专利名称：Dc-cik细胞在制备抗hiv感染的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，涉及DC-CIK细胞在制备抗HIV感染的药物中的应用。
背景技术：
Xm'M (acquired immune deficiency syndrome, AIDS) ^^
(human immunodeficiency virus，HIV)引起的一种慢性传染病。艾滋病在临床上分为3 期艾滋病病毒感染期、艾滋病相关综合征期和艾滋病期。联合国艾滋病规划署和世界卫生组织联合发布的2009年全球艾滋病流行趋势报告显示，目前全球有大约3340万HIV感染者，其中去年新增感染者270万人，200万人死于与艾滋病相关的疾病。在1500万名需要接受终生治疗的AIDS患者中，只有1/3的人在接受治疗。新感染人数仍然超过开始接受治疗的人数。联合国艾滋病规划署发表的2011-2015年战略目标中，要求到2015年实现“零” 新发感染、“零”艾滋病相关死亡和“零”歧视的目标。M^MiBM^^Wiaff (highly active antiretroviral therapy, HAART) 前针对AIDS公认有效的治疗方法，1996年应用于临床以来，AIDS的发病率和病死率已明显下降，患者的免疫功能得到重建，生存质量显著改善，在发达国家HIV感染已成为一种可控的慢性疾病[1]。然而HARRT不能彻底清除体内的病毒，患者须终身用药。由此带来的药物不良反应、病毒耐药性、患者服药依从性与经济负担等问题，成为抗病毒治疗失败的主要原因 [2]。全球已有6大类30余种药物通过美国食品药品监督管理局认证，分别为核苷(酸)类逆转录酶抑制剂(nucleoside/nucleotide reverse transcriptase inhibitors,NRTls)、 非核苷(酸)类逆转录酶抑制剂(non-nucleoside/nucleotide reverse transcriptase inhibitors, NNRTls)、蛋白酶抑制剂(protease inhibitors, Pis)、融合抑制剂、进入抑制剂(entry inhibitors,Els)和整合酶抑制剂。2007年获美国FDA批准的3种新药为=C-C 家族趋化因子受体5 (C-Cchemokine receptor 5，CCR5)抑制剂maraviroc、整合酶抑制剂 raltegravir和第二代非核苷类逆转录酶抑制剂etravirine[3_4]。目前国内药源有限，选择的余地受很大的限制，一线艾滋病抗病毒治疗药物仅有5种可供选择。常用的有①齐多夫定300mg+拉米夫定150mg+奈韦拉平200mg，一日2次；②司他夫定30mg+拉米夫定150mg+ 奈韦拉平200mg，一日2次；⑧齐多夫定300mg+拉米夫定150mg，一日2次，再加依非韦伦 600mg,每晚1次；④司他夫定30mg+拉米夫定150mg，一日2次，再加依非韦伦600mg，每晚 1次。但长期服用HARRT有许多不良反应，主要包括HIV相关营养不良综合征，血脂异常和心血管疾病等[5]。过继免疫治疗(Adoptive cellular immunotherapy，ACI)是近年来引起广泛关注的免疫治疗方法之一，其是通过将具有抗被感染细胞活性，能直接或间接介导抗被感染细胞效应的免疫细胞注入宿主体内的一种治疗方法。树突状细胞(Dendritic cell，DC)是体内功能最强大的抗原递呈细胞，能显著刺激初始型T细胞增殖，在免疫应答过程中处于调控地位，树突状细胞可识别病原，激活获得性免疫系统。成熟的DC可有效抵制被感染细胞的免疫逃逸机制[6]。细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-induced killer cell, CIK)是由多种细胞因子，如抗⑶3单抗(⑶3-McAb)、白介素(IL)-2、干扰素(IFN)-Y及IL-I α 等共同作用培养出的具有细胞毒活性的杀伤细胞，兼有T淋巴细胞的和NK细胞的非MHC限制性杀伤特点，增殖能力强，杀伤活性高。CIK细胞中的效应细胞CD3+CD56+细胞在正常人外周血中仅占 5%，在体外经多因子培养后迅速增多达1000倍以上[7]。DC与CIK共培养后，可促进DC和CIK细胞成熟。目前，DC-CIK细胞的过继性免疫治疗主要应用于抗肿瘤的临床研究和应用中，将CIK细胞与DC联合治疗恶性肿瘤，将有助于解除部分肿瘤患者 T细胞的免疫无能，从而发挥协同抗肿瘤作用[8_⑵。CIK细胞也被应用于乙型肝炎的病毒性疾病的治疗上[13’14]，但将DC-CIK细胞的过继免疫治疗应用于抗HIV病毒治疗上还未见相关报道。由于HAART的局限性，近年来，过继性细胞免疫治疗、细胞因子治疗以及减少负性调节因素和降低免疫活化等新型的抗HIV免疫治疗方法不断涌现。体外大量扩增HIV感染者/艾滋病患者自身的免疫细胞，经过相关修饰或扩增回输到患者体内可以在很大程度上拓宽过继性免疫细胞治疗的适应对象。目前正在尝试的过继性免疫细胞治疗中常用到的细胞有以下几种1、CD8+T细胞CD8+T细胞是具有细胞毒性的免疫细胞，因此，过继性回输CD8+T细胞可以恢复或增强人体的抗病毒能力。研究表明，自体回输CD8+T细胞是安全的，也不会导致病情的恶化，但也不能提高患者体内的CD4+T细胞数量和降低病毒载量， 这些研究为以后对HIV感染者/艾滋病患者提供CD8+T细胞过继性免疫细胞治疗提供了临床安全性的资料，并且，体外扩增CD8+T细胞可以使某一特异性的细胞毒性T淋巴细胞 (cytotoxic lymphocyte, CTL) (Tat特异性)活化、扩增，回输到患者体内后可以发挥一定的抗HIV病毒的能力[15_18]。2、⑶4+T细胞由于⑶4+T细胞是HIV的主要靶细胞，体外扩增CD4+T细胞会导致HIV病毒的大量扩增，回输到人体后会使患者体内病毒载量明显反弹， 许多研究表明，体外扩增CD4+T细胞可以自体回输，并明显增加患者体内的CD4+T细胞的数量，并可以增强体内具有CTL的细胞发挥其细胞毒性作用[19_2°]。3、DC细胞研究表明，经灭活HIV冲击的DC细胞回输到HIV感染者体内后可以降低血浆中病毒载量的水平达到80%， 其中90%的感染者的病毒抑制可以持续1年，这些结果也首次证实灭活的HIV全病毒冲击 DC疫苗可能会成为治疗HIV的有效方法[21]。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供DC-CIK细胞在制备抗HIV感染的药物中的应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞(即DC-CIK细胞)在制备抗HIV 感染的药物中的应用。本发明的有益效果CIK细胞是一种异质细胞群，其主要细胞成分是⑶3+⑶56+细胞，在CIK的绝大部分细胞共同表达⑶8分子，表达率为60% -70%。⑶3+⑶56+细胞来源于⑶3+⑶56-的T淋巴细胞，这群T淋巴细胞表达⑶8而不表达⑶4分子。所以不能成为HIV“攻击”的靶细胞； 并且，CIK细胞具有非致敏性的自然杀伤功能，对HIV感染的细胞具有杀伤作用，所以CIK细胞成为过继性免疫细胞治疗HIV感染的首选细胞。
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DC细胞是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，也是目前所知功能最强的且唯一能激活初始性τ细胞的抗原提呈细胞。我们的体外研究发现，受到HIV冲击的CIK细胞在和 DC细胞共培养时可以明显促进DC细胞的成熟。DC-CIK与K562细胞共培养对K562细胞的杀伤比例为16. 42士3. 14%，而单独的CIK细胞对K562细胞的杀伤比例为10. 88士3. 20%, 两者之间有显著性差异(P < 0. 01)(图4)。这也就意味着经过HIV冲击过的DC-CIK共培养细胞对在细胞膜上组织相容性抗原异常表达的细胞具有更强的杀伤作用。这表明当DC 和CIK细胞联合使用具有相互促进的提呈和杀灭受HIV感染细胞的作用。江苏省疾病预防控制中心伦理学委员会审查并通过了体内实验的研究内容，但由于受到伦理学的限制，不能做对照研究，在体内实验只能使用DC-CIK细胞联合使用的治疗方法对HIV感染者进行过继性免疫细胞治疗。体内实验结果与体外实验结果完全一致，在DC-CIK细胞回输的30天后，HIV感染者⑶4T细胞的数量显著升高，NK和CIK细胞杀伤功能增强，HIV病毒载量明显得到抑制。
图1.HIV阴性者、HIV感染者和不同途径传播的艾滋病患者的DC细胞百分比含量。A图为艾滋病阴性者、HIV感染者和不同途径传播的艾滋病患者DC细胞百分比含量的点状图和两两之间的统计学分析；B为A图的柱状图和标准差；*代表P < 0. 05，**代表 P < 0. 01，*** 代表 P < 0. 001。图2⑶3+⑶56+的CIK细胞在HIV感染者外周血PBMC中的含量。A图为⑶3+⑶56+的CIK细胞的流式细胞仪检测图，B图为A图的柱状图和标准差； 其中“Control”为HIV阴性者CIK细胞的检测图，Gate 2内的细胞为CD45+，CD45+细胞再以CD3和CD56标记检测，在HIV阴性者的平均百分含量为4. 92士2. 59% ；“HIV”为HIV感染者CIK细胞的检测图，Gate 2内的细胞为⑶45+，⑶45+细胞再以⑶3和⑶56标记检测， 在HIV感染者中的平均百分含量为57. 89士8. 59%，两者间有显著性差异，P < 0. 001。图3CIK细胞与DC细胞共培养后DC细胞表面⑶80、⑶83和⑶86的表达情况。图4DC-CIK共培养与单独CIK细胞对K562细胞的杀伤作用比较。图5自体DC-CIK细胞回输前后⑶4T细胞绝对数比较。图6自体DC-CIK细胞回输前后NK细胞在外周血百分含量的变化。图7自体DC-CIK细胞回输前后NK细胞对K562细胞在体外的杀伤作用比较。图8自体DC-CIK细胞回输前后NK细胞表面IQR3DL1表达百分含量比较。图9自体DC-CIK细胞回输前后NK细胞表面NKP80表达百分含量比较。图10自体DC-CIK细胞回输前后CIK细胞在外周血中百分含量比较。回输前 CIK (⑶3+⑶56+)细胞在PBMC中的含量为57. 89士8. 59%，回输后CIK细胞在PBMC中的含量则为69. 26士9. 23%，两者之间有显著性差异，P < 0. 05。图11自体DC-CIK细胞回输前后CIK细胞对K562细胞在体外的杀伤作用比较。图12自体DC-CIK细胞回输前后HIV病毒载量比较。
具体实施例方式实施例IHIV感染者/艾滋病患者DC和CIK细胞含量和功能检测
1.取材分别取HIV阴性者、HIV感染者和不同途径传播的艾滋病患者外周血 10ml，EDTA-a(抗凝(BD Vacutainer USA)，用 1 XPBS磷酸盐缓冲液(Invitrogen，USA) 1 1 稀释，然后缓慢的将稀释后的血液加到淋巴细胞分离液(GE Healthcare, Sweden)的上面， 1500rpm离心30分钟分离外周血淋巴细胞(PBMC)，1 XPBS洗2次，以备下列分析。2. DC和CIK细胞在外周血内的含量检测取以上经分离洗涤后的PBMC，细胞总数量为 106 个。IXPBS 稀释至 100 μ 1。DC 细胞使用 PE_Cy5. 5-HLA_DR(Pharmingen USA)、 APC-CDllc(Pharmingen)和 PE-CD123 (Pharmingen)来标记，CDllc+CD123+ 阳性的细胞即定义为 DC 细胞，CIK 细胞使用 CD45PE/CD56PE-Cy5. 5/CD3 Alex Flour 488 (Pharmingen)共同进行标记。上述标记的细胞室温避光孵育20分钟后上流式细胞仪检测，共获取105个细胞。在HIV感染者和不同途径传播的艾滋病患者外周血中，DC细胞的含量与HIV阴性者比较无明显差异(图1)，但CIK细胞在PBMC的含量与HIV阴性者比较却明显上升，有显著性差异(P < 0.001，图 2)。3. DC和CIK细胞的共培养取上述分离洗涤后的PBMC细胞，用 RPMI1640 (Invitrogen, USA)培养液调整细胞密度为 5X IO6 个 /ml，置于 37 °C，5 % CO2培养箱中培养4小时；收集非贴壁细胞，用含10 %胎牛血清(GIBCO，Uruguay)的 RPMI 1640培养液调整细胞密度为(1-2) X IO6个/ml，进行体外诱导，在含1000U/ ml的重组IFN- y (PERPROTECH, USA)的完全培养基中悬浮培养M小时后，加入重组 IL-I α (PERPROTECH, USA)100U/ml,鼠抗人 CD3McAb(eBioscience, USA)50ng/ml,重组 IL-2 (PERPROTECH, USA) lOOOU/ml,每2天半量换液1次，补充重组IL-2，以此获取CIK细胞；将贴壁细胞接种于细胞培养瓶中，加入含重组IL-4 (PERPROTECH，USA) 500U/ml、重组 GM-CSF (PERPROTECH, USA) lOOng/ml 的 RPMI1640 培养液，置 37°C，5% CO2 孵箱中培养，隔日半量换液，并补加首次浓度半量的上述细胞因子；在培养第6天，加入终浓度为lOOng/ml的重组TNF- α (PERPROTECH, USA)，以此获取DC细胞。分别收获CIK、DC细胞，计数后按1 5 的比例混合后，体外共培养3天，获得DC-CI K细胞M。4. HIV感染者DC和CIK细胞的共培养的效应将获得的共培养DC-CIK细胞用 IXPBS稀释，以PE-Cy5. 5-HLA-DR、APC_CDllc和PE-CD123作为DC细胞的标记，然后分别用 FITC-CD80(Biolegend, USA)，FITC-CD83 (Biolegend，USA)和 FITC-CD86 (Biolegend，USA) 作为DC细胞成熟的标记。在所有的抗体标记20分钟以后，用流式细胞仪检测DC细胞上 ⑶80、⑶83和⑶86的表达。研究结果显示，受到HIV冲击的CIK细胞在和DC细胞共培养时可以明显促进DC细胞的成熟(图3)。5. DC-CIK细胞在体外对K562肿瘤细胞的杀伤作用将分离和洗涤后的HIV阳性的PBMC细胞，分别按照上述方法，扩增获取CIK细胞和DC-CIK细胞用于杀伤功能研究，CIK细胞和DC-CIK细胞为效应细胞。K562细胞(ATCC CCL-243)为靶细胞，将K562细胞收获后，用2μΜ的活细胞荧光燃料CFSE(Sigma，USA)染色 10分钟，染色后的细胞以IXPBS洗3次，然后将效应细胞/靶细胞(DC-CIK或CIK/K562) =10/1的比例接种于96孔板上，每孔的靶细胞为IO5个；每孔用200 μ 1 RPMI-1640培养基 370C 5% CO2培养4小时，然后将培养的混合细胞用浓度为100 μ g/ml PI (Sigma,USA)染色 5分钟。用于标记被杀死细胞的DNA[22]。标记完成后使用流式细胞仪检测5000个CFSE+/ PI+的细胞。结果显示DC-CIK与K562细胞共培养的CFSE+/PI+的比例为15. 56士3. 77%，而CIK细胞与K562细胞共培养的CFSE+/PI+的比例为10. 14士2. 49%，两者之间有显著性差异(P < 0. 01)(图4)。这也就意味着经过HIV冲击过的DC-CIK共培养细胞对在细胞膜上组织相容性抗原异常表达的细胞具有更强的杀伤作用。实施例2自体DC-CIK细胞的制备和回输1.DC和CIK细胞的制备使用血细胞分离机采集患者的外周血PBMC，经去除血浆、 分离、洗涤和计数后，分别按照实施例1的方法培养DC和CIK细胞，并将分别培养6天的DC 和CIK细胞共培养3天。细胞采集后的分离等操作均应在无菌实验室内操作，每个环节都要严格按照无菌规则进行操作，并对每批次的细胞做无菌检测，以确保细胞没被污染。2. DC和CIK细胞的回输收集共培养的DC和CIK细胞，DC细胞用0. 25%胰蛋白酶消化5分钟后收集下来。收集到的DC和CIK细胞用不含血清的1640培养基洗3次。DC 细胞在收集后立即在近淋巴结部位皮下注射，这几个部位分别是在两侧的锁骨上窝，腋窝和腹股沟6个部位。每个部位的注射量和速度要均勻，注射完毕后压住针眼，防止细胞液由针眼处渗出。所有操作均严格按照无菌规则进行。CIK细胞的回输采取静脉滴注的方式进行，回输时的速度由低速逐渐加快，尽量在30分钟-1小时内输完。回输过程中要不断摇勻细胞，最后冲管。整个治疗应严格按照无菌规则进行。在回输细胞过程中要密切观察患者的反应，及时处理副反应，最常见的副反应是在回输的2-6小时内出现发热症状，主要是因为CIK细胞的培养过程中使用重组人IL-2所导致的。实施例3自体细胞回输后患者的疗效观察1.自体细胞回输后患者的跟踪随访在患者回输细胞后的第0，3，5，10，30，60， 90，120，240和360天分别对患者进行医学随访。随访的主要内容为第0_10天的随访主要了解患者在回输细胞后的副反应，在随访过程中采集患者IOml血液，EDTA抗凝。以后的医学随访主要是观察回输细胞后的疗效，并了解患者在回输细胞治疗后的相关信息，如是否有相关的机会性感染出现，是否有高危性行为等，同时采集患者IOml血液，EDTA抗凝。上述采集的抗凝血需在2小时内进入实验室，以进行下面的操作。2.自体细胞回输前后患者疗效检测患者疗效的检测主要是针对T淋巴细胞、NK 细胞、CIK细胞、DC细胞和HIV病毒载量展开。具体的检测流程为1) T淋巴细胞绝对计数①按照中国疾病预防控制中心《艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴细胞检测质量保证指南》，取 Multitest CD3 FITC/CD8 PE/CD45 PerCP/CD4 APC(BD Bioscience, USA)四色试剂20 μ 1加入到绝对计数管中，轻轻摇勻；②将上述以EDTA抗凝的全血在48小时内送实验室进行检测处理，所有实验均应在二级生物安全实验室内进行，并做好个人生物安全防护，防止职业暴露的发生。将50μ 1 全血加入到上述已经加入四种荧光抗体的绝对计数管中，振荡混勻，室温(25°C )避光染色 15分钟。⑧将IOX 的 BD FACS Lysing Solution 稀释至 1 X 备用。将 450 μ 1 IXBD FACS LysingSolution加入至上述染色的细胞中，振荡混勻，室温(25°C )避光裂解红细胞15分钟。④将BD FACS流式细胞仪开机预热30分钟，用BD公司标准校准微球校准仪器。使用Multiset软件，将完成红细胞裂解的细胞悬液上机，共获取IO5个细胞。分析⑶4T细胞(⑶3+⑶4+细胞)和⑶8T细胞(⑶3+⑶8+细胞)的绝对数以及⑶4/⑶8的比值。参考范围分别为:CD4T 细胞为 410-1590 个/μ 1，CD8T 细胞为 190-1140 个/μ 1，CD4/CD8 > 1. 0。 按照世界卫生组织(WHO)的标准，当⑶4T细胞< 200个/ μ 1时即进入艾滋病期(AIDS)，另外，HIV感染者/艾滋病患者⑶4+/⑶8+的比值是倒置的，一般< 1.0。所以T细胞计数能很好的判断在自体DC-CIK细胞回输后，HIV感染者/艾滋病患者的T细胞免疫重建的情况以及HIV感染者/艾滋病患者的病程进展状况。检测结果说明，在自体回输DC-CIK细胞的 30天后，⑶4T细胞绝对计数明显回升，回输前后具有极显著差异(P < 0. 001，图幻，⑶4/ ⑶8的比值更加接近1.0。2) NK细胞检测百分含量检测①将20 μ 1 CD45 PE/CD56 PE_Cy5. 5/CD3 Alex Flour 488 (Pharmingen)三色试剂加入到i^alcon管中；②取上述EDTA抗凝血10ml，使用淋巴细胞分离液分离PBMC,获得的PBMC经1 XBD FACS Lysing solution裂解15分钟，1 XPBS洗 2次，最后将PBMC细胞用IXPBS稀释至100 μ 1，取20 μ 1 PBMC细胞悬液加到已经加入三色荧光抗体的i^alcon管中，室温、避光染色15分钟。⑧染色后，以IXPBS将细胞稀释至 200 μ 1，BD流式细胞仪的CellQuest软件进行检测和分析，共收获IO5个细胞，首先以⑶45 设门，然后在此门的细胞进行⑶3/⑶56的标记检测。NK细胞为⑶3-/⑶56+的细胞，在自体 DC-CIK细胞回输30天后，NK细胞在PBMC的百分含量较回输前大幅度提高(P < 0. 001，图 6)。杀伤功能检测将获得的PBMC细胞用IXPBS洗2次，然后用Iml的含10%胎牛血清的RPMI-1640重悬细胞，然后加入200U/ml的重组IL-2和50ng/ml的PMA，置37°C， 5% C02培养箱中培养M小时，增殖获得NK细胞。K562用2 μ M的CFSE于37°C标记10分钟，标记后用IXPBS洗3次。NK细胞为效应细胞，K562细胞为靶细胞，每个样品调整K562 为IO5个细胞，将效应细胞/靶细胞=10 1的比例进行混合，用RPMI-1640重悬细胞至 200 μ 1并置96孔板37°C，5% CO2培养箱中培养4小时。然后加入100 μ g/ml PI染色5分钟，标记完成后使用流式细胞仪检测5000个CFSE+/PI+的被NK细胞杀死的K562细胞(图 7)。结果显示DC-CIK细胞回输30天后，NK细胞的杀伤功能得到了显著提升(P < 0. 001)。NK细胞受体检测NK细胞受体在NK细胞上的表达情况是影响其杀伤功能的重要因素，因此，检测其细胞表面主要受体变化情况能较好的反应NK细胞的功能。根据前期的研究结果，在病人回输DC-CIK细胞的前后，检测NK细胞的抑制性受体KIR3DL1和激活性受体 NKP80 的表达情况。将 PBMC 用 1 XPBS 稀释至 100 μ 1，加入 CD56 PE_Cy5. 5/CD3 Alex Flour 488 混勻后再分别加入 KIR3DL1 PE (Biolegend)和 NKP80PE (Biolegend)，室温、避光染色15分钟。染色后，以IXPBS将细胞稀释至200 μ 1，BD流式细胞仪的CellQuest软件进行检测和分析，共收获IO5个细胞。分析结果显示，DC-CIK细胞回输30天后IQR3DL1在NK 细胞表面的表达明显下调(P < 0. 01，图8)，而ΝΚΡ80的表达则明显上调，回输前后有显著性差异(Ρ<0.01，图9)。这与其在NK细胞的功能是密切相关的，IQR3DL1的下调，对NK细胞杀伤功能的抑制作用减弱，ΝΚΡ80的上调刚好是对NK细胞杀伤功能的促进，这和DC-CIK 细胞回输30天后，NK细胞的杀伤功能得到了显著提升是相吻合的。3) CIK细胞的检测百分含量的检测将DC-CIK细胞回输前后的PBMC用CD45PE/CD56PE_Cy5. 5/
8⑶3Alex Flour 488标记，检测流程参照实施例1的“DC和CIK细胞在外周血内的含量检测”，分析结果表明在回输DC-CIK细胞的30天后，CIK细胞在HIV感染者体内的含量明显提升(P < 0. 05，图 10)。杀伤功能的检测将DC-CIK细胞回输前后的PBMC参照实施例1中的“DC-CIK细胞在体外对K562肿瘤细胞的杀伤作用”方法，扩增CIK细胞后，在体外对K562细胞进行杀伤作用检测。检测结果显示在回输DC-CIK细胞的30天后，CIK细胞对K562细胞的杀伤作用明显比回输前的高，有显著性差异(P <0.001，图11)。4) HIV病毒载量检测本检测使用罗氏HIV-I检测试剂盒进行操作。首先预冷冷冻高速离心机到4°C ； 准备1.5ml的带螺旋盖的离心管用于阴性、低阳性、高阳性对照和样本的制备，并做好序号标记；在相应的对照离心管中加入500 μ 1经过涡旋振荡的NHP ；在相应的样本离心管中加入500μ 1经过涡旋振荡的样本；将样本和对照离心管放入高速离心机中，标记朝外，使沉淀排列在外侧，2-8°C，23，600g离心60分钟；记录对照及样本的位置和序号；每日新鲜制备的70%酒精在Hml的无水乙醇中加入6mi的去离子水，或在IlmL的95%的乙醇中加入 4ml的去离子水，处理1个样品需要Iml的70%乙醇；25_37°C温育HIV-1 Monitor Lysis Buffer，使试剂中的沉淀完全溶解，充分混勻；配置工作裂解液取25 μ 1涡旋振荡的HIV-I MonitorQuantitation Standard(HIV-1QS, vl. 5)，力口入至Ij 一个 HIV-I Monitor Lysis Buffer小管中，涡旋振荡充分混勻；使用一次性的Tip头移去所有的离心上清液，不要搅动沉淀；在每个1. 5ml样本离心管中加入600 μ 1的工作裂解液；涡旋混勻；在相应的对照离心管中加入12. 5μ 1经涡旋振荡的HIV-1(-)C、HIV-1L(+)C、HIV-1H(+)C，并充分涡旋振荡； 所有离心管在室温下温育10分钟；每个离心管中加入600 μ 1的异丙醇并充分涡旋振荡； 离心管放置于离心机中，标记朝外；13，000-16，000g，室温离心15分钟；使用一次性的Tip 头移去离心上清液，注意不要搅动沉淀；每个离心管中加入Iml 70%的乙醇(新鲜配置) 并涡旋振荡混勻；将离心管放置于离心机中，标记朝外，在13，000-16，OOOg室温离心5分钟；使用一次性的Tip头移去离心上清液，不要搅动沉淀；使用含滤芯的Tip头将残留的上清彻底去除；每个离心管中加入100μ 1的HIV-I Monitor Specimen Diluent (样本稀释液)；涡旋振荡离心管10秒钟，重悬沉淀；使用含滤芯的Tip头在相应的A-ring扩增管中加入50°C的处理好的样本或对照；不要加入任何的沉淀物质；然后在罗氏COBAS AMPLICA 上进行检测。检测结果显示在回输自体DC-CIK细胞的30天后，HIV病毒载量明显得到抑制，具有显著性差异(P <0.01, 12)。参考文献[1]王鹏飞，焦艳梅，朱焕章等.HIV/AIDS治疗进展.首都医科大学学报，2010，31 715-718[2]罗玲，李太生.AIDS抗病毒治疗的历史、现状与未来.传染病信息，2009，22 321-329[3]Mills A,Cahn P,Grinsztejn B,et al. DUET-I 24 week results of a phase III randomiseddouble-blind trial to evaluate the efficacy and safety of TMC125 versus placeboin 612treatment_experienced HIV-I infected patients[EB/0L]. [2009-09-10]. http://www. ias2007. org/pag/Abstracts. aspx ？ AID = 5515.
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1.共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞在制备抗HIV感染的药物中的应用。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，公开了DC-CIK细胞在制备抗HIV感染的药物中的应用。发明人通过大量实验发现受到HIV冲击的CIK细胞在和DC细胞共培养时可以明显促进DC细胞的成熟。当DC和CIK细胞联合使用具有相互促进的提呈和杀灭受HIV感染细胞的作用。在DC-CIK细胞回输的30天后，HIV感染者CD4T细胞的数量显著升高，NK和CIK细胞杀伤功能增强，HIV病毒载量明显得到抑制。因此，共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞可在制备抗HIV感染的药物中应用。
文档编号A61P31/18GK102512448SQ20111045394
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者丁建平, 丁萍, 傅更锋, 冯晓英, 刘晓燕, 徐晓琴, 徐金水, 李雷, 王小亮, 羊海涛, 胡海洋, 还锡萍, 邱涛, 郭宏雄, 闫红静, 陈国红 申请人:江苏省疾病预防控制中心