一种含类胡萝卜素单体的浓缩物及其制备方法与它的用途的制作方法

专利名称：一种含类胡萝卜素单体的浓缩物及其制备方法与它的用途的制作方法
一种含类胡萝卜素单体的浓缩物及其制备方法与它的用途
技术领域：
本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种含类胡萝卜素单体的浓缩物，还涉及所述含类胡萝卜素单体的浓缩物的制备方法，还涉及所述含类胡萝卜素单体的浓缩物的用途。
背景技术：
类胡萝卜素是一类重要的天然色素的总称，普遍存在于动物、高等植物、真菌、藻类和细菌中，是使其呈现黄色、橙红色或红色的主要物质。类胡萝卜素不溶于水，能够溶于脂溶性溶剂，因此也称脂色素。由于其分子结构中大量不饱和双键的存在，大多数类胡萝卜素都具有较强的抗氧化能力，如虾青素、α -隐黄质、β -隐黄质、玉米黄质、叶黄素酯等。近年研究发现，类胡萝卜素对人体具有重要的生理功能，如虾青素有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、预防心脑血管疾病的作用，β -隐黄质在抗癌、抗氧化、减少心血管疾病发病率、增强免疫功能等方面具有独特的作用，叶黄素及玉米黄素具有保护视力、缓解视疲劳及增强免疫力的作用。虽然自然界中有较丰富的类胡萝卜素存在，但是因为类胡萝卜素分子结构的高度不饱和性及游离羟基的存在，使得天然类胡萝卜素多以类胡萝卜素酯的状态存在。由于类胡萝卜素酯的油溶特性，很大程度上阻碍了其在人体体液环境中的吸收与利用。目前市场上销售的类胡萝卜素类产品以类胡萝卜素酯为主的，普遍存在吸收困难与利用率不高的问题。已研究证明，类胡萝卜素单体具有比类胡萝卜素酯更强的亲水性及生理活性。化学合成法虽然能够得到类胡萝卜素单体物质，但是，人工合成的类胡萝卜素不仅价格昂贵，而且同天然类胡萝卜素相比，在结构、功能、应用及安全性等方面均存在显著差异。以虾青素为例，在结构上，人工合成的虾青素是左旋、消旋和右旋三种结构的混合物，抗氧化活性极低，只有藻源的虾青素才是100%左旋，具有最强的生物学活性；在生理功能方面，人工合成虾青素的稳定性和抗氧化活性均比天然虾青素低；在应用效果上人工合成的虾青素的吸收效果也比天然虾青素差；在生物安全方面，由于在化学合成中不可避免的引入化学杂质及合成过程中产生的非天然副产物等，使合成的虾青素产品存在一定的安全性隐患，美国食品与药品管理局已经禁止化学合成的虾青素进入保健食品市场。因此，有必要开发一种将天然存在的类胡萝卜素酯转化为类胡萝卜素单体的方法，以获得类胡萝卜素单体，从而满足广大消费者对健康性资源产品的需求。本发明人经过大量实验研究，终于完成了本发明。

发明内容[要解决的技术问题]本发明的目的是提供一种含类胡萝卜素单体的浓缩物。本发明的另一个目的是提供一种含类胡萝卜素单体的浓缩物的制备方法。本发明的另一个目的是提供所述含类胡萝卜素单体的浓缩物的用途。
[技术方案]本发明是通过下述技术方案实现的。本发明涉及一种含类胡萝卜素单体的浓缩物的制备方法。该制备方法步骤如下将1 10重量份天然类胡萝卜素酯浓缩物与0. 1 20重量份表面活性剂充分混合得到一种反应底物，然后，逐渐向所述的反应底物中加入Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液，使该反应底物转换为水包油乳液状，接着往所述乳液中加入10 100重量份脂肪酶或酯酶酶液，在温度18 55°C下进行酶解反应30min 120h ；酶解反应后再用水溶性有机溶剂进行破乳，得到的破乳酶解反应液接着用极性有机溶剂进行萃取，两相分离后萃余液弃去，而萃取液进行真空浓缩，于是得到一种含类胡萝
卜素单体的浓缩物。根据本发明的一种优选实施方式，所述的天然类胡萝卜素酯是一种或多种选自来源于雨生红球藻的虾青素单酯及双酯，来源于冰凉花的虾青素双酯，来源于酸浆果实的β -隐黄质与α -隐黄质，来源于枸杞、酸浆果实、万寿菊或玉米的玉米黄质酯及叶黄素酯或其它来源的类胡萝卜素酯的天然类胡萝卜素酯浓缩物；在天然类胡萝卜素酯浓缩物中，天然类胡萝卜素酯的含量是以所述浓缩物总重量计 0. 05 30%。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的表面活性剂是一种或多种选自磷脂、吐温80、吐温60、吐温20、蔗糖酯或聚甘油酯的表面活性剂。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的脂肪酶或酯酶的酶活> 200IU/g。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的水溶性有机溶剂选自乙醇、甲醇、丙
酮、乙二醇或二甲基亚砜。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的极性有机溶剂选自乙醇、丙醇、丁醇、四氢呋喃、丙酮、氯乙烷或三氯甲烷。根据本发明的另一种优选实施方式，在用极性有机溶剂萃取时，在破乳酶解反应液与极性有机溶剂的体积比11 5与室温的条件下萃取1 4次。根据本发明的另一种优选实施方式，分离的萃取液在压力-0. 06 -0. 09MPa与温度20 40°C的条件下进行真空浓缩至干。本发明还涉及采用所述制备方法得到的含类胡萝卜素单体的浓缩物。该浓缩物含有以该浓缩物总重量计0. 1 15.0%类胡萝卜素单体。本发明还涉及所述的含类胡萝卜素单体的浓缩物在制备食品添加剂、功能性食品、药品、饲料添加剂和化妆品中的用途。下面将更详细的描述本发明。本发明涉及一种含类胡萝卜素单体的浓缩物的制备方法。该制备方法步骤如下将1 10重量份天然类胡萝卜素酯浓缩物与0. 1 20重量份表面活性剂充分混合得到一种反应底物，然后，逐渐向所述的反应底物中加入Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液，使该反应底物转换为水包油乳液状，接着往所述乳液中加入10 100重量份脂肪酶或酯酶酶液，在温度18 55°C下进行酶解反应30min 120h。
根据本发明，所述的天然类胡萝卜素酯浓缩物是以天然植物或微生物为原料，经提取、分离、浓缩而得到的天然类胡萝卜素酯浓缩物。所述的天然类胡萝卜素酯浓缩物可以是在类胡萝卜素酯提取过程中得到的初级产品，也可以是该初级产品经过精制而得到的高含量类胡萝卜素酯的产品，即在类胡萝卜素酯浓缩物中类胡萝卜素酯含量为以重量计0. 以上的产品。由于初级产品精制过程非常复杂，精制过程还会造成大量目标物丢失，所以本发明一般使用含类胡萝卜素酯的初级产品，即所述的类胡萝卜素酯浓缩物，其扫描光谱图见附图1。在本发明中，含类胡萝卜素酯的初级产品与类胡萝卜素酯浓缩物两个概念是等同的，是可以互换使用的。因此，这种初级产品的天然类胡萝卜素酯含量是以所述初级产品总重量计0. 05 30 %，优选地是0. 1 30 %，更优选地是0. 5 15 %。所述的天然类胡萝卜素酯浓缩物是一种或多种选自来源于雨生红球藻的虾青素单酯及双酯，来源于冰凉花的虾青素双酯，来源于酸浆果实的β-隐黄质与α-隐黄质，来源于枸杞、酸浆果实、万寿菊或玉米的玉米黄质酯及叶黄素酯或其它来源的类胡萝卜素酯的天然类胡萝卜素酯浓缩物。雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)属于绿藻门、团藻目、红球藻属，又名湖生红球藻或湖生血球藻，是一种普遍存在的绿藻。雨生红球藻中的虾青素含量极高，它的含量约是雨生红球藻干重的1. 5 3%。但是，在其虾青素总组成中，虾青素单体的含量只是虾青素总重量的5 %，虾青素单酯含量为70 %，虾青素双酯含量为25 %。研究表明，在雨生红球藻中虾青素单体结构为左旋结构，而左旋虾青素单体具有非常强的抗氧化活性，这使得雨生红球藻具有强大的应用优势。冰凉花(Adonisamurensis Regelet Radde)为毛莨科、侧金盏花属的多年生草本植物，又名福寿草、侧金盏花，具有强心、利尿、镇静及减慢心率的功能，全草皆可入药。经研究表明，冰凉花中具有较高含量的虾青素，并且以虾青素双酯为主。Sl^ (Physalis alkekengi L. var. franchetii (Masters)Makino)(Solanaceae)酸浆属(Physalis)多年生草本植物，又名“红姑娘”等。酸浆的宿萼和果实组织中含有丰富的β-隐黄质及α-隐黄质，同时还含有叶黄素及玉米黄质，它们都以脂肪酸酯形式存在，其含量是酸浆干重的0. 以上。枸杞(Lycium chinense)是茄科枸杞属的多分枝灌木植物的果实，西北地区的重要经济作物。中医认为其具有滋肝补肾、益精明目等作用，是中国的名贵传统中药。研究表明，枸杞子中含有丰富的类胡萝卜素，除含少量的胡萝卜素、玉米黄素外，97%以上的类胡萝卜素以脂肪酸酯形式存在，例如玉米黄素双棕榈酸酯，它的含量是以枸杞类胡萝卜素总重量计77. 5%以上。万寿菊(Marigold)为菊科万寿菊属的一年生草本植物，又名万寿灯、金盏花、臭芙蓉，万寿菊中含有丰富的类胡萝卜素，其中以叶黄素和玉米黄质含量最为丰富，是提取纯天然叶黄素和玉米黄质的理想原料，其提取物广泛应用于食品添加剂领域和饲料添加剂领域。万寿菊提取物中的叶黄素与玉米黄质也多以酯的形式存在。由此可见，在这些原料中，类胡萝卜素主要以其单酯或双酯的形式存在，而类胡萝卜素单体含量很低。目前一些研究工作表明，类胡萝卜素单体的亲水性及生理活性比类胡
萝卜素单酯或双酯强得多，因此，如果将类胡萝卜素单酯或双酯转化成类胡萝卜素单体，其天然类胡萝卜素酯浓缩物的应用效果必将会有非常大的提升。
本发明使用的天然类胡萝卜素酯浓缩物是根据CN1205690、CN1662658、CN201110155266X所描述的方法制备的，或者是从目前市场上购买的符合本发明要求的产品，例如昆明白鸥微藻技术有限公司以商品名虾青素油、长沙蓝威生物制品有限公司以商品名玉米黄质、长沙旭禾生物科技有限公司以商品名万寿菊提取物、晨光生物科技集团股份有限公司以商品名食品级叶黄素、大连医诺生物有限公司以商品名叶黄素酯油悬液销售的产
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ΡΠ O根据本发明，由于类胡萝卜素酯浓缩物是一种脂溶性的浓缩膏，需要使用表面活性剂处理以改变浓缩膏的溶解性，从而增加界面反应的比表面积。根据本发明，表面活性剂应该理解是一种具有一定亲水与亲油基团并能使表面张力显著降低的物质。表面活性剂分子一般都有亲水基团和疏水基团。当表面活性剂与类胡萝卜素酯浓缩物接触时，表面活性剂的疏水基团与类胡萝卜素酯的疏水基团结合能够形成一种稳定的缔合物。如果逐渐向这种体系中加水，则表面活性剂的亲水基团就会与水分子结合，于是慢慢形成一种油包水的均勻体系，当加入的水量达到一定量时，这种体系就会转变成一种以水包油状态存在的均勻乳液，这样就形成具有一定水溶性的均勻混悬液。根据本发明，所述的表面活性剂是一种或多种选自磷脂、吐温80、吐温60、吐温20、蔗糖酯、聚甘油酯的表面活性剂。磷脂是含有磷酸的脂类，属于复合脂，是生物膜的主要成分。磷脂为两性分子，一端为亲水的含氮或磷的尾，另一端为疏水(亲油)的长羟基链，是一种非常优良的两性表面活性剂。吐温，也叫吐温型乳化剂，是司盘(山梨醇脂肪酸酯)和环氧乙烷的缩合物，非离子型乳化剂，由于司盘是山梨醇与不同高级脂肪酸所形成的酯，故吐温实际上是同类型的系列产品，分为吐温20、吐温40、吐温60和吐温80等，在使用时根据不同的需求选择不同的产品。蔗糖酯是由蔗糖与食用脂肪酸形成的酯类，是一种以蔗糖羟基为亲水基，脂肪酸碳链部分为亲油基的乳化剂。由于蔗糖有8个羟基，故可接1 8个脂肪酸，所述的脂肪酸可以是硬脂酸、棕榈酸、油酸等高级脂肪酸，也可以是醋酸、异丁酸等低级脂肪酸，因此，蔗糖酯是一系列的产品。蔗糖酯在人体内可分解成蔗糖和脂肪酸而被利用，且安全性高，对皮肤和粘膜无刺激性，故广泛应用于医药，食品和日用化学品中。聚甘油脂肪酸酯简称聚甘油酯，系由聚甘油与脂肪酸形成的酯，是一类新型、高效、性能优良的非离子型表面活性剂，它可作为食品添加剂的乳化剂、稳定剂、结构改良剂等，由于其高度安全性，早已被联合国粮农组织和世界卫生组织等批准用作食品添加剂等。具体地，本技术领域的技术人员可以根据这些表面活性剂的特点采用常规方法与试验进行选择，这对于本技术领域的技术人员而言是不存在任何困难的。往所述的反应底物中添加Tris-HCl缓冲液和磷酸缓冲液。所述的Tris-HCl缓冲液是用Tris (三羟甲基氨基甲烷)与HCl制备得到的缓冲液；所述的磷酸缓冲液是用磷酸二氢钠水合物与磷酸氢二钠水合物制备得到的缓冲液，它们都是本技术领域的技术人员熟知的缓冲液。当所述的反应底物转变成一种水包油相，形成具有一定水溶性的均勻混悬液时，就往其中添加酶液。
根据本发明，所述的酶为微生物来源的脂肪酶或酯酶。根据本发明，所述的脂肪酶是碱性脂肪酶或中性脂肪酶。所述的脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类进行水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，脂肪酶广泛存在于动植物或微生物中，由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，因此，具有比动植物更广的作用PH、作用温度范围以及底物专一性，且来源于微生物的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，本发明使用的脂肪酶是微生物来源的脂肪酶，例如是解脂亚罗酵母突发酵法生产的脂肪酶。根据本发明，所述的酯酶是能够水解低级脂肪酸酯的脂肪酶。目前，人们知道约2%微生物能够产脂肪酶，这些微生物至少包括65个属的微生物，其中细菌观个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其他真菌23个属，来自不同微生物的脂肪酶在其组成成分与理化性质方面是不相同。根据本发明，所述的脂肪酶是来自细菌或真菌的脂肪酶，例如来自细菌无色杆菌(Achromobacter)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、节细菌属(Arthrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、伯克霍尔德菌(Burkholderia)、色杆菌(Chromobacterium)和假单胞菌属(I^eudomonas)的脂肪酶，以及来自真菌黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Thermomyces Lanuginosus)、高温毛壳酶(Humicola lanuginosa)、米赫毛酶(Mucormiehei)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、德氏根酶(Rhizopus delemar) > 日本根酶(Rhizopus japomcus)、雪白根酶(Rhizopus mveus)、米根酶(Rhizopus oryzae)、裙鮍假丝酵母(Candida rugosa)、南极假丝酵母(Candida antarctica)、和柱状假丝酵母(Candidacylindracea)的脂肪酶。使用这些微生物获得的脂肪酶或酯酶可以是用这些微生物进行发酵后去除菌体所得到的具有一定酶活力的发酵液，也可以是发酵液经精制后得到的酶粉。在本发明中，所述微生物发酵方法与发酵液精制方法都是现有技术文献中报道的方法，是本技术领域的技术人员熟知的常规方法，例如在本发明中，使用的脂肪酶是领先生物农业股份有限公司的发明专利CN101440350B中记载的以解脂亚罗酵母突变株(Yarrowia lipolytica LWl，其保藏编号为CGMCC No. 2707)发酵法生产的脂肪酶；其它实例如上海化工研究院的发明专利CN14M993中记载的以褶皱假丝酵母发酵法生产的脂肪酶、深圳绿微康生物工程有限公司的发明专利CN1730653中记载的一种以黑曲霉发酵法生产的脂肪酶、中国水产科学研究院黄海水产研究所的发明专利CN1614014中记载的分离得到的低温碱性脂肪酶及日本奥利友集团株式会社的发明专利CN1806043中记载的方法得到的脂肪酶粉末。根据本发明，所述的脂肪酶或酯酶的酶活> 200IU/g，如果脂肪酶或酯酶的酶活低于200IU/g，则会因为酶活力不高，需要通过增加酶的用量或延长反应时间来使酶解反应进行到底，因此，所述酶的酶活应高于200IU/g。鉴于发酵水平及市场上所售产品的实际情况，所述脂肪酶的酶活是200 20000IU/g，优选地是500 15000IU/g，更优选地是1000 10000IU/g。其中，酶活定义为1克酶粉或ImL酶液于40°C与pH4. 6的条件下，在Ih分解可溶性淀粉产生Img葡萄糖的酶量为1个酶活单位。在添加所述的脂肪酶或酯酶后需要在温度18 55°C下进行酶解反应30min 120h。由于酶与底物的反应都有一个最适的反应温度，因此，酶解反应时有一定的温度范围，本发明中，反应温度是18 55°C。如果该酶解反应在温度18°C以下进行时，则会由于反应温度太低而造成酶的活力降低；如果该酶解反应在温度以上进行时，则会由于温度太高而引起酶的失活。因此，酶解反应温度18 55°C是合适的，优选地是M 48°C，更优选地是30 40°C。该酶解反应的时间30min 120h是合适的，优选地是4 100h，更优选地是18 80h。在酶解反应后再用水溶性有机溶剂进行破乳，得到的破乳酶解反应液接着用极性有机溶剂进行萃取，两相分离后萃余液弃去，而萃取液进行真空浓缩，于是得到一种含类胡萝卜素单体的浓缩物。根据本发明，破乳是一种将乳状液的分散相小液珠聚集成团，形成大液滴，最终使油水两相分层析出的过程。本发明使用水溶性有机溶剂破乳是因为水溶性有机溶剂的亲水性能够在油水界面上发生强的吸附，从而使乳化液达到油水分离析出。所述的水溶性有机溶剂选自乙醇、甲醇、丙酮、乙二醇或二甲基亚砜。优选地，所述的水溶性有机溶剂选自乙醇、甲醇、丙酮或二甲基亚砜。更优选地，所述的水溶性有机溶剂选自乙醇、甲醇或丙酮。所述水溶性有机溶剂的使用量是能够使所述水包油乳液变成油、水分离两相的最低水溶性有机溶剂量。本发明使用的水溶性有机溶剂都是目前市场上销售的产品，是化工技术领域里通常使用的产品，例如天津市科密欧化学试剂有限公司销售的产品。根据本发明，除了使用水溶性有机溶剂进行破乳以外，还可以采用其他的物理方法进行破乳，如采用电沉降法、过滤法、超声法等方法进行破乳。用水溶性有机溶剂破乳得到的破乳酶解反应液再用极性有机溶剂进行萃取。所述的极性有机溶剂选自乙醇、丙醇、丁醇、四氢呋喃、丙酮，氯乙烷或三氯甲烷。优选地，所述的极性有机溶剂选自乙醇、丙醇、丁醇、四氢呋喃或三氯甲烷。更优选地，所述的极性有机溶剂选自乙醇、丙醇、丁醇或四氢呋喃。本发明使用的极性有机溶剂都是目前市场上销售的产品，是化工技术领域里通常使用的产品，例如天津市科密欧化学试剂有限公司销售的产品。在萃取时，所述的破乳酶解反应液用极性有机溶剂萃取是在下述条件下进行的所述的破乳酶解反应液与极性有机溶剂的体积比1 1 5、萃取温度室温、萃取次数1 4次。萃取完成后，萃余液弃去，合并萃取液进行真空浓缩，于是得到一种含类胡萝卜素单体的浓缩物。所述的真空浓缩是使用上海振捷实验设备有限公司生产的RE-5210A型旋转蒸发仪在压力-0. 06 -0. 09MPa与温度20 40°C的条件下进行。这种含类胡萝卜素单体的浓缩物是采用HPLC法在常规条件下进行定性分析的。这种含类胡萝卜素单体的浓缩物的类胡萝卜素单体含量是采用紫外可见分光光度法在常规条件下测定的。
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根据本发明，所述的含类胡萝卜素单体的浓缩物含有以该浓缩物总重量计0. 1 15.0%的类胡萝卜素单体。本发明还涉及所述浓缩物在制备食品添加剂、功能性食品、药品、饲料添加剂和化妆品中的用途。根据本发明，食品添加剂应该理解是用于改善食品品质、延长食品保存期、便于食品加工和增加食品营养成分的化学合成或天然物质。本发明的含类胡萝卜素单体的浓缩物可以作为食品添加剂应用于例如乳制品、甜点、饮料、米面制品或其他杂粮食品中。当应用于这些食品时，所述含类胡萝卜素单体的浓缩物的添加量是以该食品总重量计0. 05 5%。添加本发明含类胡萝卜素单体的浓缩物的食品强化了食品中的类胡萝卜素营养成分，满足人体对类胡萝卜素的需求，且具有色泽鲜艳、口感柔和、保存期限更长的优点。根据本发明，功能性食品应该理解是具有营养功能、感觉功能和调节生理活动功能的食品。它包括增强人体体质、增强免疫能力、激活淋巴系统等的食品；防止高血压、糖尿病、冠心病、便秘和肿瘤等的食品；恢复健康、控制胆固醇、防止血小板凝集、调节造血功能等的食品；调节神经中枢、神经末稍、摄取与吸收功能等的食品和延缓衰老的食品。本发明的含类胡萝卜素单体的浓缩物可以应用于例如具有抗氧化、增强免疫力、延缓衰老、缓解视疲劳、缓解体力疲劳的功能性食品中。当应用于这些功能性食品时，所述含类胡萝卜素单体的浓缩物的添加量是以该功能性食品总重量计0. 5 30%。添加本发明含类胡萝卜素单体的浓缩物的功能性食品具有吸收与利用率高、产品性质更加稳定的优点。根据本发明，本发明的含类胡萝卜素单体的浓缩物可以应用于例如治疗及预防心脑血管疾病、治疗眼睛疾病和保持眼睛功能、治疗消化不良、防治肿瘤及癌症、治疗免疫性疾病或减轻发热产生的肿泡和溃疡疼痛的免疫调节及预防性药品中。当应用于这些药品时，所述含类胡萝卜素单体的浓缩物的添加量是以该药品总重量计0. 5 50%。添加本发明含类胡萝卜素单体的浓缩物的药品具有见效快、无毒副作用、对身体无损伤、不会引起成瘾的优点。根据本发明，饲料添加剂应该理解是为了强化基础饲料营养价值、提高动物生产性能、保证动物健康、节省饲料成本、改善畜产品品质而在饲料生产加工、使用过程中添加的少量或微量物质。本发明的含类胡萝卜素单体的浓缩物可以作为饲料添加剂应用于例如鲍鱼、鲟鱼、鲑鱼、虹鳟鱼、真鲷、甲壳类动物及观赏鱼类和各种禽类、生猪的饲料中，当应用于这些饲料时，所述含类胡萝卜素单体的浓缩物的添加量是以该饲料总重量计0.01 0. 1%。。食用添加本发明含类胡萝卜素单体的浓缩物饲料的动物，繁殖能力明显提高，健康状况得到改善，观赏鱼类的皮肤和禽类的毛发色泽更加鲜艳，能够显著增加商品的营养价值。根据本发明，化妆品应该理解为以涂抹、喷洒或者其他类似方式，散布于人体表面的任何部位，如皮肤、毛发、指趾甲、唇齿等，以达到清洁、保养、美容、修饰和改变外观，或者修正人体气味，保持良好状态为目的的化学工业品或精细化工产品。本发明的含类胡萝卜素单体的浓缩物可以作为添加剂应用于保湿霜、抗皱眼霜、面膜、防晒霜、口红、美白乳液等化妆品中。当应用于这些化妆品时，所述含类胡萝卜素单体的浓缩物的添加量是以该化妆品总重量计0. 01 1%。使用添加本发明含类胡萝卜素单体的浓缩物的化妆品，能够有效改善皮肤的新陈代谢，延缓衰老，使皮肤更加富有弹性与光泽，有效阻挡紫外线对皮肤的损伤，且对皮肤无任何刺激及副作用。[有益效果]本发明的有益效果是现有研究表明，类胡萝卜素单体具有比类胡萝卜素酯更强的抗氧化性及生理活性，化学合成法虽然能够得到类胡萝卜素单体，但是由于在化学合成过程中不可避免地引入化学杂质及其他副产物，且合成单体多为右旋产品，生物利用率和安全性无法得到保证。因此，人们更期待于从自然存在的类胡萝卜素中获得活性更高、更安全的天然产品。但是由于类胡萝卜素分子结构中不饱和双键的存在，自然界中的天然类胡萝卜素多以类胡萝卜素酯的形式存在。本发明以天然类胡萝卜素酯为原料，采用酶解法获得含有天然类胡萝卜素单体的浓缩物，单体含量达到以该浓缩物总重量计0. 1 15.0%，产品回收率高，活性稳定，且无其他副产物出现，具有非常广泛的实际应用前景。

图1是类胡萝卜素的扫描光谱图；其中，图1-1为虾青素及其酯扫描光谱，图1-2为隐黄质、玉米黄质、叶黄素的扫描光谱图2是雨生红球藻浓缩物的HPLC色谱图，其中2号峰为虾青素单体峰，4 9号峰为虾青素酯峰；图3是雨生红球藻浓缩物在酶解后的HPLC色谱图，其中2号峰为虾青素单体峰；图4是酸浆宿萼浓缩物的HPLC色谱图，其中2 18号峰为类胡萝卜素酯峰；图5是酸浆宿萼浓缩物在酶解后的HPLC色谱图，其中1号峰为β -隐黄质峰，2号峰为玉米黄质峰；图6是枸杞提取物的HPLC色谱图，其中1号峰为玉米黄质单体，2号峰为玉米黄质图7是枸杞提取物在酶解后的HPLC色谱图，其中1号峰为玉米黄质单体图8是万寿菊提取物的HPLC色谱图，其中4号峰为玉米黄质峰，5号峰为叶黄素峰，6 21号峰为类胡萝卜素酯峰图9是万寿菊提取物在酶解后的HPLC色谱图，其中3号峰为玉米黄质峰，4号峰为叶黄素峰，5 10号峰为未酶解完全的类胡萝卜素酯峰
具体实施方式通过下述实施例将更好地理解本发明。实施例1 使用雨生红球藻粉制备类胡萝卜素浓缩物制备步骤如下称取200g干燥的雨生红球藻粉，加入到IOL由上海振捷实验设备有限公司生产的RE-5210A型旋转蒸发仪中，然后用1. 6L乙酸乙酯在温度30°C条件下回流提取90min，分离提取液，再每次用1. 2L乙酸乙酯重复提取4次，合并提取液。将该提取液在上海振捷实验设备有限公司生产的RE-5210A型旋转蒸发仪中，在-0. 09MPa与温度30°C下进行真空浓缩至干，得到55g暗红色浓缩物，该暗红色浓缩物的HPLC色谱图列于附图2，其HPLC色谱图中2号峰为虾青素单体峰，4 9号峰为虾青素酯峰。使用紫外可见分光光度计按照常规方法检测，得到在该浓缩物中的总类胡萝卜素含量以重量计6. 4%。实施例2 使用酸浆宿萼提取物制备类胡萝卜素浓缩物将酸浆宿萼在上海博迅实业有限公司医疗器械厂生产的GZX-9146MBE型数显鼓风干燥箱中干燥至含水量以原料重量计< 10%，称取Ikg干燥宿萼，用江阴市新友机械制造有限公司生产的食品粉碎机粉碎成60目粉末，称取500g干燥宿萼粉末，加入到IOL由上海振捷实验设备有限公司生产的RE-5210A型旋转蒸发仪中，用4L正己烷在温度35°C条件下回流提取60min，分离提取液，再每次使用2L正己烷重复提取3次，合并提取液。将该提取液在上海振捷实验设备有限公司生产的RE-5210A型旋转蒸发仪中，在-0. 09MPa与温度35°C下进行真空浓缩至干，得到23g橘红色浓缩物，该橘红色浓缩物的HPLC色谱图列于附图4，其HPLC色谱图中2 18号峰为类胡萝卜素酯峰。使用紫外可见分光光度计按照常规方法检测，得到在该浓缩物中的总类胡萝卜素含量以重量计8.9%。实施例3 使用枸杞提取物制备类胡萝卜素浓缩物将新鲜的枸杞果粉碎，用6层纱布过滤去除果汁，然后再采用悬浮法将果皮与种子分开，收集果皮，接着在上海博迅实业有限公司医疗器械厂生产的GZX-9146MBE型数显鼓风干燥箱中干燥至含水量以原料重量计< 10%，称取200g干燥果皮，加入到IOL由上海振捷实验设备有限公司生产的RE-5210A型旋转蒸发仪中，用4L四氢呋喃在温度40°C条件下回流提取30min，分离提取液，再每次使用4L四氢呋喃重复提取2次，合并提取液。将该提取液在上海振捷实验设备有限公司生产的RE-5210A型旋转蒸发仪中，在-0. OSMPa与温度40°C下进行真空浓缩至干，得到32g橘红色浓缩物，该枸杞浓缩物的HPLC色谱图列于附图6，其中1号峰为玉米黄质单体，2号峰为玉米黄质酯。使用紫外可见分光光度计按照常规方法检测，得到在该浓缩物中的总类胡萝卜素含量以重量计5. 2%。实施例4 制备含虾青素单体的浓缩物称取IOg实施例1制备的总类胡萝卜素含量以重量计6. 4%的雨生红球藻暗红色浓缩物置于研钵中，另外称取20g吐温80放入该研钵中，研磨混勻，在研磨过程中逐滴加入Tris-HCl缓冲液，当该浓缩物与Tris-HCl缓冲液混合物转换成均一的乳液时，停止加入该缓冲液。脂肪酶酶液的制备根据在发明专利CN 101440350A说明书中描述的方法制备的发酵液在IOOOOrpm与温度4°C的条件下离心15min，得到的上清液即为反应酶液，采用橄榄油乳化液法测定，该酶液的酶活是3045U/mL。将IOOmL这种酶液与上述乳液混合均勻，再转移至三角烧瓶中，在由上海艾测电子科技有限公司生产的A1830309型水浴摇床中，在温度18°C与转速150rpm的条件下进行酶解反应120h。酶解反应结束后，往这种反应液中加入30mL以体积计95 %乙醇，接着在上海精科实业有限公司生产的漩涡振荡器中在室温下振荡15min进行破乳，得到的破乳酶解反应液用IOOmL乙酸乙酯振荡萃取15min，然后每次用IOOmL乙酸乙酯反复萃取2次，乙酸乙酯相已无色，两相分离后萃余液弃去，收集萃取液，在由上海振捷实验设备有限公司生产的RE-5210A型旋转蒸发仪中，在-0. OSMPa与温度30°C下进行真空浓缩，得到一种暗红色浓缩物，该暗红色浓缩物的HPLC色谱图列于附图3，其中2号峰为虾青素单体峰。与实施例1的附图2相比，附图3的2号峰强度高得多，并且附图2的4 9号虾青素酯峰已消失，这些数据表明，雨生红球藻暗红色浓缩物中的虾青素酯已转化成虾青素单体。采用分光光度法在470nm下检测，该暗红色浓缩物的虾青素单体含量是以暗红色浓缩物总重量计3. 7%。实施例5 制备含β -隐黄质单体及玉米黄质单体的浓缩物称取2g实施例2制备的总类胡萝卜素含量以重量计为8. 9 %的酸浆宿萼橘红色浓缩物置于研钵中，另外称取0. 2g蔗糖酯放入该研钵中，研磨混勻，在研磨过程中逐滴加入磷酸缓冲液，当该浓缩物与磷酸盐缓冲液转换成均一的乳液时，停止加入该缓冲液。IOmL实施例4制备的酶液与上述乳液混合均勻，再转移至三角烧瓶中，在由上海艾测电子科技有限公司生产的A1830309型水浴摇床中，在温度55°C与转速300rpm的条件下进行酶解反应30min。酶解反应结束后，往这种反应液中加入4mL丙酮，接着在上海精科实业有限公司生产的漩涡振荡器中在室温下振荡15min进行破乳，得到的破乳酶解反应液用IOmL正己烷振荡萃取15min，然后每次用IOmL正己烷反复萃取3次，正己烷相已无色，两相分离后萃余液弃去，收集萃取液，在由上海振捷实验设备有限公司生产的RE-5210A型旋转蒸发仪中，在-0. 09MPa与温度35°C下进行真空浓缩，得到一种橘红色浓缩物。采用HPLC法在常规条件下进行了分析，其HPLC色谱图列于附图5中，在这种橘红色浓缩物中含有两种单体成分，即1号峰β -隐黄质峰，2号峰玉米黄质峰。与实施例2的附图4相比，附图5出现了 1号峰，2号峰的强度高得多，并且附图4的2 18号类胡萝卜素酯峰已消失，这些数据表明，酸浆宿萼橘红色浓缩物中的类胡萝卜素酯已转化成隐黄质和玉米黄质。采用分光光度法在450nm下检测，该橘红色浓缩物的β _隐黄质单体和玉米黄质单体含量是以橘红色浓缩物总重量计4.3%。实施例6 制备含玉米黄质单体的浓缩物称取5g实施例3制备的总类胡萝卜素含量以重量计为5. 2%的枸杞橘红色浓缩物置于研钵中，另外称取5g磷脂放入该研钵中，研磨混勻，在研磨过程中逐滴加入Tris-HCl缓冲液，该浓缩物与Tris-HCl缓冲液转换成均一的乳液时，停止加入该缓冲液。50mL实施例4制备的酶液与上述乳液混合均勻，再转移至三角烧瓶中，在由上海艾测电子科技有限公司生产的A1830309型水浴摇床中，在温度30°C与转速200rpm的条件下进行酶解反应48h。酶解反应结束后，往这种反应液中加入20mL甲醇，接着在上海精科实业有限公司生产的漩涡振荡器中在室温下振荡15min进行破乳，得到的破乳酶解反应液用50mL四氢呋喃振荡萃取15min，然后每次用50mL四氢呋喃反复萃取4次，四氢呋喃相已无色，两相分离后萃余液弃去，收集萃取液，在由上海振捷实验设备有限公司生产的RE-5210A型旋转蒸发仪中，在-0. OSMPa与温度30°C下进行真空浓缩，得到一种橘红色浓缩物。采用HPLC法在常规条件下进行了分析，其HPLC色谱图列于附图7中，其中1号峰为玉米黄质单体峰。与实施例3的附图5相比，附图7中1号峰明显加强，而2号峰完全消失，这些数据表明，枸杞橘红色浓缩物中的玉米黄质酯已全部转化成玉米黄质单体。采用分光光度法在450nm下检测，该橘红色浓缩物的玉米黄质单体含量是以橘红色浓缩物总重量计2. 9%。实施例7 制备含叶黄素单体的浓缩物称取20g由长沙旭禾生物科技有限公司以商品名万寿菊提取物销售的总类胡萝卜素含量为20%的万寿菊提取物于研钵中，另外称取IOg聚甘油酯放入该研钵中，研磨混
勻，在研磨过程中逐滴加入磷酸缓冲液，当该浓缩物与磷酸盐缓冲液转换成均一的乳液时，停止加入该缓冲液。200mL实施例4制备的酶液与上述乳液混合均勻，再转移至三角烧瓶中，在由上海艾测电子科技有限公司生产的A1830309型水浴摇床中，在温度35°C与转速250rpm的条件下进行酶解反应72h。酶解反应结束后，往这种反应液中加入20mL丙酮，接着在上海精科实业有限公司生产的漩涡振荡器中在室温下振荡IOmin进行破乳，得到的破乳酶解反应液用200mL正己烷振荡萃取lOmin，然后每次用200mL正己烷反复萃取3次，正己烷相已无色，两相分离后萃余液弃去，收集萃取液，在由上海振捷实验设备有限公司生产的RE-5210A型旋转蒸发仪中，在-0. 09MPa与温度35°C下进行真空浓缩，得到一种橘红色浓缩物。采用HPLC法在常规条件下进行了分析，其HPLC色谱图列于附图9中，在这种橘红色浓缩物中含有两种单体成分，即3号峰玉米黄质峰，4号峰叶黄素峰。与其未酶解的附图8相比，附图9中的玉米黄质及叶黄素峰强度均明显增强，且玉米黄质酯及叶黄素酯峰均基本消失，这些数据表明，万寿菊提取物中的类胡萝卜素酯已转化成玉米黄质和叶黄素单体。采用分光光度法在450nm下检测，该橘红色浓缩物的玉米黄质和叶黄素单体含量是以橘红色浓缩物总重量计10. 9%。实施例8 制备含虾音素单体的浓缩物称取8g实施例1制备的总类胡萝卜素含量以重量计6. 4%的雨生红球藻暗红色浓缩物置于研钵中，另外称取2g蔗糖酯与2g磷脂放入该研钵中，研磨混勻，在研磨过程中逐滴加入磷酸缓冲液，当该浓缩物与其磷酸缓冲液转换成均一的乳液时，停止加入该缓冲液。SOmL实施例4制备的酶液与上述乳液混合均勻，再转移至三角烧瓶中，在由上海艾测电子科技有限公司生产的A1830309型水浴摇床中，在温度25°C与转速200rpm的条件下进行酶解反应96h。酶解反应结束后，往这种反应液中加入25mL丙酮，接着在上海精科实业有限公司生产的漩涡振荡器中在室温下振荡15min进行破乳，得到的破乳酶解反应液用SOmL正己烷振荡萃取15min，然后每次用SOmL正己烷反复萃取2次，正己烷相已无色，两相分离后萃余液弃去，收集萃取液，在由上海振捷实验设备有限公司生产的RE-5210A型旋转蒸发仪中，在-0. OSMPa与温度30°C下进行真空浓缩，得到一种暗红色浓缩物，采用分光光度法在470nm条件下检测，该暗红色浓缩物的虾青素单体含量是以暗红色浓缩物总重量计4. 2%。实施例9 制备含β -隐黄质酯及玉米黄质单体的浓缩物称取15g实施例2制备的总类胡萝卜素含量以重量计8. 9%的酸浆宿萼浓缩物置于研钵中，称取5g吐温80与5g磷脂放入该研钵中，研磨混勻，在研磨过程中逐滴加入Tris-HCl缓冲液，当该浓缩物与Tris-HCl缓冲液转换成均一的乳液时，停止加入该缓冲液。150mL实施例4制备的酶液与上述乳液混合均勻，再转移至三角烧瓶中，在由上海艾测电子科技有限公司生产的A1830309型水浴摇床中，在温度40°C与转速150rpm的条件下进行酶解反应Mh。 酶解反应结束后，往这种反应液中加入50mL以体积计95%乙醇，接着在上海精科实业有限公司生产的漩涡振荡器中在室温下振荡15min进行破乳，得到的破乳酶解反应液用150mL四氢呋喃振荡萃取15min，然后每次用150mL四氢呋喃反复萃取3次，四氢呋喃相已澄清透明，两相分离后萃余液弃去，收集萃取液，在由上海振捷实验设备有限公司生产的RE-5210A型旋转蒸发仪中，在-0. 09MPa与温度35°C下进行真空浓缩，得到一种橘红色浓缩物，采用HPLC法在常规条件下分析确定，在这种橘红色浓缩物中含有两种单体成分，即β -隐黄质单体及玉米黄质单体。采用分光光度法在450nm条件下检测，该橘红色浓缩物的β -隐黄质单体和玉米黄质单体含量是以橘红色浓缩物总重量计4. 9%。
权利要求
1.一种含类胡萝卜素单体的浓缩物的制备方法，其特征在于该制备方法步骤如下将1 10重量份天然类胡萝卜素酯浓缩物与0. 1 20重量份表面活性剂充分混合得到一种反应底物，然后，逐渐向所述的反应底物中加入Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液，使该反应底物转换为水包油乳液状，接着往所述乳液中加入10 100重量份脂肪酶或酯酶酶液，在温度18 55°C下进行酶解反应30min 120h ；酶解反应后再用水溶性有机溶剂进行破乳，得到的破乳酶解反应液接着用极性有机溶剂进行萃取，两相分离后萃余液弃去，而萃取液进行真空浓缩，于是得到一种含类胡萝卜素单体的浓缩物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的天然类胡萝卜素酯是一种或多种选自来源于雨生红球藻的虾青素单酯及双酯，来源于冰凉花的虾青素双酯，来源于酸浆果实的隐黄质与α-隐黄质，来源于枸杞、酸浆果实、万寿菊或玉米的玉米黄质酯与叶黄素酯或其它来源的类胡萝卜素酯的天然类胡萝卜素酯浓缩物；在天然类胡萝卜素酯浓缩物中，天然类胡萝卜素酯的含量是以所述浓缩物总重量计0. 05 30%。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的表面活性剂是一种或多种选自磷脂、吐温80、吐温60、吐温20、蔗糖酯或聚甘油酯的表面活性剂。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的脂肪酶或酯酶的酶活>200IU/g°
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的水溶性有机溶剂选自乙醇、甲醇、丙酮、乙二醇或二甲基亚砜。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的极性有机溶剂选自乙醇、丙醇、丁醇、四氢呋喃、丙酮、氯乙烷或三氯甲烷。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在用极性有机溶剂萃取时，在破乳酶解反应液与极性有机溶剂的体积比11 5与室温的条件下萃取1 4次。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于分离的萃取液在压力-0. 06 -0. 09MPa与温度20 40°C的条件下进行真空浓缩至干。
9.一种根据权利要求1-8中任一项权利要求所述制备方法得到的含类胡萝卜素单体的浓缩物，其特征在于它含有以该浓缩物总重量计0. 1 15.0%类胡萝卜素单体。
10.根据权利要求9所述的含类胡萝卜素单体的浓缩物在制备食品添加剂、功能性食品、药品、饲料添加剂和化妆品中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种含类胡萝卜素单体的浓缩物及其制备方法与它的用途。该制备方法包括含有天然类胡萝卜素酯的提取物在脂肪酶的作用下水解为类胡萝卜素单体。该方法操作简单，反应条件温和，很大程度上避免了类胡萝卜素在反应过程中的损失，且无其他副产物的生成，产品保持了天然类胡萝卜素的生理活性，为工业化生产天然类胡萝卜素单体奠定了基础。
文档编号A61K36/28GK102586377SQ20111045374
公开日2012年7月18日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者宫平, 徐志文, 惠伯棣, 王旭, 胡春凤 申请人:秦皇岛大惠生物技术有限公司