专利名称：抗原或药物递送复合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型抗原递送复合物、疫苗、药物递送复合物等。
背景技术：
近年来，针对新发性和再发性感染性疾病，开发了失活疫苗和低毒性疫苗，获得了高的预防效果。但是，日本对感染病疫苗的开发晚得多。为了扑灭发展中国家中的特定感染性疾病或者应对大流行病，需要研发能够大量生产和长期保存，并且具有更高安全性和更强效价的疫苗。其中，DNA疫苗可以廉价地大量生产，其有效性受到期待，但从安全性或效价的观点来看则尚未达到成功。此外，需要研发适用于激活全身免疫的静脉注射、皮下/皮内注射的制剂，适用于粘膜免疫的经口、吸入或滴鼻给药的制剂。
此外，针对人乳头瘤病毒的疫苗作为宫颈癌疫苗已得到认可，据报道表现出较高的效果。但是，针对癌症抗原的疫苗疗法在世界范围内尚未确立。虽然有使用多种多样的抗原或DNA的疫苗的报道，但尚未获得充分的免疫诱导效果，不能在临床上应用。特别地，DNA疫苗可选择性活化与癌症相关的细胞免疫，期待其可增强抗癌免疫。此外，虽然由于可廉价地大规模生产而令人注目，但从安全性和效价的观点来看还没有成功的例子。DNA药物根据碱基的组合变化，表现出不同的药理作用，可以廉价的大量生产，因此其作为有效的医药制品受人期待。迄今为止，已开发了各种作为基因递送载体的纳米构建体，报道了它们的器官特异性或细胞特异性。但是，由于安全性和效率低下，还不能在临床上应用。由于多数使用合成材料，尚未确定其安全性，而且医疗成本的负担也大。需要开发安全性高、具有普遍适用性的器官特异性载体。使载体具有器官趋向性有多种方法，一种方法是使用易于在目标器官中积累的特定分子，还有使用其他抗体、适体等具有特异性结合能力的分子的方法。本发明人通过前者的方法，应用药物递送复合物(专利文献I)的技术，进一步简单地加入生物可降解的脂类，成功地构建了对脾和肺具有选择性的新型靶向化系统。具体地，只需向包合有DNA的阳离子型核中加入磷脂酰丝氨酸(带负电)，就可以提高纳米颗粒的安全性，向小鼠静脉注射后，实现仅在脾脏中的选择性的基因表达。脾脏富含免疫细胞，借助向脾脏的选择性基因表达，可以开发DNA疫苗。进一步地，通过添加N-月桂酰肌氨酸(带负电)代替磷脂酰丝氨酸，同样可以提高纳米颗粒的安全性，向小鼠静脉注射后，实现仅在肺中的选择性基因表达(非专利文献I)。现有技术文献专利文献专利文献I :特开2010-059064号非专利文献非专利文献I :Journal of Controlled Release, 136，213-219 (2009)发明概述发明要解决的技术问题
本发明的技术问题是提供安全、高效价，可以大量生产、保存的抗原递送复合物、疫苗、药物递送复合物等。特别地，本发明的技术问题是提供以具有对细胞或器官的趋向性为特征的抗原或药物递送复合物。解决技术问题的手段本发明人为了解决上述技术问题进行了深入的研究，结果发现，通过将疟疾抗原DNA与阳离子型分子的复合物用Y-聚谷氨酸、硫酸软骨素、海藻酸中的任一种阴离子型分子包被而形成实质上不带电荷或者具有负的表面电荷的复合物，细胞毒性低，不会引起红细胞凝集，在各种细胞中表现出高的转染效率，进一步通过在体内全身给药，能够高效地将抗原DNA递送至脾脏。此外发现，通过多次给药可以产生对疟疾特异性的抗体，由此可以抑制疟疾感染。进一步发现，在使用编码作为癌抗原的恶性黑色素瘤表面抗原的PDNA的情况下，可以诱导 对恶性黑色素瘤特异性的细胞免疫，抑制恶性黑色素瘤的增殖和转移。此外，本发明人将失活病毒或癌抗原与阳离子型分子的复合物用Y-聚谷氨酸、硫酸软骨素、海藻酸中的任一种阴离子型分子包被，成功地制备了实质上不带电荷的、或者具有负的表面电荷的复合物。进一步发现，所获得的疫苗能够顺利地被递送到树突状细胞内，在对实验动物给药时表现出高的免疫诱导效果。此外，本发明人应用专利文献I记载的技术，成功的构建了使得细胞或器官特异性递送成为可能的新型靶向化系统。具体地说，成功的开发了具有下述特征的抗原或药物递送复合物其含有抗原或药物与阳离子型分子的复合物以及包合该复合物的阴离子型分子，并具有对细胞或器官的趋向性。此外，通过向抗原或药物与阳离子型分子的复合物添加选自磷脂酰丝氨酸、N-月桂酰肌氨酸和甘草皂苷的阴离子型分子，成功的制备了被赋予对脾、肺或肝的选择性(器官选择性)的抗原或药物递送复合物。进一步发现，使用Y-聚谷氨酸作为阴离子型分子，可以制备出具有树突状细胞趋向性的复合物。这些复合物是抗原或药物与阳离子型分子的复合物，以及阴离子型分子通过静电结合而成的，因此已确定安全性极高，且没有细胞毒性。此外，还通过向抗原或药物与阳离子型分子的复合物添加选自适体、miRNA和抗体的阴离子型分子，成功地制备了被赋予更特异的细胞或器官选择性的复合物。此外，在使用公知的成像用核素(成像探针)或诊断试剂作为抗原或药物时，也成功地将上述复合物用作将成像用核素(成像探针)或诊断试剂递送至特定细胞或器官的运输载体。换言之，本发明提供了以下内容。[I]抗原或药物递送复合物，其含有抗原或药物与阳离子型分子的复合物、以及阴离子型分子，并且具有对细胞或器官的趋向性，所述阴离子型分子包合(内包)所述抗原或药物与阳离子型分子的复合物。[2] [I]记载的复合物，所述抗原或药物是核酸、肽、蛋白质或失活的病毒。[3] [I]或[2]记载的复合物，其特征是所述阴离子型分子选自磷脂酰丝氨酸、月桂酰肌氨酸和甘草皂苷，具有对脾脏、肺或肝脏的趋向性。
[4] [3]记载的复合物，其特征是所述阴离子型分子是磷脂酰丝氨酸；抗原或药物与阳离子型分子、磷脂酰丝氨酸的配比为1:2:4-1:8:8 ;且具有对脾脏的趋向性。[5] [3]记载的复合物，其特征是所述阴离子型分子是月桂酰肌氨酸；阳离子型分子由阳离子型高分子和阳离子型脂类组成；抗原或药物与阳离子型高分子、阳离子型脂类、月桂酰肌氨酸的配比为1:2:2:1-1:2:2:4 ;且具有对肺的趋向性。[6] [3]记载的复合物，其特征是所述阴离子型分子是甘草皂苷；抗原或药物与阳离子型分子、甘草皂苷的配比为1:2:8-1:8:16;且具有对肝脏的趋向性。[7] [I]或[2]记载的复合物，其特征是所述阴离子型分子是Y-聚谷氨酸，具有对树突状细胞或脾脏的趋向性。[8] [7]记载的复合物，其特征是抗原或药物与阳离子型分子、Y-聚谷氨酸的配比为1:2:8-1:8:16 ;且具有对树突状细胞或脾脏的趋向性。 [9] [I]或[2]记载的复合物，所述阴离子型分子选自适体、miRNA和抗体。[10] [9]记载的复合物，所述抗原或药物与阳离子型分子、阴离子型分子的配比为1:2:8-1:8:16。[11] [1]-[10]的任一项记载的复合物，所述复合物由抗原或药物；和选自聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸、聚乙烯亚胺和阳离子型树形化合物(dendrimer)的阳离子型高分子；或选自DOTMA、DOTAP、DC-Chol和苯扎氯铵的阳离子型脂类组成。[12] [1]-[10]的任一项记载的复合物，所述复合物由抗原或药物；选自D0TMA、DOTAP和DC-Chol的阳离子型脂类；以及选自DOPE和胆固醇的脂类组成的脂质体或胶粒组成。[13]用于成像的、包含权利要求1-12的任一项记载的复合物的成像用核素的载体。[14] [13]记载的载体，其特征是抗原或药物是由成像用核素、阳离子型树形化合物(dendrimer)和螯合剂组成的复合物；阳离子型分子是聚乙烯亚胺；阴离子型分子是
Y-聚谷氨酸；且具有对淋巴结的趋向性。[15]前哨淋巴结的成像方法，其特征是使用由药物复合物、聚乙烯亚胺和Y-聚谷氨酸组成的复合物，其中所述药物复合物由成像用核素、阳离子型树形化合物(dendrimer)和螯合剂组成。[I’ ]抗原递送复合物，包含抗原与阳离子型分子的复合物，和将其包合在内的阴离子型分子，是实质上不带电荷或具有表面负电荷的抗原递送复合物，所述阴离子型分子选自Y-聚谷氨酸、硫酸软骨素、海藻酸及其盐。[2’ ] [Γ ]记载的复合物，所述抗原是病原体抗原或编码其的DNA。[3’ ] [2’ ]记载的复合物，所述病原体是疟原虫。[4’ ] [Γ ]记载的复合物，所述抗原是失活的病毒。[5’] [4’]记载的复合物，病毒是流感病毒、肝炎病毒、SARS病毒、人乳头瘤病毒或HIV病毒。[6’] [Γ]记载的复合物，阳离子型分子的带正电荷的官能团与阴离子型分子的带负电荷的官能团的摩尔比是3: f 1:4。[7’ ][1’ ]记载的复合物，阴离子型分子的分子量为10万以下。
[8’ ] [Γ ]记载的复合物，阴离子型分子是Y-聚谷氨酸或其盐。[9’ ][1’ ]记载的复合物，阳离子型分子是聚乙烯亚胺、苯扎氯铵、Ν-[1_(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N, N-三甲基铵或其盐。[10’ ] [8’ ]记载的复合物，使抗原递送至脾脏。[11’ ]感染性疾病的疫苗，其包含[Γ ]_[10’ ]的任一项记载的复合物。
[12’ ] [11’ ]记载的疫苗，所述感染性疾病是疟疾感染或病毒感染性疾病。[13’ ]向树突状细胞内递送抗原的方法，其特征是使[Γ ]_[10’ ]的任一项记载的复合物或[11’ ]或[12’ ]记载的疫苗与树突状细胞接触。[14’]向动物细胞内递送抗原的方法，其特征是向哺乳动物细胞给药[1’]-[10’]的任一项记载的复合物或[11’ ]或[12’ ]记载的疫苗。[15’]药物递送复合物，包含含有药物与阳离子型分子的复合物的脂质体，和将其包合在内的阴离子型分子，是实质上不带电荷或具有表面负电荷的药物递送复合物，所述阴离子型分子选自月桂酰肌氨酸和磷脂酰丝氨酸。[16’ ] [15’ ]记载的复合物，使药物递送至脾脏。[17’ ] [15’ ]记载的复合物，使药物递送至肺。[18’ ] [15’ ]记载的复合物，所述脂质体由药物、阳离子型分子和阳离子型脂类组成。[19’ ][18’ ]记载的复合物，所述阳离子型分子是聚乙烯亚胺，阳离子型脂类是N-[I-(2，3- 二油酰氧基)丙基]-N, N, N-三甲基铵。[20’ ] [Γ ]和[6’ ]_[10’ ]的任一项记载的复合物，所述抗原是癌抗原或编码癌抗原的DNA。[21’ ]包含[20’ ]记载的复合物的癌疫苗。[22’ ] [21’ ]记载的疫苗，所述癌是恶性黑色素瘤。[23’]向树突状细胞内递送抗原的方法，其特征是使[20’]记载的复合物或[21’]或[22’ ]记载的疫苗与树突状细胞接触。[24’ ]向动物细胞内递送抗原的方法，其特征是向哺乳动物细胞给药[20’ ]记载的复合物或[21’ ]或[22’ ]记载的疫苗。[25’]药物递送复合物，其特征是包含药物与阳离子型分子的复合物，和将其包合在内的抗体、适体或其盐的器官特异性药物递送复合物，所述抗体、适体或其盐与药物和阳离子型分子的复合物静电结合。[26’ ]向细胞内递送药物的方法，其特征是将[25’ ]记载的药物递送复合物递送到特定细胞。[27’ ]向动物的特定细胞内递送药物的方法，其特征是向哺乳动物给药[25’ ]记载的药物递送复合物。[28’ ] [15’ ]或[25’ ]记载的药物递送复合物，所述药物是DNA、siRNA、miRNA、反义DNA等带负电荷的核酸。发明的效果本发明的复合物不引起红细胞凝集，且细胞毒性低，细胞内摄入的效率好，可以安全有效地递送抗原或药物。
特别地，本发明的复合物的特征是具有对目标细胞、器官的高趋向性，可以作为新型药物递送系统的有效成分。
附图简介[图I]示出了实施例I中的疫苗抗体效价。[图2]示出了实施例I中的疟疾感染后的小鼠的存活率。[图3]示出 了实施例2中的疫苗抗体效价。[图4]示出了向细胞添加实施例3中的复合物后的荧光显微镜观察图像。[图5]示出了实施例4中的肿瘤重量的变化。[图6]示出了实施例4中的恶性黑色素瘤的肺转移情况。[图7]示出了实施例4中的肺转移的细胞数。[图8]示出了实施例5中的粒子大小和表面电荷。[图9]示出了实施例5中的基因表达(萤光素酶活性)。[
图10]示出了实施例5中的小鼠的萤光素酶成像图像。[图11]示出了实施例5中的多变量样条插值法和贡献指数。[图12]示出了实施例6中的基因表达(萤光素酶活性)。[图13]示出了实施例7中的粒子大小和表面电荷。[图14]示出了实施例7中的基因表达(萤光素酶活性)。[图15]示出了实施例7中的粒子大小和表面电荷。[图16]示出了实施例8中的基因表达(萤光素酶活性)。[图17]示出了树突状细胞摄入实施例9中的失活病毒。[图18]示出了实施例10中的基因表达(萤光素酶活性)。[图19]示出了实施例11中的基因抑制效率。[图20]示出了实施例12中的感染疟疾后的小鼠的存活率。[图21]A:实施例13中基于稀释小鼠血清的抗体效价变化。B :稀释倍数10_4的小鼠抗体效价。[图22]示出了实施例14中的肿瘤增殖变化。[图23]示出了实施例15中的细胞毒性。[图24]示出了实施例15中向大鼠足垫给药24小时后，复合物在生物体内的分布。[图25]示出了实施例15中向大鼠足垫给药24小时后的SPECT/CT图像。箭头(实线)表示胭淋巴结；箭头(虚线)表示腰部淋巴结。发明的实施方式本发明提供用于将抗原递送至期望的细胞或器官内的抗原或药物复合物(下文称为“本发明的抗原递送复合物”、“本发明的药物递送复合物”，或合称为“本发明的复合物”)下面分别针对本发明的抗原递送复合物和本发明的药物递送复合物进行说明。本发明的“抗原递送复合物”的特征是包含抗原与阳离子型分子的复合物及包合所述复合物的阳离子型分子，并具有对细胞或器官内的趋向性。本发明的抗原递送复合物中的“抗原”可列举例如病原体抗原(特别是病原体的表面抗原)或编码它的DNA，或失活病毒。作为病原体抗原中作为对象的“病原体”，考虑如后文所述的本发明的抗原递送复合物作为疫苗使用的情况，可列举疫苗疗法期望的各种病原体。具体而言，可列举疟原虫、流感病毒、肝炎病毒、西尼罗热病毒、HIV病毒(人免疫缺陷病毒)、乳头瘤病毒、SARS (严重急性呼吸综合征)病毒等。此类病原体抗原选自病原体的表面抗原(例如蛋白质(抗原)、肽(抗原)等)及其编码核酸(例如，DNA)抗原等。上述核酸抗原中的核酸的种类可以根据使用目的恰当地选择，没有特殊的限制，可列举质粒DNA (pDNA)、cDNA、反义DNA、siRNA、miRNA、染色体DNA、PAC, BAC等，优选质粒DNA、cDNA、反义DNA。质粒DNA等环状DNA通过适宜地限制性内切酶消化后，也可以作为线性DNA使用。
核酸的大小没有特殊的限制，在质粒DNA的情况下，是2_15kbp，优选2_10kbp，更优选4-10kbp。此外，l-5kbp的DNA也是优选的。核酸可以是天然存在的，或者也可以是合成的，如果大小在约IOObp以下，可以通过磷酸三乙酯法、磷酸二酯法等，使用常规使用的核酸自动合成仪来合成。对于大小更大的核酸，可以用通常使用的方法适宜地制备。本发明中使用的核酸没有特殊的限制，优选通过本领域技术人员常用的方法纯化。本说明书中的抗原除上述病原体的表面抗原或其编码核酸以外，还可以使用病原体(病毒)自身。在此情况下，从防止感染的观点看，使用失活病毒。就失活病毒而言，只要是通过常规方法获得的就可以使用，例如，可以使用通过福尔马林处理、紫外线照射、β-丙内酯等获得的失活病毒。此类抗原可列举优选核酸、肽、蛋白质或失活病毒，作为实例，可列举疟疾抗原基因、失活流感病毒等。作为本发明的其他实施方式，抗原可列举用癌抗原或其编码DNA获得的抗原递送复合物。从使用癌抗原作为抗原的观点出发，优选所述抗原被细胞特异性地递送。也就是说，通过特异性地将抗原递送至树突状细胞等抗原呈递细胞，可以期待高的免疫诱导效果。上述抗原可以与下文所述的本发明的药物共同形成本发明的复合物。因此，本发明的抗原递送复合物也可以是纳入了药物的抗原递送复合物。另一方面，本发明的“药物递送复合物”的特征是包含药物与阳离子型分子的复合物，以及包合所述复合物的阴离子型分子，并具有对细胞或器官的趋向性。本发明的药物递送复合物中的“药物”可以是任何物质，可列举例如核酸、肽、蛋白质、脂类、肽脂、糖、低分子化合物、其他合成的或天然的化合物等。这些化合物还可以包含各种核素(例如，天然放射性核素、人工放射性核素、正电子放射性核素等)，也可以通过核素进行放射性标记。或者也可以用各种化合物(例如，公知的荧光色素、酶等)标记。此外，所述药物可以只有一种，也可以是两种以上。在以治疗和/或预防疾病为目的通过本发明的药物递送复合物向细胞或器官内递送药物的情况下，所述药物是具有治疗和/或预防所述疾病的活性的药物，可列举例如可作为抗高血压剂、抗低血压剂、抗精神病剂、镇痛剂、抗抑郁剂、抗躁剂、抗不安剂、镇静剂、催眠剂、抗癫痫剂、阿片激动剂、哮喘治疗剂、麻醉剂、抗心律不齐剂、关节炎治疗剂、解痉剂、ACE抑制剂、解充血药、抗生素、抗心绞痛剂、利尿剂、抗帕金森氏病剂、支气管扩张剂、促分娩剂、抗利尿剂、抗高脂血症剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、止吐剂、抗感染剂、抗新生物剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗糖尿病剂、抗过敏剂、解热剂、抗肿瘤剂、抗痛风剂、抗组胺剂、止痒剂、骨调节剂、心血管剂、降胆固醇剂、抗疟剂、用于戒烟的药剂、镇咳剂、去痰剂、粘液溶解剂、鼻塞用药剂、多巴胺能剂、消化道用药剂、肌肉舒张剂、神经肌肉阻断剂、副交感神经激动剂、前列腺素、兴奋剂、食欲抑制剂、甲状腺药或抗甲状腺药、激素、抗偏头痛剂、抗肥胖齐U、抗炎剂等发挥作用的药物。在一个特别优选的实施方案中，能够导入细胞内的药物是核酸。核酸没有特殊的限制，可以是DNA、RNA、DNA和RNA的嵌合核酸、DNA/RNA的杂合体等。此外，核酸可以使用
1-3条链，优选I条链或2条链。核酸也可以是作为嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷的其他类型的核苷酸，或者是具有非核苷酸骨架的其他寡聚体(例如，市售的肽核酸(PM)等)，或者是含有特殊联接的其他寡聚体(但是，所述寡聚体含有DNA或RNA中可见的碱基对，或者具有允许碱基附着的配置的核苷酸)等。进一步，可以添加有公知的修饰，例如具有所属领域中 已知的标志物的、加帽的、甲基化的、I个以上的天然核苷酸被类似物替换的、经过了分子内核苷酸修饰的，例如具有不带电联接(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基膦酸酯、氨基甲酸酯等)的、具有带电联接或含硫联接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的、具有例如蛋白质(核酸酶、核酸酶抑制剂、毒素、抗体、信号肽等)或糖(例如单糖等)等侧链基团的、具有插层化合物(例如，吖啶、补骨脂素等)的、含有螯合化合物(例如，金属、具有放射性的金属、硼、氧化性的金属等)的、含有烷化剂的、具有经修饰的联接(例如，α异头物型核酸等)的。例如，DNA的类型可以根据使用目的恰当地选择，没有特殊的限制，可列举例如质粒DNA、cDNA、反义DNA、染色体DNA、PAC、BAC等，优选是质粒DNA、cDNA、反义DNA。质粒DNA等环状DNA也可以通过适宜地限制性内切酶消化后，作为线性DNA使用。此外，RNA的类型可以根据使用目的恰当地选择，没有特殊的限制，可列举例如siRNA、miRNA、shRNA、反义RNA、信使RNA、单链RNA基因组、双链RNA基因组、RNA复制子、转运 RNA、核糖体 RNA 等，优选 siRNA、miRNA、shRNA、mRNA、反义 RNA、RNA 复制子。核酸的大小没有特殊的限制，从染色体(人工染色体等)等大型核酸分子(例如大小约107kbp)至低分子核酸(例如大小约5bp)都可以导入，但考虑到向细胞内导入核酸的效率，优选15kbp以下。例如，质粒DNA这样的高分子核酸的大小可示例为2-15kbp，优选
2-10kbp,更优选4-10kbp。此外，siRNA这样的较低分子的核酸的大小可列举5_1000bp,优选 10-500bp，更优选 15-200bp。核酸可以是天然存在的或者合成的，如果大小在约IOObp以下，可以通过磷酸三乙酯法、磷酸二酯法等，使用常规使用的核酸自动合成仪来合成。本发明中使用的核酸没有特殊的限制，优选是通过本领域技术人员常用的方法纯化了的。上述药物也可以与本发明的抗原一起形成本发明的复合物。因此，本发明的药物递送复合物也可以是纳入了抗原的药物递送复合物。在以细胞或器官的诊断或成像为目的通过本发明的药物递送复合物向细胞或器官内递送药物的情况下，，所述药物可以是接受了适合诊断装置或成像装置的修饰(例如，核素、通过核素标记(放射标记)的化合物、荧光色素、用荧光色素标记的化合物等)的化合物(下文有时将其统一简写为“成像用核素”)。此类药物可列举例如用于正电子体层扫描(PET)的放射性核素(nC、13N、150、18F等)或用所述核素标记的化合物、用于单光子发射计算机体层扫描(SPECT)的放射性核素(67GA、99nTC、mIn、123I等)或用所述核素标记的化合物、用于MRI (核磁共振成像)的造影剂(Gd3+等)或用所述造影剂标记的化合物、色素(异舒泛蓝(4 y 7 寸> O—)、舒泛蓝、亚甲基蓝、吲哚氰绿、靛胭脂等)或用所述色素标记的化合物、荧光色素或用所述荧光色素标记的化合物(形成荧光络合物的镧系元素等)、以及其他作为分子探针或示踪物使用的化合物。本领域技术人员可以用本身已知的方法制备这些化合物。或者这些成像用核素可以通过共价键或配位键与后述各种阳离子型分子或阴离子型分子(优选阳离子型分子)结合。此类结合方法是本领域技术人员公知的。作为上述药物封入本发明的药物递送复合物中的化合物没有特殊的限制，可使用 本身公知的核素、色素、荧光色素、分子探针、诊断药物等。换言之，本发明的药物递送复合物可以作为用于递送上述成像用核素的载体使用。所述复合物基于本发明的药物递送复合物所具有的趋向性而去往特定的细胞或器官，因此通过使用本发明的药物递送复合物作为递送成像用核素的载体，与只使用成像用核素的传统诊断方法、成像方法相比，可以更正确地对目的部位进行诊断、成像。或者，本发明的药物递送复合物本身可作为用作诊断或成像试剂的药物的分子探针使用。本发明的药物递送复合物不引起红细胞凝集，细胞毒性低，且向细胞内摄入的效率好，并具有对细胞、器官的趋向性，因此可以说是可以安全且有效地使用的分子探针。当本发明的药物递送复合物作为用于递送成像用核素的载体使用的情况下，本发明的药物优选制备为阳离子型树形化合物与螯合剂的复合物(下位简称为药物复合物)。对于阳离子型树形化合物所具有的阳离子基团(例如氨基)，可以通过共价键导入色素、荧光色素分子等药物，此外，对于螯合剂，也可以导入放射性核素、MRI造影剂、镧系元素等药物。使阳离子型树形化合物与螯合剂结合的方法，或制备本发明的药物与阳离子型树形化合物和螯合剂的复合物的方法是本领域技术人员公知的。例如，药物复合物的制备方法可列举混合阳离子型树形化合物和螯合剂而形成阳离子型树形化合物与螯合剂的复合物，并用成像用核素加以标记的方法。通过适用作为此类阳离子型树形化合物和螯合剂的复合物而制备的药物，本发明的载体也可能适用于多模态成像探针。在用于所述用途时，包含在药物复合物中的阳离子型树形化合物可列举聚酰胺树形化合物等。此外作为螯合剂，可列举P-SCN苄基二乙烯三胺五乙酸(DTPA)等。用于本发明的复合物中的阴离子型分子是与上述抗原或后述药物和阳离子型分子一起形成的具有细胞或组织趋向性的复合物的、作为阴离子型的分子。阴离子型分子与后述的阳离子型分子通过静电相互作用缔合，形成实质上不带电荷或带负的表面电荷的本发明的复合物。优选的阴离子型分子可列举阴离子型高分子、阴离子型脂类(例如月桂酰肌氨酸(下文有时缩写为LS)、磷脂酰丝氨酸(下文有时缩写为DOPS)等)、整体上带负电荷的基因(例如适体等)、整体上带负电荷的抗体等。其中，例如月桂酰肌氨酸、Y-聚谷氨酸(下文有时缩写为Y-PGA)、甘草皂苷(下文有时缩写为GLY)、磷脂酰丝氨酸、硫酸软骨素、海藻酸等是特别优选的。这些阴离子型分子可以是包含各种核素(例如，天然放射性核素、人工放射性核素、正电子放射性核素等)的，也可以是用核素进行放射性标记的。或者，也可以是用各种化合物(例如，公知的荧光色素、酶等)标记的。各种阴离子型分子可以呈现盐的形态，所述盐的形态可列举钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铝盐、盐酸盐等。在本发明的复合物中，阴离子型分子是赋予复合物的细胞或器官趋向性最重要的分子。 例如，在赋予脾、肺或肝趋向性的情况下，阴离子型分子优选选自磷脂酰丝氨酸、月桂酰肌氨酸和甘草皂苷。特别是在赋予脾趋向性的情况下，优选选择磷脂酰丝氨酸，在赋予肺趋向性的情况下，优选选择月桂酰肌氨酸，在赋予肝脏趋向性的情况下，优选选择甘草皂苷。对各器官中摄入本发明的复合物的细胞没有特殊的限制，可以是形成各器官的任何细胞。例如，具有肝趋向性的本发明的复合物可以被肝实质细胞摄入。阴离子型脂类也可以作为本发明的复合物中的脂质体的组成成分使用。此类阴离子型脂类可列举磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰甘油、LS等。在本发明的一个实施方案中，阴离子型分子可选自适体、miRNA和抗体。在本说明书中，适体是指通过体外选择方法(SELEX:基于指数富集的配体系统性进化)产生的高亲和力、高特异性的基于RNA或DNA的配体。适体是从20-30个核苷酸的随机配列生成的，基于与分子抗原或细胞的吸附选择性地进行筛选，并进行浓缩以特异性地纯化高亲和力的结合配体。为了提高体内的稳定性和实用性，通常化学修饰适体，以抑制核酸酶分解，或使其易于与试剂、标志物或颗粒结合。此外，通过更简单的化学交联方法，替换不具体参与与配体的相互作用的核酸。在溶液中，适体虽不形成结构，但有可能折叠、包围目标表位，据此特异性地识别。表位周围的核酸的特异折叠产生氢键、静电力、堆积、具有由形状互补性介导的识别力的分子间接触。与基于蛋白质的配体相比，一般而言，适体是稳定的，加热灭菌的传导性高，免疫原性低。现在，适体已以包括血管形成、血小板活化、实体肿瘤在内的多种具有临床意义的病变为目标使用，其用途正在增多。在适体作为成像和/或治疗用乳液颗粒中的靶向配体使用的情况下，其临床实用性有时依赖于相对于清除率的由核酸的磷酸基赋予的表面负电荷强度。使用基于脂类的颗粒进行的在先研究表示，负的4电位显著降低脂质体的血液半衰期，另一方面，中性或阳离子型颗粒则都在全身维持更长的时间。本发明的适体还可以采用盐的形态，此类适体的盐可列举钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、招盐等。所述适体或其盐可以使用市售的(例如，北海道SystemScience公司生产),也可以使用常用规程来恰当地制备。在本发明的复合物中，作为阴离子型分子使用的抗体只要是表现为阴离子型分子(例如，抗体表面作为整体带负电)的抗体即可，没有特殊的限制。使用抗体作为阴离子型分子，可以利用抗原抗体反应进一步提高对细胞、器官的趋向性。此类抗体可以使用市售的，也可以使用常用的规程，针对所选定的抗原来适宜地制备。在本发明的一个实施方案中，用于本发明的复合物中的阴离子型分子选自Y-聚谷氨酸、硫酸软骨素(下文缩写为CS)、海藻酸(下文缩写为AGA)及其盐。所述实施方案中的阴离子型分子优选是Y-PGA。本说明书中，Y-PGA或其盐可列举下列通式(I)所表示的化合物。[化学式I]
权利要求
1.抗原或药物递送复合物，其含有抗原或药物与阳离子型分子的复合物、以及阴离子型分子，并且具有对细胞或器官的趋向性，所述阴离子型分子包合所述抗原或药物与阳离子型分子的复合物。
2.权利要求I所述的复合物，其中，所述抗原或药物是核酸、肽、蛋白质或失活的病毒。
3.权利要求I或2所述的复合物，其中，所述阴离子型分子选自磷脂酰丝氨酸、月桂酰肌氨酸和甘草皂苷，并具有对脾、肺或肝的趋向性。
4.权利要求3所述的复合物，其中，所述阴离子型分子是磷脂酰丝氨酸；抗原或药物、阳离子型分子、及磷脂酰丝氨酸的配比为1:2:4-1:8:8 ;且具有对脾脏的趋向性。
5.权利要求3所述的复合物，其中，所述阴离子型分子是月桂酰肌氨酸；阳离子型分子由阳离子型高分子和阳离子型脂类组成；抗原或药物、阳离子型高分子、阳离子型脂类、及月桂酰肌氨酸的配比为1:2:2:1-1:2:2:4 ;且具有对肺的趋向性。
6.权利要求3所述的复合物，其中，所述阴离子型分子是甘草皂苷；抗原或药物、阳离子型分子、及甘草皂苷的配比为1:2:8-1:8:16;且具有对肝的趋向性。
7.权利要求I或2所述的复合物，其中，所述阴离子型分子是Y-聚谷氨酸，且具有对树突状细胞或脾的趋向性。
8.权利要求7所述的复合物，其中，抗原或药物、阳离子型分子、及Y-聚谷氨酸的配比为1:2:8-1:8:16 ;且具有对树突状细胞或脾的趋向性。
9.权利要求I或2所述的复合物，其中，所述阴离子型分子选自适体、miRNA和抗体。
10.权利要求9所述的复合物，其中，所述抗原或药物、阳离子型分子、及阴离子型分子的配比为 1:2:8-1:8:16。
11.权利要求1-10中任一项所述的复合物，其中所述复合物由 抗原或药物 '及 选自聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸、聚こ烯亚胺和阳离子型树形化合物的阳离子型高分子，或选自DOTMA、DOTAP、DC-Chol和苯扎氯铵的阳离子型脂类组成。
12.权利要求1-10中任一项所述的复合物，其中，所述复合物由抗原或药物；及脂质体或胶束组成， 所述脂质体或胶束由选自DOTMA、DOTAP和DC-Chol的阳离子型脂类与选自DOPE和胆固醇的脂类制成。
13.成像用核素的载体，包含用于成像的权利要求1-12中任一项所述的复合物。
14.权利要求14所述的载体，其中，抗原或药物是由成像用核素、阳离子型树形化合物和螯合剂组成的复合物；阳离子型分子是聚こ烯亚胺；阴离子型分子是Y-聚谷氨酸；且具有对淋巴结的趋向性。
15.前哨淋巴结的成像方法，其特征是使用由药物复合物、聚こ烯亚胺和Y-聚谷氨酸组成的复合物，其中所述药物组合物由成像用核素、阳离子型树形化合物和螯合剂组成。
全文摘要
本发明的目的是提供抗原递送复合物或药物递送复合物，其特征是安全性和效价高，可以大规模生产和保存，并具有细胞或器官趋向性。本发明提供了抗原或药物递送复合物，其特征是含有抗原或药物与阳离子型分子的复合物以及包合所述复合物的阴离子型分子，并具有细胞或器官趋向性。本发明的抗原或药物递送复合物可用作向特定细胞或器官递送各种抗原或药物的药物递送系统的主要组分。
文档编号A61K39/002GK102858367SQ201180021210
公开日2013年1月2日 申请日期2011年2月24日 优先权日2010年2月26日
发明者佐佐木均, 黑崎友亮, 北原隆志, 藤秀人, 由井克之, 平山谦二, 森田公一, 向高弘, 间贺田泰宽, 小川美香子, 佐野纮平 申请人:国立大学法人长崎大学, 国立大学法人九州大学, 国立大学法人浜松医科大学