专利名称：树形聚甘油硫酸酯和磺酸酯及其对炎性疾病的用途的制作方法
树形聚甘油硫酸酯和磺酸酯及其对炎性疾病的用途本发明涉及树形聚甘油硫酸酯和磺酸酯的新颖的化合物种类及其制备和在治疗疾病，特别是炎性疾病中的用途，并且涉及其作为选择蛋白抑制剂和选择蛋白指示剂的用途。树形聚甘油硫酸酯和磺酸酯还适用于影像诊断学，特别是关于炎性疾病的影像诊断学。
背景技术：
炎症是对组织损伤和病原体侵入的基本应答，其中由于白细胞的抗微生物活性、 分泌活性和吞噬活性，白细胞起着关键的作用。在所有形式的炎症反应中均观察到白细胞募集到血管内皮并随后迁移至周围组织中。白细胞迁移至组织中是由白细胞粘附至血管壁上开始的。这允许白细胞在感染源中积聚并允许实现防御反应。在白细胞和内皮细胞上的多种血管细胞粘附分子介导和调控血细胞在血管壁上的粘附。该过程是以连续相连的分子相互作用的级联反应方式发生。首先，选择蛋白，即凝集素样粘附分子家族，介导白细胞在内皮表面上的“停靠”和“滚动”。这导致白细胞的减速并允许与内皮表面上的诸如趋化因子的信号分子接触。这些信号分子刺激白细胞表面上的整联蛋白活化，然后该整联蛋白又介导这些细胞在内皮表面上的有效结合。免疫球蛋白(Ig)超家族的成员用作该整联蛋白的配体。此时稳定粘附的白细胞能够以定向方式移动并能够活跃地穿过内皮细胞层。如前所述，通过(三种)选择蛋白及其配体间的瞬时受体-配体相互作用来介导内皮上白细胞的最初接触和滚动[I]。随后通过活化的整联蛋白与免疫球蛋白(Ig)超家族的粘附分子之间的相互作用保证了白细胞与内皮的紧密接触[2]。除了所需防御作用和组织损伤的修复外，来自血流的白细胞的未受控制的迁移还能够是病理相关的并能够导致组织损伤[3]。内皮细胞粘附分子在急性和慢性炎性过程中的普遍存在使其成为诊断和治疗的合适的靶标结构[综述参见4]。选择蛋白是结合碳水化合物的粘附分子，其有助于增强白细胞在免疫防御过程中粘附至发炎组织的血管内皮上。根据其细胞来源，选择蛋白可分为L-选择蛋白(白细胞)、 E-选择蛋白(内皮)和P-选择蛋白(血小板和内皮)。由于其蛋白结构及其特定分子结合特性，选择蛋白引起白细胞粘附；在相应配体的临时结合后，白细胞沿着血管壁边从流畅的血流中经历了“滚动减速”。然后，其它粘附分子介导白细胞紧密结合至内皮上及其为了完成其防御功能的外渗。在发现选择蛋白后不久并在90年代初期阐明其结构之后，选择蛋白在医药研究领域成为引人注目的靶标结构。除了其在免疫应答中的生理学功能之外，在病理过程中还观察到选择蛋白表达的失调，所述病理过程例如类风湿性关节炎、哮喘、糖尿病和缺血/再灌注，以及在转移性癌细胞的组织侵入期间观察到它的存在。这激发了对抑制选择蛋白的化合物进行深入细致的探索。E-选择蛋白和P-选择蛋白以及L-选择蛋白配体以炎症依赖性方式在微血管内皮上表达，L-选择蛋白在白细胞上出现[1，2]。对于所报导的选择蛋白，仅有几种高度亲和的配体是已知的。大体上，它们具有粘蛋白样结构，例如长延伸的糖蛋白，该结构具有许多个作为实际结合表位的碳水化合物侧链，该侧链以糖苷形式连接在所述结构的富丝氨酸或富苏氨酸的蛋白骨架上。通过受体与高柔韧性配体的结合物的快速形成和解离，在脉管的剪切流中介导细胞滚动。结合所必需的碳水化合物表位是带有特异性连接的海藻糖和末端的唾液酸(N-乙酰基神经氨酸)的、基于N-乙酰基乳糖胺的寡糖。四糖唾液酸化的 LewisX(sLeX)是显著相关的结合表位。sLeX用作结构-功能关系的标准配体以表征结合特性以及探求选择蛋白抑制剂。很久以来，已知sLeX是选择蛋白的重要结合伙伴以及多价是靶向阻断白细胞粘附的关键，这些研究成果是开发多种选择蛋白抑制剂的基础[综述参见5]。到目前为止， 尽管可以得到高亲和的抑制剂，但靶标选择蛋白还未导致开发出市场准备完毕的治疗方法。目前，通过使用炎性细胞因子TNF α的阻断剂(英夫利西单抗(infliximab),依那西普(etanerc印t)[6，7])，实现了类风湿性关节炎和牛皮癣情况下的治疗性干预。此外，依法利珠单抗(efalizumab) [7]，抗-整联蛋白抗体，在市场上出售，其被批准用于全身治疗牛皮癣。在临床试验中测试了更多的化合物，例如全-选择蛋白拮抗剂双莫昔氨莫司 (bimosiamose) (1,6-双[3_(3_羧甲基苯基)_4_(2_ a-D-卩比喃甘露糖基氧基)苯基]己烷)，其属于小分子药物类，并且是具有糖苷结构的抑制选择蛋白的化合物，其具有比sLeX 基本上更高的对选择蛋白的亲和性(试验由Revotar AG, Hennigsdorf进行)。双莫昔氨莫司被期望用于哮喘、牛皮癣、特应性皮炎和再灌注损伤[8]。已经描述了带有硫酸化的sLeX结构的线性新含糖聚合物(neoglycopolymer)且其能够获得在低纳米摩尔范围的IC5tl值[5，9]，还描述了硫酸化的树形聚环氧乙烷(PEO)含糖聚合物[10]。因此，本发明的一目的是提供易于合成并且适用于治疗疾病，特别是治疗炎性疾病的化合物和化合物类型。通过提供树形聚甘油磺酸酯，本发明解决了所述目的。本发明的树形聚甘油磺酸酯的特征在于a)高分子聚甘油核,其由在多官能团的起动分子(starter molecule)上的具有通式(RO-CH2)2CH-OR的甘油重复单元组成，所述起分子是具有I至1，000个OH基团的多羟基化合物，优选I至4个OH基团，其中R = H或更多的甘油单元，所述核的支化度为O至100%，优选60%，且其平均分子量为lOOg/mol至 I, 000, 000g/mol，优选 1，000g/mol 至 20，000g/mol,b)用-SO3H或-SO3Na基团取代甘油单元的一个或多个OH基团或在甘油单元的一个或多个OH基团上连接低聚物间隔基，所述低聚物间隔基的通式为-(CH2)n-或-[(CH2) ^-(^^-，其中!!!* I至100并且η为I至50，000，且在其上结合-SO3H或-SO3Na基团，因此得到1%至100%的磺化度，优选I %至30%，和c)分子量为 110g/mol 至 1，500, 000g/mol,优选 1，100g/mol 至 30，000g/mol。通过在缩水甘油的开环聚合期间，分别使用具有(多)官能团的起动分子或引发剂制备所述高分子聚甘油核。起动分子或引发剂分别为具有I至1000个OH基团的多羟基化合物，优选I至100个OH基团且更优选I至4个OH基团。起动分子的通式为R-(OH)x, 其中R能够是在阴离子聚合条件下稳定的任何分子，且X是I至1000，优选I至100且更优选I至4。优选地，所用的引发剂是三官能团引发剂或四官能团引发剂，例如1，1，1_三羟甲基丙烷(TMP)作为优选的三官能团引发剂或季戊四醇(PE)作为优选的四官能团引发剂。 起动分子或引发剂能够分别带有更多的杂官能团，例如特别是SH基团、NH2基团。在具体实施方案中，所述起动分子含有OH基团和/或更多的杂官能团(如SH、NH2)。本领域技术人员已知更多合适的引发剂。取决于对引发剂和聚合条件的选择，所述高分子聚甘油核达到一定的支化度和具有窄的多分散性的可任意调整的分子量。根据本发明，使用支化度为O至100%的高分子聚甘油核。优选地，使用高支化的结构，优选30%至80%的支化度，特别优选60%的支化度。本发明的高分子聚甘油核的平均分子量优选100g/mol至1，000，000g/mol,更优选 500g/mol 至 100，000g/mol,其中特别优选 1，000g/mol 至 20，000g/mol。将本发明的高分子聚甘油核进行磺化。优选地，在催化量的诸如氢氧化钾的碱存在下使用乙烯基磺酸的钠盐作为磺化试剂。所达到的磺化度优选1%至100%，特别优选 10%至30%，更特别优选30%至100%。本发明的“磺化度”意指高分子聚甘油核的甘油单元的被官能化的OH基团的百分比。官能化或者是由用-SO3H或-SO3Na基团取代甘油单元的一个或多个OH基团而引起的， 或者是由在甘油单元的一个或多个OH基团上连接低聚物间隔基而引起的。所述低聚物间隔基具有以下通式- (CH2) n-或- [ (CH2) m-0) ] n-其中m为I至100，优选I至50，更优选I至10且还更优选2，并且η为I至50，000，优选I至5，000,更优选I至100并且在其上结合-SO3H或-SO3Na 基团。低聚物间隔基例如是低聚乙二醇(OEG)链、聚乙二醇(PEG)链、脂肪族碳水化合物链或其它线性聚醚。取决于对本发明的高分子聚甘油核和磺化条件、即磺化度的选择，本发明的所述树形聚甘油磺酸酯的分子量优选为110g/mol至1，500，000g/mol,更优选为600g/mol至 150，000g/mol 且特别优选 1，100g/mol 至 30，000g/mol。本发明的树形聚甘油磺酸酯的特别优选的实施方案具有a)高分子聚甘油核，其平均分子量(Mn)为2，500g/mol至20，000g/mol且支化度为60 %，该支化度对应于树形支化度，和b)磺化度为10%至30%，这是通过用乙烯基磺酸的钠盐进行磺化而获得。本发明的树形聚甘油磺酸酯的特别优选的实施方案具有平均分子量为5，OOOg/ mo I的高分子聚甘油核、4%的磺化度和5，200g/mol的分子量，例如实施例2中的化合物 3b (参见表2)。本发明的树形聚甘油磺酸酯的又一特别优选的实施方案具有平均分子量为 20，000g/mol的高分子聚甘油核、8%的磺化度和21，800g/mol的分子量，例如实施例2中的化合物3d (参见表2)。本发明还通过提供树形聚甘油硫酸酯解决所述目的。本发明的树形聚甘油硫酸酯的特征在于
a)高分子聚甘油核，其由在多官能团的起动分子上的具有通式(RO-CH2)2CH-OR的甘油重复单元组成，所述起动分子是具有I至1，000个OH基团的多羟基化合物，优选I至 4个OH基团，其中R = H或更多的甘油单元，所述核的支化度为O至100%，优选60%，且其平均分子量为lOOg/mol至 I, 000, 000g/mol,优选 1，000g/mol 至 20，000g/mol,更优选 2，000g/mol 至 7，500g/mol,b)用-OSO3H或-OSO3Na基团取代甘油单元的一个或多个OH基团或在甘油单元的一个或多个OH基团上连接低聚物间隔基，所述低聚物间隔基的通式为-(CH2)n-或-[(CH2)m-0)]n-，其中m为I至100并且η 为I至50，000，且在其上结合-OSO3H或-OSO3Na基团，因此得到I %至100%的硫酸化度，以及c)分子量为 200g/mol 至 5，000, 000g/mol,优选 2，000g/mol 至 50，000g/mol,更优选 5，000g/mol 至 13，500g/mol。通过在缩水甘油的开环聚合期间，分别使用具有(多)官能团的起动分子或引发剂制备所述高分子聚甘油核。起动分子或引发剂分别为具有I至1，000个OH基团的多羟基化合物，优选I至100个OH基团且更优选I至4个OH基团。起动分子的通式为R-(OH) x，其中R能够是在阴离子聚合条件下稳定的任何分子，X是I至1，000，优选I至100且更优选I至4。优选地，所用的引发剂是三官能团引发剂或四官能团引发剂，例如1，1，I-三羟甲基丙烷(TMP)作为优选的三官能团引发剂或季戊四醇(PE)作为优选的四官能团引发剂。 起动分子或引发剂能够分别带有更多的杂官能团，例如特别是SH基团、NH2基团。在具体实施方案中，所述起动分子含有OH基团和/或更多的杂官能团(如SH、NH2)。本领域技术人员已知更多合适的引发剂。取决于对引发剂和聚合条件的选择，所述高分子聚甘油核达到一定的支化度和具有窄的多分散性的可任意调整的分子量。根据本发明，使用支化度为O至100%的高分子聚甘油核。优选地，使用高支化的结构，优选30%至80%的支化度，特别优选60%的支化度。本发明的高分子聚甘油核的平均分子量优选100g/mol至1，000，000g/mol,更优选 500g/mol 至 100，000g/mol，其中特别优选 1，000g/mol 至 20，000g/mol 以及 2，000g/mol 至 7，500g/molο将本发明的高分子聚甘油核进行硫酸化。优选地，使用SO3和吡啶的配合物作为硫酸化试剂，且其浓度为与所述高分子聚甘油核的OH基团等摩尔。通过SO3与聚甘油的OH 基团的比例能够调节所得官能化，即硫酸化为O至100%。所达到的硫酸化度优选I %至 100%,特别优选70%至95%，更特别优选75%至92%。本发明的“硫酸化度”意指高分子聚甘油核的甘油单元的被官能化的OH基团的百分比。官能化或者是由用-OSO3H或-OSO3Na基团取代甘油单元的一个或多个OH基团而引起的，或者是由在甘油单元的一个或多个OH基团上连接低聚物间隔基而引起的。所述低聚物间隔基具有以下通式-(CH2)n-或- [ (CH2) m-0) ] n-
其中m为I至100，优选I至50，更优选I至10且还更优选2，并且η为I至50，000，优选I至5，000，更优选I至100并且在其上结合-OSO3H
或-OSO3Na基团。低聚物间隔基例如是低聚乙二醇(OEG)链、聚乙二醇(PEG)链、脂肪族碳水化合物链或其它线性聚醚。取决于对本发明的高分子聚甘油核和硫酸化条件、即硫酸化度的选择，本发明的所述树形聚甘油硫酸酯的分子量优选200g/mol至5，000, 000g/mol,更优选2，000g/mol至 50，000g/mol 且特别优选 5，000g/mol 至 13，500，特别优选 5，500g/mol 或 11，000g/mol 或 21, 500g/mol 或 41，000g/mol 或 6，800g/mol 或 8，600g/mol 或 12，300g/mol。本发明的树形聚甘油硫酸酯的特别优选的实施方案具有平均分子量为2，500g/ mo I的高分子聚甘油核、85%的硫酸化度和5，500g/mol的分子量，例如分别为实施例I中的化合物2a(参见表I)或实施例4中的dPGS2500/85化合物(参见表3)。本发明的树形聚甘油硫酸酯的另一特别优选的实施方案具有平均分子量为 5，000g/mol的高分子聚甘油核、79%的硫酸化度和10，500g/mol的分子量，例如实施例I中的化合物2b (参见表I)。本发明的树形聚甘油硫酸酯的另一特别优选的实施方案具有平均分子量为 2，500g/mol的高分子聚甘油核、92%的硫酸化度和6，800g/mol的分子量，例如实施例4中的化合物dPGS2500/92 (参见表3)。本发明的树形聚甘油硫酸酯的另一特别优选的实施方案具有平均分子量为 4，000g/mol的高分子聚甘油核、84%的硫酸化度和8，600g/mol的分子量，例如实施例4中的化合物dPGS4000/84 (参见表3)。本发明的树形聚甘油硫酸酯的另一特别优选的实施方案具有平均分子量为 6，000g/mol的高分子聚甘油核、76%的硫酸化度和12，300g/mol的分子量，例如实施例4中的化合物dPGS6000/76 (参见表3)。通过使用本发明的树形聚甘油磺酸酯和/或本发明的树形聚甘油硫酸酯作为用于治疗疾病的药物进一步解决了所述目的。本发明的化合物能够例如在用作药剂时以药物组合物的形式提供，所述药物组合物包含一种或多种本发明的化合物以及药物可接受的载体。优选地，这些药物组合物具有单位剂型，例如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、无菌肠胃外溶液剂或混悬剂。本领域技术人员已知更多的剂型。药剂或药物组合物包含治疗有效量的药物或若干药物，即治疗有效量的一种或多种本发明的化合物。技术人员能够根据待治疗的疾病并考虑患者的状态而确定治疗有效量。药剂或药物组合物能够适当地包含约5mg至1，OOOrng、优选约IOmg至500mg的本发明的化合物。取决于所需的应用途径(例如口服、肠胃外给药)，药物可接受的载体和/或赋形剂能够具有多种形式。合适的载体和赋形剂是本领域公知的并且能够由本领域技术人员选择。载体包括惰性的药物赋形剂，例如粘合剂、助悬剂、润滑剂、矫味剂、增甜剂、防腐剂、着色剂和包衣剂。能够通过使用本发明的树形聚甘油磺酸酯和/或本发明的树形聚甘油硫酸酯而治疗的疾病优选炎性疾病。对于治疗性干预，考虑全部的炎症过程，其中白细胞从血流中的迁移是病理上相关的并且导致组织损伤。除了慢性炎性疾病外，例如类风湿性关节炎、哮喘和牛皮癣，还可以在缺血再灌注损伤或移植排斥的情况下使用本发明的树形聚甘油磺酸酯和/或本发明的树形聚甘油硫酸酯。因此，本发明的化合物优选用于治疗慢性炎性疾病，特别是类风湿性关节炎、哮喘和牛皮癣，以及用于治疗缺血再灌注损伤或移植排斥。更优选地，所述炎性疾病为这样的疾病，其中选择蛋白介导的白细胞粘附是失调的。本发明的化合物的抗炎作用能够，例如，归因于由其介导的白细胞游出的减少。因此，大大降低了更多的免疫细胞被炎症部位处分泌的细胞因子所活化(更详细的细节参见实施例)。在慢性炎症过程中，组织损伤后出现了纤维化。从而，两种细胞因子起重要作用 IFNy和TNFa。IFNy由特定群体的白细胞(T细胞和NK细胞)分泌并导致巨噬细胞的活化，其又I)产生水解酶及活性的氧和氮物质，这些导致邻近组织的破坏，以及2)释放TNFa，TNFa导致在邻近内皮上细胞粘附分子的表达增加以及白细胞的活化。因此，在炎性区域观察到白细胞的募集增加。通过使用本发明的树形聚甘油磺酸酯和/或本发明的树形聚甘油硫酸酯作为选择蛋白抑制剂进一步解决了所述目的。因此，优选地用作L-选择蛋白和/或P-选择蛋白的抑制剂。本发明的树形聚甘油磺酸酯和/或本发明的树形聚甘油硫酸酯以高亲和力(IC5tl 分别为IOnM或40nM，参见实施例3)结合L-选择蛋白和P-选择蛋白并因此阻止与其配体的相互作用。白细胞-内皮的接触减少了并且因此抑制了白细胞向炎症部位增加的迁移。因此，本发明的树形聚甘油磺酸酯和/或本发明的树形聚甘油硫酸酯适于抑制选择蛋白介导的白细胞粘附。通过使用本发明的树形聚甘油磺酸酯和/或本发明的树形聚甘油硫酸酯作为选择蛋白指示剂进一步解决了所述目的。本发明的“选择蛋白指示剂”特异性结合多种选择蛋白或特异性结合选择蛋白之一，诸如L-选择蛋白和/或P-选择蛋白，并因此能够特别在体外、在细胞、组织、器官、组织切片中，但还是特别在体内靶向、定位和/或显现选择蛋白。通过应用本专利申请的教导， 技术人员能够将本发明的化合物用作选择蛋白指示剂。为了该目的，本发明的化合物优选地被负载有信号分子或使信号分子与本发明化合物结合。优选的信号分子是用诸如1241、1251、或18F的放射性同位素标记的分子；用染料标记的分子，特别是用诸如氨甲基香豆素、荧光素、花青、若丹明及其衍生物的荧光团或其它生色团标记的分子。信号分子还能够是荧光供体或指示剂以及荧光受体或猝灭剂，其能够特别用作每一荧光供体/指示剂和荧光受体/猝灭剂对(即，用作FRET对)。
目前为止，通过可用的影像临床诊断方法解决炎症源的定位和表征并不令人满意。对于采用本发明的树形聚甘油磺酸酯和/或本发明的树形聚甘油硫酸酯特异性靶向炎症区域，这些化合物被负载有信号供体(放射性同位素、NIR染料、磁铁矿)并用于显影。因此，必要条件是在炎症区域的特异性结合(L-选择蛋白和P-选择蛋白)和信号积聚。因此，本发明的化合物优选用于炎性疾病的诊断。从而，在炎性区域发生选择蛋白的靶向。本发明的树形聚甘油磺酸酯和/或本发明的树形聚甘油硫酸酯还用作肝素类似物并因此如同肝素一样能够特异性结合某些趋化因子。这些趋化因子是促炎细胞因子，特别是 TNFa、IL-I、IL-6 以及 IL-8 和 MIP-I β。本发明的树形聚甘油磺酸酯和/或本发明的树形聚甘油硫酸酯对诸如INFy或 TNFa的趋化因子的抑制性结合阻止了与趋化因子的受体的相互作用，这导致降低的组织损伤和白细胞外渗。由于其与诸如选择蛋白、趋化因子、凝血因子、特别是L-选择蛋白和P-选择蛋白等蛋白的特异性相互作用，本发明的化合物优选用于更多的体外应用-本发明的树形聚甘油磺酸酯和/或本发明的树形聚甘油硫酸酯(类似于市售的肝素琼脂糖凝胶)被固定在基质上。取决于用途，例如所用的分离技术，优选的用于固定的基质或表面分别为无机的材料以及聚合的天然材料和聚合的合成材料。实例有基于硅的表面(例如玻璃、硅石)和多种官能化的和非官能化的聚合物(例如葡聚糖、琼脂糖、琼脂糖凝胶以及合成的亲水性聚合物)。用于固定的基质或表面还可分别选自无机氧化物表面、能磁化的或不能磁化的表面、含娃的表面、玻璃表面、二氧化娃膜、娃土、粘土和技术人员公知的更多的表面。用于固定的基质或表面还能够分别为颗粒、膜、基质或固相。-本发明的化合物，优选被固定的，用于配合物溶液或生物样品(例如体液；血浆； 全血；血清；更多源于血的样品；细胞悬浮液；细胞培养液的上清液)及其它含生物分子的溶液的分部以及用于从这些溶液/样品中纯化特定蛋白(例如L-选择蛋白、P-选择蛋白、 趋化因子、凝血因子)。-本发明的树形聚甘油磺酸酯和/或本发明的树形聚甘油硫酸酯用作捕捉分子， 例如在ELISA中。所述树形聚甘油硫酸酯和磺酸酯具有很强的抗炎潜力，因为其结合了所报导的抑制剂的优点-容易合成(成本效益)-生物相容性(与硫酸乙酰肝素/肝素高度相似)-对L-选择蛋白和P-选择蛋白具有高亲和性(IC5tl分别=IOnM或40ηΜ，体外测量)。在Biacore中体外分析显示，取决于其大小，其活性(结合L-选择蛋白和P-选择蛋白)增强。-与抑制白细胞活化的趋化因子结合。还公开了本发明的树形聚甘油硫酸酯作为白细胞-内皮相互作用的抑制剂，其中 L-选择蛋白和P-选择蛋白配体的结构被简化为硫酸酯基团并与聚甘油骨架连接。在接触性皮炎小鼠模型中安全地使用了所述化合物并抑制了免疫应答(还参见实施例和附图)。通过以下附图和实施例对本发明进行说明。
图I.树形聚甘油硫酸酯的合成方案。
图2.树形聚甘油磺酸酯的合成方案。
图3.所选的树形聚甘油硫酸酯对L-选择蛋白配体结合的抑制作用。
L-选择蛋白与其合成的配体(sLeX-酪氨酸硫酸盐)的结合被设定为100% (对照值)。
聚甘油核的平均分子量[g/mol] 2a, 2500 ；2c, 10, 000 ;2d，20，000。
全部聚甘油硫酸酯的硫酸化度为约80% (还参见表I)。
图4.树形聚甘油硫酸酯2c对选择蛋白的竞争抑制作用。
与合成的配体(sLeX-酪氨酸硫酸盐)的结合被分别设定为100% (对照值)。
图5.树形聚甘油衍生物2d对L-选择蛋白配体结合的硫酸化度依赖性竞争抑制作用。
以IOnM的浓度使用该衍生物。L-选择蛋白与其合成的配体(sLeX-酪氨酸硫酸盐)的结合被设定为100% (对照值)。
图6.树形聚甘油硫酸酯的实例(dPGS)。
图7. dPGS不抑制单核细胞系THP-I的增殖。
增殖试验阿尔玛蓝染料(Alamar Blue)。
与泼尼松龙相对照，T细胞的存活力未受不同浓度的dPGS的影响。
图8. dPGS未显示出诱导PBMC细胞凋亡。
A PBMC+dPGS (+/-CD3 刺激)
B PBMC+dPGS (+/-LPS 刺激)
细胞凋亡检测=Annexin V读出
图9. dPGS在鼠树突状细胞(DC)中未抑制TNFa分泌。
鼠树突状细胞+dPGS (+/-LPS)
检测=ELISA0
图10. dPGS在人T细胞中未显示出对TNFa分泌的干预。
PBMC+/-抗 CD3 珠 +dPGS
检测=ELISA0
图11. dPGS的选择蛋白结合特异性
使用聚合物核的Mn为4，000g/mol且硫酸化度为84%的dPGS (dPGS4000/85)。
图12.选择蛋白的结合依赖于树形聚甘油的硫酸化。
使用聚合物核的Mn为6，000g/mol的dPGS (dPG 6000)。
图13. dPGS对选择蛋白的结合依赖于核的大小和硫酸化率。
图14.在急性TMA-诱导的变应性接触性皮炎模型中dPGS降低水肿形成。
dPGS被注入小鼠的颈褶。
图15.在急性TMA-诱导的变应性接触性皮炎后dPGS降低粒细胞的迁出。
dPGS被注入小鼠的颈褶。图16.在亚慢性TMA-诱导的变应性接触性皮炎模型中dPGS降低水肿形成。图17.在亚慢性TMA-诱导的变应性接触性皮炎模型中dPGS防止粒细胞和嗜中性粒细胞的浸润。A :粒细胞(过氧化物酶活性)B :嗜中性粒细胞(弹性蛋白酶活性)，归一化至介质(=O)图18. dPGS降低炎症部位的IL-2和IL-4的浓度。亚慢性TMA 激发，耳勻衆(ear homogenate)的 ELISA。
实施例实施例I :树形聚甘油硫酸酯的合成基本上按照[11]中所述进行树形聚甘油硫酸酯的合成材料从Fluka (BuchsJi^i)购买SO3/卩比唳配合物。该试剂不经过进一步纯化就使用。 在进一步使用前，溶剂N，N-二甲基甲酰胺(DMF，p.a.质量，购自Roth，卡尔斯鲁厄，德国) 用CaH2干燥并经4人分子筛储存。在51烧杯中，在蒸馏水中用再生纤维素管(SpectraPore 6/Roth)进行渗析，其中所述溶剂在48小时内更换3次。I.高分子聚甘油核聚甘油I是具有树形(树样的)分支的、易于获得的、明确定义的聚合物，其通过缩水甘油的受控阴离子聚合而得到[12-14]。I的支化度(60% )低于理想的甘油树枝状聚合物(100%) [15]。然而，物理化学特性是类似的[16]。通过单体和引发剂的比例能够容易地调节分子量(1，000-30, 000g/mol)和聚合度(DP)，并且得到窄的多分散性(通常< 2. 0)。由于脂肪族聚醚的生物相容特性，大体上具有相似特性的多羟基化合物(例如多糖类、聚(乙二醇)类)被预期为聚甘油[13]。此外，详细研究了低聚甘油(2-10个单体单元)的毒理学特性并证明其可作为营养添加剂和药理学添加剂[16，17]。因此，树形聚甘油 I应当适于作为药物的高功能载体并且适于产生树形聚阴离子(聚硫酸酯、聚羧酸酯、聚磺酸酯)。此外，如前所述[14]，对于la-c的情况，使用1，1，1_三(羟甲基)丙烷(TMP)作为引发剂来制备聚甘油(PG) la (Mn = 2，500g/mol, Mw/Mn = I. 6)、Ib (Mn = 5，000g/mol, Mw/ Mn =1.6)、Ic (Mn = 10，OOOg/mol，Mw/Mn =1.8)，而对于 Id 的情况则使用季戊四醇(PE)作为引发剂来制备聚甘油(PG) Id (Mn = 20，000g/mol, Mw/Mn < 2. 0)。2.分析在fcuker ARX 300光谱仪中，在浓度为100mg/ml的D2O中记录1HNMR和13C NMR 图谱，分别在300MH或75. 4MH中操作。在Bruker IFS88FT-IR中使用KBr板进行IR测量。 使用元素分析测定化合物2a-d的硫酸化度(ds)(表I)。3.聚甘油硫酸酯的合成通过修改Alban等人描述的已有的硫酸化β_1,3_葡聚糖的方法[18],使用不同分子量的树形聚甘油(la-d)作为核聚合物以及SO3/吡啶配合物作为硫酸化试剂在作为溶剂的干燥DMF中进行聚甘油硫酸酯的合成(参见方案I)。SO3/吡啶配合物在DMF中的浓度及其摩尔比(SO3每OH基团)在所有情况下均保持恒定。合成方案参见图I。在60°C、氩气气氛下，将10. 75g(67. 5mmol) SO3/吡啶配合物的67. 5ml DMF溶液在 4小时内逐滴加入搅拌中的5. Og聚甘油(la、lb、lc、ld) (67. 5mmol OH基团)的25ml DMF 溶液。将该反应混合物在60°C下再搅拌2小时并在室温下搅拌18小时后，加入50ml蒸馏水。立即将IM NaOH加入该水溶液中直至pH达到11。真空浓缩得到粗产物，通过在水中渗析将其进一步纯化。蒸发溶剂后得到聚甘油硫酸酯2a-d淡黄色固体，将其用P2O2进一步干燥。在蒸馏水中渗析后，以良好的收率(50-75% )且高纯度(根据1H NMR, > 98% ) 获得聚甘油硫酸酯(2a_d)。产量7.49g(2a)；8. 96g(2b) ；7. 01g(2c) ;6.86g(2d)。1H NMR (300MHz, D2O) δ (ppm) 0. 98 [t，3H，CH3CH2C (CH2O) 3-PG_0S03Na]，I. 48 [m， 2H, CH3CH2C- (CH2O) 3-PG_0S03Na]，3. 40-4. 00 [m, CH3CH2C (CH2O) 3-PG_0S03Na] ,4. 19, 4. 33，
4.38 [PG-OSO3Na]，4. 72 [PG-OCH2CH (OSO3Na) CH2OSO3Na]。注意对于2d的情况,0. 98和I. 48处的峰不适用。13C NMR (D2O, 75. 4ΜΗζ) δ (ppm) 66. 9,67. 6,68. 2,69. 4, 70. 3, 75. 8, 77. 2,
78. 3 [PG-OSO3Na]。IR (KBr) υ (cm-1) 3470 [OH]，2930 [CH]，1260 [S = 0]，780 [C-O-S]。元素分析后的硫含量2a15. 38% S，2b :14. 28% S，2c :15. 20% S，2d :13. 96%。通过1H-NMR光谱法，未观察到聚甘油核的降解。使用与OH基团等摩尔的SO3/吡啶浓度，全部游离OH基团中约85%的OH基团被硫酸化(表I)。如此高的硫酸化度表明聚甘油比多糖(24)更易于硫酸化。表I树形聚甘油硫酸酯2a-C的表征
权利要求
1.树形聚甘油硫酸酯，其特征在于a)高分子聚甘油核，所述高分子聚甘油核由在多官能团的起动分子上的具有通式 (RO-CH2)2CH-OR的甘油重复单元组成，所述起动分子是具有I至1，000个OH基团的多羟基化合物，其中R = H或更多的甘油单元，所述核的支化度为O至100%，并且所述核的平均分子量为100g/mol至1，000，000g/mol,b)用-OSO3H或-OSO3Na基团取代甘油单元的一个或多个OH基团或在所述甘油单元的一个或多个OH基团上连接低聚物间隔基，所述低聚物间隔基的通式为-(CH2)n-或_[ (CH2)m-O) ]n-，其中m为I至100并且η为I至50，000，且在其上结合-OSO3H 或-OSO3Na 基团，因此得到92%至100%的硫酸化度，以及c)分子量为200g/mol 至 5，000, 000g/mol。
2.如权利要求I所述的树形聚甘油硫酸酯，其特征在于b)硫酸化度为92%至95%。
3.如权利要求I或2所述的树形聚甘油硫酸酯，其特征在于a)高分子聚甘油核的平均分子量为1，000g/mol至20，000g/mol。
4.如权利要求3所述的树形聚甘油硫酸酯，其特征在于a)高分子聚甘油核的平均分子量为2，000g/mol至7，500g/mol。
5.如权利要求I或2所述的树形聚甘油硫酸酯，其特征在于c)分子量为2000g/mol 至 50，000g/mol。
6.负载有信号分子或具有与其结合的信号分子的树形聚甘油硫酸酯，其中所述树形聚甘油硫酸酯的特征在于a)高分子聚甘油核，所述高分子聚甘油核由在多官能团的起动分子上的具有通式 (RO-CH2)2CH-OR的甘油重复单元组成，所述起动分子是具有I至1，000个OH基团的多羟基化合物，其中R = H或更多的甘油单元，所述核的支化度为O至100%，并且所述核的平均分子量为100g/mol至1，000，000g/mol,b)用-OSO3H或-OSO3Na基团取代甘油单元的一个或多个OH基团或在所述甘油单元的一个或多个OH基团上连接低聚物间隔基，所述低聚物间隔基的通式为-(CH2)n-或_[ (CH2)m-O) ]n-，其中m为I至100并且η为I至50，000，且在其上结合-OSO3H 或-OSO3Na 基团，因此得到1%至100%的硫酸化度，以及c)分子量为200g/mol 至 5，000, 000g/mol。
7.如权利要求6所述的树形聚甘油硫酸酯，其中所述信号分子选自放射性标记的衍生物或染料团。
8.如权利要求7所述的树形聚甘油硫酸酯，其中所述信号分子选自荧光团和生色团。
9.如权利要求6或7所述的树形聚甘油硫酸酯，其中所述树形聚甘油硫酸酯的特征在于a)在具有I至4个OH基团的多官能团的起动分子上建立高分子聚甘油核。
10.如权利要求6或7所述的树形聚甘油硫酸酯，其中所述树形聚甘油硫酸酯的特征在于a)在还包含杂官能团的多官能团的起动分子上建立高分子聚甘油核。
11.如权利要求10所述的树形聚甘油硫酸酯，其中所述杂官能团选自SH基团和见12基团。
12.如权利要求6或7所述的树形聚甘油硫酸酯，其中所述树形聚甘油硫酸酯的特征在于a)高分子聚甘油核的支化度为60%。
13.如权利要求6或7所述的树形聚甘油硫酸酯，其中所述树形聚甘油硫酸酯的特征在于a)高分子聚甘油核的平均分子量为1，000g/mol至20，000g/mol。
14.如权利要求13所述的树形聚甘油硫酸酯，其中所述树形聚甘油硫酸酯的特征在于a)高分子聚甘油核的平均分子量为2，000g/mol至7，500g/mol。
15.如权利要求6或7所述的树形聚甘油硫酸酯，其中所述树形聚甘油硫酸酯的特征在于c)分子量为 2，000g/mol 至 50，000g/molo
16.如权利要求15所述的树形聚甘油硫酸酯，其中所述树形聚甘油硫酸酯的特征在于c)分子量为 5，000g/mol 至 13，500g/mol。
17.负载有信号分子或具有与其结合的信号分子的树形聚甘油硫酸酯在制备诊断炎性疾病的药物中的用途，其中所述树形聚甘油硫酸酯的特征在于a)高分子聚甘油核，所述高分子聚甘油核由在多官能团的起动分子上的具有通式 (RO-CH2)2CH-OR的甘油重复单元组成，所述起动分子是具有I至1，000个OH基团的多羟基化合物，其中R = H或更多的甘油单元，所述核的支化度为O至100%，并且所述核的平均分子量为100g/mol至1，000，000g/mol,b)用-OSO3H或-OSO3Na基团取代甘油单元的一个或多个OH基团或在所述甘油单元的一个或多个OH基团上连接低聚物间隔基，所述低聚物间隔基的通式为-(CH2)n-或_[ (CH2)m-O) ]n-，其中m为I至100并且η为I至50，000，且在其上结合-OSO3H 或-OSO3Na 基团，因此得到1%至100%的硫酸化度，以及c)分子量为200g/mol 至 5，000, 000g/mol。
18.任选地负载有信号分子或具有与其结合的信号分子的树形聚甘油硫酸酯在制备与蛋白结合的药物中的用途，其中所述蛋白是选择素或细胞因子，其中所述树形聚甘油硫酸酯的特征在于a)高分子聚甘油核，所述高分子聚甘油核由在多官能团的起动分子上的具有通式 (RO-CH2)2CH-OR的甘油重复单元组成，所述起动分子是具有I至1，000个OH基团的多羟基化合物，其中R = H或更多的甘油单元，所述核的支化度为O至100%，并且所述核的平均分子量为100g/mol至1，000，000g/mol,b)用-OSO3H或-OSO3Na基团取代甘油单元的一个或多个OH基团或在所述甘油单元的一个或多个OH基团上连接低聚物间隔基，所述低聚物间隔基的通式为-(CH2)n-或_[ (CH2)m-O) ]n-，其中m为I至100并且η为I至50，000，且在其上结合-OSO3H 或-OSO3Na 基团，因此得到1%至100%的硫酸化度，以及c)分子量为200g/mol 至 5，000, 000g/mol。
全文摘要
本发明涉及树形聚甘油硫酸酯和磺酸酯的新颖的化合物种类及其制备和在治疗疾病，特别是炎性疾病中的用途，并且涉及其作为选择蛋白抑制剂和选择蛋白指示剂的用途。树形聚甘油硫酸酯和磺酸酯还适用于影像诊断学，特别是关于炎性疾病的影像诊断学。
文档编号A61P9/10GK102585202SQ201110436548
公开日2012年7月18日 申请日期2007年8月3日 优先权日2006年8月3日
发明者乌尔里希·组格尔, 戈斯彻·伯恩哈德, 斯文·恩德斯, 海德马瑞·韦恩哈特, 莱纳·哈格, 詹斯·德纳德, 阿尼·冯邦恩, 霍格尔·图尔克, 鲁道夫·陶布尔 申请人:夏里特柏林大学医学院, 柏林自由大学