专利名称：一种三甲基壳聚糖-接枝-聚乙二醇/核酸脑靶向胶束及其制备方法
技术领域：
本发明属于医药基因治疗领域，涉及新型高效非病毒载体的制备方法和技术，具体涉及一种由乙酰胆碱受体介导的三甲基壳聚糖-接枝-聚乙二醇-脑靶向功能肽/核酸脑靶向胶束及其制备方法。
背景技术：
世界上罹患神经退行性等脑部疾病的人数正逐年增加，但治疗此类疾病的有效药物还为数不多。核酸类药物因具有特异性高，作用迅速、安全、高效等优点已成为医药领域研究的前沿。但核酸类药物在应用中存在着难以克服的问题:一是体内存在大量核酸酶，它可以水解核酸的磷酸二酯键，使得药物在到达靶点前就被降解而失效；二是核酸类药物对细胞膜的通透性较差，难于通过细胞膜到达靶部位。目前解决上述问题的方法主要采用病毒或非病毒载体实现核酸类药物的给药。其中，以病毒外壳作载体则可能引起宿主的血清免疫反应。相比之下，非病毒载体具有免疫源性低 、成本低、不限制基因药物体积等诸多优势，已成为目前核酸类药物载体的重要研究方向。目前研究的非病毒载体主要包括:脂质体、纳米粒及多聚阳离子等。此类载体载核酸多采用带有高密度正电荷的阳离子脂质或阳离子聚合材料与带负电的核酸借助静电作用形成脂质体、纳米粒、胶束等可控性强、毒性低的传递系统。由于中枢神经系统和体循环之间血脑屏障(BBB)的存在，限制了许多有潜力的药物(尤其是核酸药物)从血液进入脑部发挥作用。目前促进药物透过BBB的方法主要有以下四种。其中，人为开启BBB上的致密连接，会无选择性的使有害物质与药物同时入脑；对药物进行结构改造可能导致药物疗效及体内药动学参数降低或改变；改变给药途径主要包括颈动脉输注以及鼻腔给药，前者易对脑造成伤害，后者生物利用度低，很难满足临床要求；通过受体介导则不存在上述缺点，是目前脑部药物传递系统研究的热点。2007年，Priti Kumar等(Kumar P，Wu HQ, McBride JL, et al.Transvasculardelivery of small interfering RNA to the central nervous system.Nature, 2007，448: 39-43)研究报道一种含有29个氨基酸的小肽RVG具有乙酰胆碱受体的靶向性，乙酰胆碱受体主要分布在脑细胞上，包括被用作BBB模型的脑毛细管内皮细胞，这可使该肽修饰的载体同时具有高效透过BBB与靶向脑细胞的能力。实验证明，该小肽不仅自己可通过BBB,而且通过在羧基端连接的9聚精氨酸可将FITC标记的siRNA载带入脑。静脉注射给药后，SiRNA有效实现靶基因沉默作用，而且在脾和肝中检测不到FITC荧光，这表明该小肽具有强趋脑性和脑细胞靶向性。含PEG侧链和聚阳离子主链的接枝共聚物与带有负电荷的核酸可以通过静电复合自组装成聚离子复合胶束该胶束作为核酸类药物脑靶向传递系统，具有以下优点:核/壳结构既能延长药物在血液中的滞留时间，又能保护药物避免与酶接触；胶束粒径小，穿透力强，稳定性好，连接脑靶向功能肽后可实现主动靶向；可通过血脑屏障；制备过程温和，可最大限度地保持药物活性。综上，本发明制备了具有脑靶向功能肽RVG修饰的核酸聚离子复合胶束，以实现核酸类药物通过血脑屏障和脑主动靶向定位，并解决其在体内易降解、不稳定及转染效率低等临床应用缺陷。
发明内容
本发明的目的是制备一种由乙酰胆碱受体介导的三甲基壳聚糖-接枝-聚乙二醇-脑靶向功能肽/核酸的脑靶向胶束，以实现核酸类药物通过血脑屏障和脑主动靶向定位，并解决其在体内易降解、不稳定及转染效率低等临床应用缺陷。本发明以针对阿尔茨海默症设计的SiRNA (序列为5' -GUGCCUACCUGGACAAGAAdTdT-3')作为核酸类药物的模型药，采用的技术方案如下(如
图1)。将壳聚糖(Chitosan)季铵化制得三甲基壳聚糖(TMC)，在三甲基壳聚糖上接入聚乙二醇制得三甲基壳聚糖-接枝-聚乙二醇，然后，在聚乙二醇的另一端接入脑靶向功能肽RVG，制得乙酰胆碱受体 介导的三甲基壳聚糖-接枝-聚乙二醇-脑靶向功能肽(TMC-g-PEG-RVG)，使其具有透过血脑屏障与脑靶向的功能，最后，将该材料与荷负电的核酸通过静电复合作用自组成脑主动靶向胶束。本发明所述的三甲基壳聚糖-接枝-聚乙二醇-脑靶向功能肽的制备包括如下步骤:
I)壳聚糖的纯化:
本发明所述壳聚糖重均分子量为5 - 500kD,脱乙酰度为80% - 95%。具体纯化步骤如下所述:
将壳聚糖溶于1%醋酸水溶液，抽滤后以氨水调节滤液PH值至7.0沉淀壳聚糖，抽滤后冷冻干燥。2)三甲基壳聚糖的制备:
本发明选用碘甲烷作为甲基化试剂，具体制备方法如下所述:
权利要求
1.一种三甲基壳聚糖-接枝-聚乙二醇-脑靶向功能肽/核酸脑靶向胶束，其特征在于，所述的胶束由荷正电的三甲基壳聚糖-接枝-聚乙二醇-脑靶向功能肽与荷负电的核酸经静电复合作用自组装而成。
2.根据权利要求1所述的三甲基壳聚糖-接枝-聚乙二醇-脑靶向功能肽/核酸脑靶向胶束，其特征在于，所述的三甲基壳聚糖-接枝-聚乙二醇-脑靶向功能肽为壳聚糖依次经季铵化修饰得到三甲基壳聚糖，三甲基壳聚糖的胺基与两端活化聚乙二醇的一个活性基团反应得到三甲基壳聚糖-接枝-聚乙二醇，聚乙二醇另一活性基团与脑靶向功能肽反应RVG所得。
3.根据权利要求1所述的三甲基壳聚糖-接枝-聚乙二醇-脑靶向功能肽/核酸脑靶向胶束，其特征在于，所述的壳聚糖重均分子量为10-150kD，脱乙酰度为80%-95%。
4.根据权利要求2所述的三甲基壳聚糖-接枝-聚乙二醇-脑靶向功能肽/核酸脑靶向胶束，其特征在于，季铵化率为10% - 99%，摩尔百分数。
5.根据权利要求2所述的三甲基壳聚糖-接枝-聚乙二醇-脑靶向功能肽/核酸脑靶向胶束，其特征在于，所述聚乙二醇的通式为R1- (CH2CH2O)n-R2,式中n=20 - 200，R1为可与氨基反应生成聚乙二醇酰胺键的活性基团，包括琥珀酰亚胺基团、乙酸基团、乙醛基团、异氰酸基团、异氰硫酸基团、丙烯酸基团、硝基酚基团，R2为可与巯基反应的活性基团，包括马来酰亚胺基团、乙烯砜基团、硫醇基团。
6.根据权利要求1所述的三甲基壳聚糖-接枝-聚乙二醇-脑靶向功能肽/核酸脑靶向胶束，其特征在于，所述脑靶向功能肽为RVG，含有29个氨基酸，其序列为YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG。
7.—种如权利要求1所述的三甲基壳聚糖-接枝-聚乙二醇-脑靶向功能肽/核酸脑靶向胶束的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 壳聚糖的纯化； (2)三甲基壳聚糖的制备； (3)三甲基壳聚糖-接枝-聚乙二醇的制备； (4)三甲基壳聚糖-接枝-聚乙二醇-脑靶向功能肽的制备； (5)三甲基壳聚糖-接枝-聚乙二醇-脑靶向功能肽可与荷负电的核酸自组装成脑主动靶向胶束。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中反应温度为4- 50°C，反应时间为3 - 480分钟，聚乙二醇的接枝率为5% - 35% (摩尔百分数)。
9.根据权利要求7中所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中:三甲基壳聚糖-接枝-聚乙二醇在pH6 - 9的磷酸盐缓冲液中与脑靶向功能肽RVG反应，反应温度为15 -30°C，反应时间为8-24小时。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，将三甲基壳聚糖-接枝-聚乙二醇-脑靶向功能肽溶解于DEPC处理过的水中，然后通过0.22 y m的滤膜除菌，将核酸溶于DEPC处理过的水中，将以上两种溶液于室温混合，涡旋5-30 s使之混合均匀。
11.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，所制备的胶束的粒径分布为10-700nm，Zeta 电位为 +ImV - +15mV。
12.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所制备胶束的三甲基壳聚糖-接枝-聚乙二醇-脑靶向功能肽与 核酸的+/-电荷比为1:4 - 64:1。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，涉及一种由乙酰胆碱受体介导的三甲基壳聚糖-接枝-聚乙二醇/核酸脑靶向胶束及其制备方法。三甲基壳聚糖-接枝-聚乙二醇-脑靶向功能肽为壳聚糖依次经季铵化修饰得到三甲基壳聚糖，三甲基壳聚糖的胺基与两端活化聚乙二醇的一个活性基团反应得到三甲基壳聚糖-接枝-聚乙二醇，聚乙二醇另一活性基团与脑靶向功能肽RVG反应制得。本发明以离子复合物胶束作为载体，以脑靶向功能肽RVG作为靶向分子，实现核酸药物通过血脑屏障和脑主动靶向定位。本发明的离子复合物胶束由荷正电的三甲基壳聚糖-接枝-聚乙二醇-脑靶向功能肽与荷负电的核酸经静电复合生成。本发明解决了核酸药物在体内易降解、不稳定及转染效率低的缺陷。
文档编号A61K9/10GK103182087SQ20111045357
公开日2013年7月3日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者姜同英, 王思玲, 高亦鲲 申请人:沈阳药科大学