周广海, 文今福, 王婷婷, 金松南 申请人:泰山医学院