专利名称：一组动物源性阳离子抗菌肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一组新型动物源性阳离子抗菌肽及其衍生物在治疗细菌感染的应用， 抗菌肽可以抑制微生物的生长，并制备成药物组合物用于治疗和预防由多种微生物所引起的感染，其中所述微生物包括革兰氏阳性菌和革兰氏阳性菌。
背景技术：
细菌感染性一直是威胁人类生命的重要疾病之一，上个世纪30年代抗生素的发现并广泛应用于临床治疗，拯救了无数患者的生命(Neu，H.C. (1992) Science 257,1064-1073)。由于传统抗生素的大量使用导致了耐药病原微生物的迅速增长。因此， 现在亟待开发新型抗药物以应对世界范围内日益严重的病源菌的耐药性(Travis，J. 1994 Science 264,360-362) 细菌性感染的防治是长期以来困扰人们的重要难题，特别是细菌耐药性的出现， 更突出了问题的复杂性和解决问题的迫切性。由于阳离子抗菌肽作用机理独特，体外未有耐药菌株产生，且许多阳离子抗菌肽的抗菌谱广，对革兰氏阳性菌及阴性菌均有作用，使它极可能成为传统抗生素的理想替代品。抗菌肽在自然界分布广泛，是生物体产生的抵御外源性感染的内源性物质，历经数百万年而很少产生耐受性，具有作用迅速、高效、广谱等特点。因而当其发现之时，就引起了药学界及高科技生物产业界的关注(Koczulla AR, Bals R. 2003. Drugs 63,389-406)。抗菌肽是一类广泛存在于微生物及动植物体内的小分子多肽，通常由30多个氨基酸残基组成，分子量为2-7KDa。抗菌肽的杀菌机制在于它能破坏细菌的细胞膜，导致细胞内容物溢出，最终引起细菌死亡。阳离子抗菌肽可以代表一类新型的抗菌药物，虽然阳离子抗菌肽的作用机制还没有确定，但几乎所有两亲性阳离子抗菌肽都与细胞膜产生相互作用，因而细胞膜是众多抗菌肽的主要作用靶点。抗菌肽分子可在细胞膜上聚集而导致其通透性增加，致使细胞膜破裂而凋亡。因此，以细胞膜为靶点的抗菌肽几乎不产生耐药性，原因是产生抗药性需要细胞膜脂质成分发生实质性改变。目前，在众多抗菌肽中，阳离子型的牛乳铁蛋白素(Lactoferricin B)是最为常见的抗菌肽，特别是其抗菌核心序列Lactoferricin B4^9RRffQffR (Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg)依然有良好的抗菌活性，但是依然存在抗菌活性低、溶血毒性等问题。
发明内容
本发明目的是提供一种具有显著抑制细菌生长且长效、无溶血毒性的新型动物源性阳离子抗菌肽及其衍生物；以及提供具有人工合成方便，成本低的制备方法。
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本发明目的的另一目的是提供所述新型动物源性阳离子抗菌肽及其衍生物的用途。实现上述目的，本发明采用的技术手段是一组动物源性阳离子抗菌肽，其特征在于，是对天然牛乳铁素抗菌肽序列、结构分析的基础上设计合成，该抗菌肽序列包括
CQUT-a :Phe Arg Trp Trp Gln Arg ； CQUT-b :Arg Arg Gln Trp Phe Trp0一组动物源性阳离子抗菌肽系列，其特征在于，包括上述序列，还包括以上所述多肽或衍生物中N末端和/或C末端的修饰、氨基酸的取代、替换、环化、L-型氨基酸变D-型氨基酸、缺失或加入而得到的功能类似的多肽或拟肽。进一步，所述动物源性阳离子抗菌肽，在治疗细菌感染的应用。以及在抑制微生物的生长，并制备成药物组合物用于治疗和预防由多种微生物所引起的感染，其中所述微生物包括革兰氏阳性菌和革兰氏阳性菌。本发明在已有天然发现的抗菌肽序列Lactoferricin B4_9 RRffQffR的基础上，结合虚拟组合库设计技术，DNAstar, Bioedit, sequence logo等分析软件和网站，设计了一组含有6个氨基酸天然多肽序列，该组多肽相比LfcinB4_9极大提高了抗菌肽的杀菌和抑菌活性，且解决了 LfcinB4_9的溶血毒性问题。相比天然动物源型阳离子抗菌肽，本发明具有显著抑制细菌生长且长效、无溶血毒性的作用。本发明的一组动物源性阳离子抗菌肽还包括以上所述多肽或衍生物中N末端和/ 或C末端的修饰、氨基酸的取代、替换、环化、L-型氨基酸变D-型氨基酸、缺失或加入而得到的功能类似的多肽或拟肽。本发明抗菌肽其制备方法可以是固相化学法直接合成。制备的抗菌肽通过质谱鉴定。本发明抗菌肽在高效杀菌的同时也有可能作用于高等有机体包括人体细胞，因为抗菌肽的作用方式都均是在细胞膜上穿孔致使细胞发生渗漏死亡。所以，将抗菌肽能否使红细胞发生渗漏作为其是否具有毒性的一个标准，如果抗菌肽能使红细胞中的血红蛋白发生渗漏，可以通过检测OD49tl值确定毒性的大小。本发明还检测了抗菌肽对人体红细胞的溶血活性，实验表明，在高浓度下抗菌肽溶血率依然非常低，说明本发明抗菌肽的溶血毒性极综上所述，本发明提供一组新型人工设计动物源性型阳离子抗菌肽的抗菌肽。这些抗菌肽可方便地采用固相化学法。该合成抗菌肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌具有广谱杀伤活性，并较天然抗菌肽有更强的杀菌活性，且对动、植物细胞无任何毒害作用。本发明所述一组新型动物源性阳离子抗菌肽抗菌谱广、不需要任何修饰连接且结构简单、人工合成方便。实验证明无论是G+菌(革兰氏阳性菌)还是G—菌(革兰氏阴性菌)都有显著的抑菌和杀菌活性且持续时间长、无溶血毒性，显示其在治疗细菌感染疾病药物的开发和应用方面具有重要价值。
图1是抗菌肽CQUT-a的质谱图；图2是抗菌肽CQUT-b的质谱图。图1中，MS参数
进样量anjection Volume) 1. 00 μ 1 ；分子量(MW) :978. 68 ；气流量离子源 (Probe):ESI ；
DL 管的温度(DL Temp) 300° C ；雾化器的流速(Gas Flow) 1. 5L/min ； 加热快的温度(Block Temp) 250° C ；流动相的流速(T. Flow) :0. 2ml/min ； 流动相的比例(B. conc) :50%H20/50%ACN。图2中，MS参数
进样量 Gnjection Volume) 1. 00 μ 1 ；分子量(MW) 1008. 14 ；气流量离子源 (Probe):ESI ；
DL 管的温度(DL Temp) 300° C ；雾化器的流速(Gas Flow) 1. 5L/min ； 加热快的温度(Block Temp) 250° C ；流动相的流速(T. Flow) :0. 2ml/min ； 流动相的比例(B. conc) :50%H20/50%ACN。
具体实施例方式本发明涉及的一组动物源性阳离子抗菌肽，是对天然牛乳铁素抗菌肽序列、结构分析的基础上设计合成，该系列抗菌肽序列包括
序列 1 抗菌肽序列 CQUT-a =Phe Arg Trp Trp Gln Arg ； 序列 2 抗菌肽序列 CQUT-b :Arg Arg Gln Trp Phe Trp。本发明的构思如下基础Lactoferricin B4_9RRWQWR序列，经过多次试验研究出本发明中的多肽序列，实验表明该系列新型动物源性阳离子抗菌肽均具有显著抗菌活性，而且相比LfcinB4_9均未出现溶血毒性，有望用于治疗细菌感染的新药研究和开发。为了深入研究本发明中生物活性抗菌肽结构与功能的关系，利用美国应用系统生物公司生产的Pioneer多肽合成仪制备本发明中多肽和作为对照的抗菌肽，以供实验研利用琼脂空板穴扩散法和96孔板法检测多肽的杀菌和抑菌活性，以预先合成的天然抗菌肽Lactoferricin B4_9RRWQWR为对照，进行杀菌活性检测，结果表明本发明中抗菌肽的杀菌活性显著强于对照抗菌肽的杀菌活性。新型动物源性阳离子抗菌肽CQUT-ει，CQUT-b及对照抗菌肽Lactoferricin B4_9的固相合成。按照标准的Fmoc固相程序人工合成抗菌肽 CQUT-a (Phe-Arg-Trp-Trp-Gln-Arg)、CQUT-b (Arg-Arg-Gln-Trp-Phe-Trp)及对照抗菌肽 Lactoferricin B4_9 (Arg-Arg-Trp-Gln-Trp- Arg)合成肽经反相 HPLC (Vydac 218TP1022 柱2.2X25cm)纯化，采用乙腈/水/三氟乙酸系统洗脱，MALDI-T0F和EPI质谱分析。抗菌肽合成由上海紫域生物科技有限公司(Shanghai Ziyu Biotechnology Co. , Ltd. Shanghai, China)。1.抗菌肽的制备(以制备0. Immol量的CQUT_a为例) 以下所有制备抗菌肽的试剂均购于美国应用生物系统公司。
制备的CQUT-a 多肽序列为=Phe-Arg-Trp-Trp-Gln-Arg-NH2
制备从C端到N端逐个进行，由合成仪自动控制。首先称量0. Immol的结合了第一个氨基酸即Phe的树脂(购于美国应用生物系统公司)，装柱，再用20%哌啶二甲基甲酰胺溶液保护，二甲基甲酰胺清洗，9-笏甲氧羰基(Fmoc)保护的游离氨基酸溶解于碳二亚胺 (DCC)，羟基苯并三唑(HOBt)/二异丙基乙基胺(DIPEA)，溶解后的溶液在柱上循环偶合反应30min，三氟乙酸(TFA)清洗重复以上脱保护到偶合反应步骤直到制备结束(具体操作步骤见pioneer多肽合成仪操作指南)，以乙醚将三氟乙酸中的多肽析出，清洗，形成固体粗品多肽。2.抗菌肽的纯化
称量IOOmg干燥后的多肽，溶于0. 1%三氟乙酸10ml，样品处理后反相液相色谱 (RP-HPLC)进行纯化。体系为0. 1%三氟乙酸(TFA)的H2O和0. 1%的乙腈(ACN)，收集洗脱峰。将液相色谱(HPLC)中纯化出来的目标峰放置冻干机(_50°C )中冻干，后再次进行质谱(MS)确认正确与否，HPLC检测纯度。3.抗菌肽的鉴定
如图1所示，制备的抗菌肽CQUT-a经过质谱(MQ分析，CQUT-a在质谱图中显示计算出CQUT-a的分子量为978. 68。由多肽序列计算出的理论值为978. 12。证明制备的多肽即为设计的CQUT-a抗菌肽。鉴定合格的抗菌肽产物备用。抗菌肽CQUT-b及对照抗菌肽Lactoferricin B4_9采用类似于CQUT_a抗菌肽的制备方法制备。1、动物源性阳离子抗菌肽的杀菌活性检测
以下实施例中所使用的各种菌株购于中国生物制品检定所。采用琼脂板扩散法对动物源型阳离子抗菌肽的杀菌活性进行检测，并用固相化学法合成的抗菌肽Lactoferricin B4_9RRWQWR作为对照，以评价本发明中的两条抗菌肽 CQUT-a和CQUT-b的杀菌活性。按以下步骤进行测定抗菌肽的杀菌活性
菌种复苏，接种斜面37°C培养过夜，挑菌于普通LB培养基中，37°C培养过夜，稀释菌液使菌浓度为IO5 IO6Cfu /ml，按每个平板100 μ 1菌液接种于15ml LB固体培养皿中，待凝固后，涂布均勻后，打孔5mm，3个/平板，分别加入浓度1 mg/ml 10 μ 1合成抗菌肽溶液和 LfcinB4^9溶液及超纯水(LfcinB4_9作为阳性对照，超纯水作为阴性对照)，4°C静置池后，将平板置于37°C培养他后，测量抑菌圈大小，判定杀菌能力，同时观察抑菌圈在7d之内的变化，判定杀菌持续时间长短。结果见表1。表1 1 mg/ml三种抗菌肽对不同细菌的抗菌活性的测定比较
权利要求
1.一组动物源性阳离子抗菌肽，其特征在于，该抗菌肽序列包括 CQUT-a :Phe Arg Trp Trp Gln Arg ；CQUT-b :Arg Arg Gln Trp Phe Trp0
2.一组动物源性阳离子抗菌肽系列，其特征在于，包括权利要求1所述序列，还包括多肽或衍生物中N末端和/或C末端的修饰、氨基酸的取代、替换、环化、L-型氨基酸变D-型氨基酸、缺失或加入而得到的功能类似的多肽或拟肽。
3.如权利要求1所述动物源性阳离子抗菌肽，其特征在于，在治疗细菌感染的应用。
4.如权利要求1所述动物源性阳离子抗菌肽，其特征在于，在抑制微生物的生长，并制备成药物组合物用于治疗和预防由多种微生物所引起的感染，其中所述微生物包括革兰氏阳性菌和革兰氏阳性菌。
5.如权利要求2所述动物源性阳离子抗菌肽系列，其特征在于，在治疗细菌感染的应用。
6.如权利要求2所述动物源性阳离子抗菌肽系列，其特征在于，在抑制微生物的生长， 并制备成药物组合物用于治疗和预防由多种微生物所引起的感染，其中所述微生物包括革兰氏阳性菌和革兰氏阳性菌。
全文摘要
本发明提供一组新型人工设计动物源性型阳离子抗菌肽，是对天然牛乳铁素抗菌肽序列、结构分析的基础上设计合成，该系列抗菌肽序列如下CQUT-aPheArgTrpTrpGlnArg；CQUT-bArgArgGlnTrpPheTrp。所述抗菌肽采用固相化学法获得。本发明动物源性阳离子抗菌肽抗菌谱广、不需要任何修饰连接且结构简单、人工合成方便。实验证明无论是G+菌(革兰氏阳性菌)还是G-菌(革兰氏阴性菌)都有显著的抑菌和杀菌活性且持续时间长、无溶血毒性，显示其在治疗细菌感染疾病药物的开发和应用方面具有重要价值。
文档编号A61K38/08GK102391362SQ20111041461
公开日2012年3月28日 申请日期2011年12月13日 优先权日2011年12月13日
发明者丁元, 林治华, 王远强, 蔡家利, 韩英子 申请人:重庆理工大学