专利名称：药物复合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药上有用的药物复合物。进而具体地说，本发明涉及通过间隔基，将多糖衍生物的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇与抗肿瘤剂或抗炎剂的医药化合物结合形成的药物复合物。
背景技术：
治疗肺癌或消化道癌等固型癌或白血病等血癌时所用的抗肿瘤剂，是通过静脉给药或经口给药等给药途径给药到全身后，转送到特定的肿瘤部位，阻碍及抑制癌细胞增殖，发挥治疗效果。可是，由于全身给药的抗肿瘤剂，迅速从血液中进入肝脏、网状系统脏器或迅速排泄到尿中，使血液中浓度降低、向肿瘤部位转送有时不充分。另外，对于通常的抗肿瘤剂本身，由于向肿瘤部位传送的选择性低(肿瘤选择性)，抗肿瘤剂遍布在全身的各细胞或组织，对于正常细胞和组织起着细胞毒素作用，所以呕吐、发烧或脱发等副作用的发生率极高。因此，希望能开发出将抗肿瘤剂高效且选择性地移送到肿瘤部位的方法。
作为这样的方法，提出了将抗肿瘤剂与多糖高分子结合，延缓抗肿瘤剂从血液中的消失，且提高对肿瘤组织的定向性的方案。例如特公平7-84481号公报中公开了通过席夫碱或酰胺键，在羧甲基化的甘露葡聚糖衍生物中导入道诺红霉素、阿霉素、丝裂霉素C或博来霉素等的药物复合物。作为该发明的甘露葡聚糖衍生物，也可用羧甲基化的甘露葡聚糖多元醇。可是，甘露葡聚糖衍生物的支链多，结构复杂，所以难以得到适于医药品制备的均一品质。
另外，在国际公开WO94/19376号中公开了在具有羧基的多糖羧基上结合肽链(氨基酸数1-8)、进而通过该肽链结合阿霉素、道诺红霉素、丝裂霉素C或博来霉素等的药物复合物。作为具有羧基的多糖，可举出除了原来的该结构中具有羧基的多糖(例如透明质酸等)之外，在原来的该结构中不具有羧基的多糖(例如プルラン、葡聚糖、壳多糖等)的羟基中导入羧基C1-4烷基或将丙二酸或琥珀酸等多元酸进行酯结合导入羧基的多糖类等。该药物复合物，其结构特征是通过间隔基将阿霉素等药物和上述多糖部分结合起来，得到比阿霉素优良的抗肿瘤效果，同时也减轻了毒、副作用。
此外，对于采用将多元醇化多糖衍生物作为药物传递载体的药物复合物有关的技术，有“关于多糖-肽-阿霉素复合物的研究、多糖载体的血液中稳定性和抗肿瘤效果的关系”(第10次日本DDS学会讲演要旨集，279，1994)；“关于多糖-肽-阿霉素复合物的研究、体内动力学和抗肿瘤效果”(第9次日本药物动态学会年会讲演要旨集，292，1994)；第19次研究开发动向研讨会(医药品机构主办)要旨集，D-9，1995；及“有关通过多糖载体，向肿瘤进行药物传递的研究”(第12次胶体、界面技术研讨会，日本化学会，讲演要旨集，51，1995)等报告。
发明的公开本发明的目的在于提供将抗肿瘤剂或抗炎剂等有效成分，可选择部位地移送到肿瘤部位的药物复合物。更具体地说，本发明的目的是提供含有抗肿瘤剂或抗炎剂等的医药化合物作为部分结构的药物复合物，可长时间滞留在血液中，且在肿瘤部位或炎症部位中可选择部位地送入该医药化合物的药物复合物。另外，本发明的另一个目的在于提供制备具有上述特征的药物复合物的方法。
本发明者们为了达到上述目的，对于国际公开WO94/19376号公开的药物复合物进行改良的结果表明，作为多糖部分，若使用将葡聚糖多元醇化的葡聚糖衍生物的羧基C1-4烷基化产物代替具有羧基的多糖类，给药后的药物可长时间地维持高浓度的同时，可大幅度地改善对于肿瘤部位或炎症部位的选择性。另外，还发现这样的化合物可显著地增强抗肿瘤效果等主药效力；另一方面，降低了毒性。本发明就是基于这些而完成的。
即，本发明提供了一种药物复合物，其特征是通过含有1个氨基酸的间隔基或含有肽式键合的2～8个氨基酸的间隔基，使羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇和医药化合物的残基结合。另外，按照本发明的另一方案，可提供含有上述药物复合物的医药及以上述药物复合物作为有效成分的医药组合物，例如充填到安瓿中的冷冻干燥品状态的注射用或滴注用制剂等。进而，按照本发明的又一方案，可提供上述药物复合物的制备方法。
作为上述发明的优选的方案，可提供上述药物复合物，其特征是构成羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的葡聚糖多元醇实质上是在可完全多元醇化的条件下，将葡聚糖处理得到的葡聚糖多元醇；上述药物复合物的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇是羧甲基葡聚糖多元醇；上述药物复合物的医药化合物是抗肿瘤剂或抗炎剂；上述医药复合物的医药化合物是显示依赖于浓度的抗肿瘤作用的抗肿瘤剂(在更高浓度下，显示更强的抗肿瘤作用的抗肿瘤剂在本说明书中，也叫作浓度依赖型的抗肿瘤剂)；上述药物复合物的医药化合物是显示依赖于时间的抗肿瘤作用的抗肿瘤剂(在更长作用时间下，显示更强的抗肿瘤作用的抗肿瘤剂在本说明书中也叫作时间依赖型的抗肿瘤剂)；以及抗肿瘤剂是葡聚糖或(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并(3′，4′6，7)中氮茚并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮。
另外，作为同样优选的方案，可提供间隔基是用-X-Z-表示的二肽(-X-Z-是指疏水性氨基酸(X)和亲水性氨基酸(Z)分别成为N末端侧及C末端侧，进行肽式键合后，从形成的二肽的N末端的氨基及C末端的羧基分别除去1个氢原子及1个羟基的残基)或间隔基含有该二肽作为部分肽序列的上述药物复合物；疏水性氨基酸是苯基丙氨酸，而亲水性氨基酸是甘氨酸的上述药物复合物；间隔基是(N末端)-Gly-Gly-Phe-Gly-的上述药物复合物；以及抗肿瘤剂的残基导入量是1～15重量％、优选的是3～10重量％、最优选的是5～6重量％范围的上述药物复合物。
作为本发明特别优选的方案，提供用NH2-Gly-Gly-Phe-Gly-COOH表示的肽的N末端，与羧甲基葡聚糖多元醇的羧基进行酰胺结合，该肽的C末端与(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并(3′，4′6，7)中氮茚并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-氨基和酰胺结合形成的上述药物复合物；(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并(3′，4′6，7)中氮茚并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮残基的导入量是2～10重量％范围的上述药物复合物；以及羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的分子量是5,000～500,000的范围、优选的是50,000～450,000的范围、更优选200,000～400,000范围的羧甲基葡聚糖多元醇、羧甲基化度范围是每一构成糖残基为0.01～2.0、优选的是0.1～1.0、最优选的是0.3～0.5的上述药物复合物。
按照本发明的另一个方案，可提供含有由羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的药物传送的载体。对于该发明的优选的方案，羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的分子量是5,000～500,000的范围、优选的是50,000～450,000的范围、最优选的是200,000～400,000的范围、羧基C1-4烷基化度的范围是每一构成糖残基为0.01～2.0、优选的是0.1～1.0、最优选的是0.3～0.5。作为最优选的载体，可提供羧甲基葡聚糖多元醇。从本发明的另一个观点看，提供了在制备含有与医药化合物的残基结合的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的药物复合物中羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇。
作为本发明的优选的方案，可提供在制备药物复合物中羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的应用，其特征是在制备通过间隔基将医药化合物的残基和羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇结合形成药物复合物中的应用，以及通过含有1个氨基酸的间隔基或肽式键合的含有2～8个氨基酸的间隔基，将羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇和医药化合物的残基结合。
图的简单说明
图1是表示本发明的药物复合物(由例8制备的)的GPC图。
图2是表示本发明的药物复合物(由例8制备的)的紫外线吸收光谱图。
图3是表示本发明的药物复合物(由例9制备的)的GPC图。
图4是表示本发明的药物复合物(由例9制备的)的紫外线吸收光谱图。
图5是表示本发明的药物复合物(由例10制备的)的紫外线吸收光谱图。
图6是表示本发明的药物复合物(由例15制备的)的GPC图。
图7是表示本发明的药物复合物(由例15制备的)的紫外线吸收光谱图。
图8是表示本发明的药物复合物(由例28制备的)的GPC图。
图9是表示本发明的药物复合物(由例28制备的)的紫外线吸收光谱图。
图10是表示本发明的药物复合物(由例29制备的)的GPC图。
图11是表示本发明的药物复合物(由例29制备的)的紫外线吸收光谱图。
图12是表示本发明的药物复合物(由例34制备的)的GPC图。
图13是表示本发明的药物复合物(由例34制备的)的紫外线吸收光谱图。
图14是表示本发明的药物复合物(由例39制备的)的GPC图。
图15是表示本发明的药物复合物(由例39制备的)的紫外线吸收光谱图。
图16是表示本发明的药物复合物(由例41制备的)的GPC图。
图17是表示本发明的药物复合物(由例41制备的)的紫外线吸收光谱图。
图18是表示本发明的药物复合物(由例44制备的)的GPC图。
图19是表示本发明的药物复合物(由例44制备的)的紫外线吸收光谱图。
图20是表示本发明的药物复合物(由例47制备的)的GPC图。
图21是表示本发明的药物复合物(由例47制备的)的紫外线吸收光谱图。
图22是表示本发明的药物复合物(由例55制备的)的GPC图。
图23是表示本发明的药物复合物(由例55制备的)的紫外线吸收光谱图。
图24是表示本发明的药物复合物(图例15制备的)的体内动态图。图中的各点表示三个例子的平均值。
实施本发明的最佳方案本发明的药物复合物，其特征是通过含有1个氨基酸的间隔基或含有肽式键合的2～8个氨基酸的间隔基，使羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇和医药化合物的残基结合形成。
本发明的药物复合物含有的医药化合物的残基，来自例如作为抗肿瘤剂、抗炎剂、抗菌剂等的医药，包括人的哺乳类的疾病治疗和/或预防所用的医药化合物，由其部分结构而构成的。但是，产生残基的医药化合物，不受上述的限制。另外，作为医药化合物，也可使用具有能与间隔基结合的1或1以上的反应性官能基(例如氨基、羧基、烃基、硫醇基、酯基等)的任何一种。在本说明书中，所说的医药化合物，也包括含有其本身具有医药作用的化合物的主要结构作为其部分结构，可在生物体内再生该化合物的前药化合物。
更具体地说，在本说明书中，所说的医药化合物的残基是指在假定通过医药化合物中的反应性官能基和间隔基中的反应性官能基的反应(例如脱水缩合等)形成间隔基和医药化合物残基的结合时，来自存在于结合后的化合物中的医药化合物的部分结构。例如，在用D-NH2、D-COOH、D-COOR、D-OH、D-SH、D-CONH2、D-NH-COOR(R是低级烷基等)表示医药化合物时，医药化合物的残基分别用D-NH-(D-NH-CO-Q等)、D-CO-(D-CO-NH-Q、D-CO-O-Q、D-CO-S-Q等)、D-CO-(D-CO-NH-Q、D-CO-O-Q、D-CO-S-Q等)、D-O-(D-O-CO-Q、D-O-Q等)、D-S-(D-S-CO-Q、D-S-Q等)、D-CONH-(D-CO-NH-CO-Q等)、D-NH-CO-(D-NH-CO-O-Q、D-NH-CO-NH-Q等)表示(括号内表示间隔基和医药化合物残基的结合、Q表示间隔基中除去反应性官能基剩余的部分结构)。但是，间隔基和医药化合物残基的结合种类，不受上述所限制。医药化合物的残基，除了间隔基的N末端氨基或C末端羧基之外，也可结合在构成间隔基的氨基酸的反应性官能基上。
作为医药化合物的残基，例如可适宜地使用阿霉素、道诺红霉素、丝裂霉素C、博来霉素、环胞苷、长春新碱、长春碱、甲氨喋呤、铂系抗肿瘤剂(顺氯氨铂或其衍生物)、紫杉醇或其衍生物、喜树碱或其衍生物(特开平6-87746号公报所述的抗肿瘤剂，优选的是权利要求2所述的(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并(3′，4′6，7)中氮茚并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮等)等的抗肿瘤剂的残基。另外，也可适宜使用例如琥珀酸氢可的松、琥珀酸泼尼松等的甾系抗炎剂或甲灭酸、氟灭酸、双氯芬酸、布洛芬、氨苄噻吡酯等非甾体抗炎药的残基。
作为与医药化合物残基结合的间隔基，可使用含有1个氨基酸的间隔基或肽式键合的2～8个氨基酸的间隔基。更具体地说，间隔基具有1个氨基酸的残基(指从氨基酸的氨基及羧基分别除去1个氢原子及1个羟基的残基)、或含有肽式键合的2～8个氨基酸的低聚肽的残基(指从N末端的氨基及C末端的羧基，分别除去1个氢原子及1个羟基的残基)的形态。
优选的间隔基是含有2～6个氨基酸的低聚肽的残基。对于构成间隔基的氨基酸的种类没有特别限制，例如可使用L-或D-氨基酸，优选的是L-氨基酸，除了α-氨基酸外，也可使用β-丙氨酸、ε-氨基己酸、γ-氨基丁酸等。这些α-氨基酸以外的氨基酸，优选配置在接近多糖衍生物的位置上。
对于间隔基的结合方向没有特别限制，一般是通过酰胺键，可将间隔基的N末端与羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的羧基结合，将间隔基的C末端与医药化合物的氨基结合。另外，作为肽间隔基的构成单元，含有赖氨酸残基，若将赖氨酸残基的α-氨基及ε-氨基，分别与其他的氨基酸的羧基进行酰胺结合，由于肽间隔基的两末端为N末端，所以可结合医药化合物的羧基。进而，在间隔基中，作为构成单位，含有1个或1个以上的二胺化合物或二羧酸化合物的残基(例如乙二胺等的二胺的残基或琥珀酸等的二羧酸的残基)，也可分别利用两末端是N末端的间隔基及两末端是C末端的间隔基。
对于间隔基的氨基酸序列没有特别限制，例如间隔基是用-X-Z-表示的二肽的残基(X表示疏水性氨基酸的残基、Z表示亲水性氨基酸的残基、-X-Z-是指疏水性氨基酸(X)和亲水性氨基酸(Z)进行肽式键合后，分别成为N末端侧及C末端侧，从二肽的N末端的氨基及C末端的羧基分别除去1个氢原子及1个羟基的残基)或可适宜使用含有该二肽的残基作为部分肽序列的间隔基。作为疏水性氨基酸，例如可使用苯基丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸等，作为亲水性氨基酸，例如可使用甘氨酸、丙氨酸等。间隔基也可具有这样的二肽残基的重复序列(例如-X-Z-X-Z-、-X-Z-X-Z-X-Z-等)。
若使用含有这样的二肽结构的间隔基，间隔基在被认为肽酶多的肿瘤部位或炎症部位被水解，在该部位上高浓度地游离医药化合物。含有上述二肽的间隔基和医药化合物结合形成的部分结构是本发明的药物复合物的优选部分结构。作为医药化合物的残基，例如使用浓度依赖型的抗肿瘤剂(例如阿霉素)等时，特别优选的是使用含有用-X-Z-表示的上述的二肽残基构成的间隔基或含有该二肽残基作为部分肽序列的间隔基。
另外，作为医药化合物的残基，即使在使用必须在一定浓度以上有持续作用时间的时间依赖型的抗肿瘤剂，也可通过使用上述的间隔基，达到高抗肿瘤效果，例如可举出特开平6-87746号公报所述的抗肿瘤剂，优选的是权利要求2所述的抗肿瘤剂。一般，不受上述的间隔基限制，而从抗肿瘤剂的作用机理、体内动态或毒性显示的特征、在体内的抗肿瘤剂的游离性等观点看，有必要选择优选的间隔基。另外，一般，对于增殖迅速的癌种，优选的是选择可在短期游离出高浓度的医药化合物的上述间隔基。
间隔基的具体例子如下所示，但本发明的药物复合物所使用的间隔基不受这些例子限制，当然本专业人员可适宜选择，以给与医药化合物适宜的游离速度。表中，肽序列的左侧是N末端、在C末端侧结合医药化合物的残基。D-Phe表示D-苯基丙氨酸残基、其他的氨基酸表示L-氨基酸。另外，游离速度的大小是根据对于结合了阿霉素的药物复合物的感染Walker 256癌的白鼠的药效显示程度、或感染Walker 256癌白鼠肿瘤部位的游离阿霉素浓度来判定的。在这些间隔基中，最好使用对于阿霉素，优选的是(N末端)-Gly-Gly-Phe-Gly-等在短时间内可游离出高浓度的医药化合物的间隔基。
表1(a)游离速度大的间隔基-Leu-Gly--Tyr-Gly--Phe-Gly--Gly-Phe-Gly--Gly-Gly-Phe-Gly--Gly-Phe-Gly-Gly--Phe-Gly-Gly-Gly--Phe-Phe-Gly-Gly--Gly-Gly-Gly-Phe-Gly-(b)游离速度比较大的间隔基-Gly-Gly-Phe-Phe--Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-(c)游离速度比较小的间隔基-Phe-Phe--Ala-Gly--Pro-Gly--Gly-Gly-Gly-Phe-(d)游离速度小的间隔基-Gly--D-Phe-Gly--Gly-Phe--Ser-Gly--Gly-Gly--Gly-Gly-Gly--Gly-Gly-Gly-Gly-对于构成本发明药物复合物的多糖衍生物部分的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的多元醇化度，没有特别限制，但构成羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的葡聚糖多元醇，优选的是实质上是在可完全多元醇化的条件下，处理葡聚糖而得到的葡聚糖多元醇。例如将极过量的高碘酸钠和硼氢化钠，依次与葡聚糖作用，可得到适合作为本发明的药物复合物的原料化合物的实质上完全多元醇化的葡聚糖多元醇。当然，葡聚糖的多元醇化的方法，不受上述的限制，对于本专业人员，只要是可使用的，可采用其中的任何一种方法。
对于葡聚糖的种类，没有特别的限制，可以任何比例含有α-D-1，6-键。例如，可使用α-D-1，6-键的比例在85％以上、90％以上或95％以上的葡聚糖等。对于葡聚糖的分子量，没有特别限制，但例如可使用10,000～2,000,000范围的，优选的是使用50,000～800,000范围的。作为构成羧基C1-4烷基的C1-4烷基，可使用直链或支链的C1-4烷基，具体地例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基等，但优选的是可使用甲基。羧基C1-4烷基化，例如，对于葡聚糖多元醇的羟基，可通过使氯代醋酸、溴代醋酸、α-氯丙酸、α-甲基-α-氯丙酸、β-氯丙酸、α-甲基-β-氯丙酸、α-氯代丁酸、β-氯代丁酸、γ-氧代丁酸等的卤代C1-4烷基羧酸、优选的是氯代醋酸进行反应，将羟基部分或完全地羧基C1-4烷基化。
例如，只要将葡聚糖多元醇溶解在不参与反应的惰性溶剂(例如水、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等)、在碱(例如氢氧化钠或氢氧化钾等)存在下，添加卤代C1-4烷基羧酸或其盐，在冰冷下乃至100℃左右温度范围下，反应数分钟-数日就可以。羧基C1-4烷基的导入程度，可通过例如适宜选择羧基C1-4烷基化的反应温度和作为试料使用的卤代C1-4烷基羧酸及碱量容易地进行调节，其调节方法是专业人员所公知的。对于葡聚糖多元醇的羟基的羧基C1-4烷基化的程度，没有特别限制，例如对于每个构成糖残基是0.01～2.0的范围、优选是0.1～1.0、最优选的是0.3～0.5的范围。羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的分子量在用凝胶过滤法测定时，是5,000～500,000左右、优选的是50,000～450,000左右、最优选的是200,000～400,000左右。
上述的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇，作为药物传递的载体是有用的。将医药化合物与羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇结合的药物复合物，其特征是例如具有肿瘤选择性等的优良选择性，另外，可长时间维持高的血中浓度。作为医药化合物和羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的结合，例如可采用以酯键将两者直接结合的方法，通过上述所说的间隔基等采用适宜间隔基，将两者结合的方法等。
对于通过间隔基结合的药物复合物，可通过将和医药化合物的残基结合的间隔基与上述得到的羧甲基葡聚糖多元醇的羧基结合，制备本发明的药物复合物。间隔基和羧甲基葡聚糖多元醇的羧基的结合，一般是通过酰胺键将间隔基的N末端胺基和羧甲基葡聚糖多元醇的羧基结合形成的。当然，间隔基和羧甲基葡聚糖多元醇的羧基的结合不受上述所限制，也可用其他的化学键和1或1以上的间隔基结合。例如可通过间隔基的C末端羧基和羧甲基葡聚糖多元醇的羧基形成酸酐，或也可将乙二胺等二胺化合物作为间隔基使用，将各个羧基与二胺的各个氨基进行酰胺结合。
在通过酰胺键将间隔基的N末端氨基和羧甲基葡聚糖多元醇的羧基结合时，除了使用肽链合成所采用的通常的脱水缩合剂，例如N，N′-二环己基碳化二亚胺(DCC)等的N，N′-二环烷基碳化二亚胺类、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDAPC)等的碳化二亚胺衍生物、1-羟基苯并三唑(HOBT)等的苯并三唑衍生物之外，也可使用1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二羟基喹啉(EEDQ)等。另外，也可通过活性酯法或酰卤法进行反应。
对于导入到羧甲基葡聚糖多元醇的医药化合物残基量，没有特别限制，但可从医药化合物残基的物理化学性质以及本发明的药物复合物的体内动态、药效及毒性等出发适宜选择。一般，可选择0.1～30重量％、优选的是1～15重量％、更优选的是3～10重量％、最优选的是5～6重量％左右的范围。例如，通过吸光度分析等可容易地决定导入到羧甲基葡聚糖多元醇的医药化合物残基的比例。
作为本发明的药物复合物的制备方法的一个例子，在导入特开平6-87746号公报的权利要求2所述的抗肿瘤剂的医药化合物的残基时，制备方法如下图所示，但本发明的药物复合物及其制备方法不受该图所示的限制。在下图中，医药化合物残基的导入量，例如是1～15重量％、优选的是2～10重量％左右。另外，在下图中，仅表示导入多元醇类结构单元中的1个或2个羧甲基的结构单元，但应理解本发明的药物复合物的多糖衍生物部分不是通过重复上述结构单元而构成的。
本发明的药物复合物
上述的医药化合物，在酸性水性溶剂中(例如pH为3左右)，其平衡偏向形成内酯环的化合物(闭环体)，另一方面，在碱性水性溶剂中(例如pH10左右)，其平衡偏向内酯环开环化合物(开环体)，但向这样的闭环体及开环体导入相应残基的药物复合物，具有相同的抗肿瘤效果，全都包括在本发明的范围内这是不言而喻的。另外，若在反应系中存在内酯环开环了的反应种时，则来自内酯环的羧基和来自间隔基的氨基之间显著地进行缩合反应，不仅反应收率降低，而且得不到作为目的的均一的药物复合物。此时可通过选择地使用闭环体作为反应种，来避免这样的副反应。
即，将羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐变成三乙基铵盐后，在非水系(不含水的有机溶剂)中，通过将结合了上述医药化合物的残基的间隔基的N末端氨基与羧甲基葡聚糖多元醇的羧基进行缩合，可抑制副反应，可有效地制备目的物。作为可溶解在有机溶剂的羧甲基葡聚糖多元醇的盐，例如除了三乙基铵盐和三甲基铵盐等的三烷基铵盐之外，可使用N-甲基吡咯烷、N-甲基吗啉、二甲基氨基吡啶(DMAP)等的有机碱的盐。作为有机溶剂，可使用N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等。
本发明的药物复合物，根据医药化合物的残基种类(例如抗肿瘤剂或抗炎剂等的医药化合物的残基)，在肿瘤部位或炎症部位等处，可特异地显示所希望的医药活性，且可减少医药化合物本身具有的毒性。虽然不应局限于任何特定的理论，但本发明的药物复合物的多糖衍生物部分(例如羧甲基葡聚糖多元醇)由于具有极优良的血液中滞留性及对于肿瘤、炎症部分的积累性，所以作为药物传递的载体是有用的，本发明的药物复合物具有肿瘤选择性及炎症部位选择性。另外，对于肿瘤部位或炎症部位，由于被认为显示有蛋白酶(肽酶)，所以本发明的药物复合物的间隔基容易被水解，使游离的医药化合物发挥药效。
含有本发明的药物复合物的医药，通常可以冷冻干燥品等形式填充到安瓿中，作为用时溶解型的注射用或滴注用制剂等非经口给药用制剂，提供于临床上，但本发明的医药制剂形态不受上述形态限制。对于上述制剂的制备，可使用在本专业界可用的例如助溶剂、pH调节剂、稳定剂等制剂用辅料。对于本发明药物的给药量没有特别限制，但通常应该考虑构成医药化合物残基的医药化合物的给药量、导入到本发明药物复合物中的医药化合物的残基量、患者的状态或疾病种类等决定。例如，在将以6重量％左右的比例导入特开平6-87746号公报的权利要求2所述的抗肿瘤剂的残基的本发明的药物复合物进行非经口给药时，一般，每1天，对于1m2体表面积，约1～500mg左右、优选的是约10～100mg的范围一次给药，每3～4周重复进行。
实施例以下，用实施例进一步具体说明本发明，但本发明的范围不受下述实施例限制。实施例中，“A-NH-”表示象在特开平6-87746号公报的权利要求2所述的药物化合物(在实施例中，也称为“DX-8951”)那样具有内脂环的药物化合物中，用A-NH2表示具有闭环内酯环的医药化合物时，该医药化合物的残基，其中的一个例子是在上述图中，用A-NH-表示的基团(形成内酯环的)。另外，A′-NH-表示用A-NH-表示的医药化合物残基中的内酯环是闭环型或开环型中任何一种或它们的混合形态，-DXR表示来自阿霉素的残基，-D51-7059表示来自例55所示的紫杉醇衍生物的残基。
另外，实施例中没有特别说明时，羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度(每个构成糖残基的羧甲基的取代度)是通过将羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐变成游离酸型后，溶解在0.1N氢氧化钠水溶液中，用0.1N盐酸滴定求出的。将羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐的水溶液，加到Bio-RadAG50W-x2(H+型)柱上，将通过液冷冻干燥作为试样使用。将该试样溶解在规定过量的0.1N氢氧化钠水溶液中，以酚酞作为指示剂，用0.1N盐酸滴定。将试样的采取量定为s(mg)、0.1N氢氧化钠水溶液的规定过量定为a(ml)、0.1N盐酸的滴定量定为b(ml)，用13.4(a-b)/[s-5.8(a-b)]式求出羧甲基化度。另外，药物的导入量(重量％)，从利用药物的特征吸收的吸光度分析(362nm附近)求出。进而，凝胶过滤法按照以下条件进行(柱TSK gel G4000 PWXL、洗脱液0.1M NaCl、流速0.8ml/min、柱温40℃)。
例13′-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)
将Boc-Gly-Gly-Phe-Gly(600mg)及N-羟基丁二酰亚胺(160mg)，溶解到N，N-二甲基甲酰胺(20ml)中，冷却到4℃后，添加N，N′-二环己基碳化二亚胺(280mg)。在该溶液中，加入溶解了特开平6-87746号公报的权利要求2所述的医药化合物的甲磺酸盐(600mg上述公报的实施例50所述的化合物)和三乙胺(0.16ml)的N，N-二甲基甲酰胺(30ml)溶液，在避光、室温下，一边搅拌16小时；一边进行反应。将该反应液减压干固，用硅胶柱色谱(洗脱液含有0.5％醋酸的二氯甲烷∶甲醇＝10∶1溶液)精制，得到标题化合物(1.0g)。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.40(d，1H，J＝8.3Hz)，8.10-8.17(m，2H)，7.91-8.01(m，1H)，7.78(d，1H，J＝10.75Hz)，7.32(s，1H)，6.94-6.96(m，1H)，6.50(s，1H)，5.57(t，1H，J＝4.5Hz)，5.43(s，2H)，5.23(s，2H)，3.77(dd，2H，J＝5.85Hz，J＝8.80Hz)，3.70(d，2H，J＝4.40Hz)，3.65(d，2H，J＝5.35Hz)，3.56(d，2H，J＝5.85)，3.15-3.25(m，2H)，2.40(s，3H)，2.05-2.25(m，1H)，1.86(m，2H)，1.35(s，9H)，0.88(t，3H，J＝7.35).Mass(FAB)m/e 854(M＋1)
例23′-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)的合成将Boc-Gly-Gly-Gly-Phe(600mg)及N-羟基丁二酰亚胺(160mg)，溶解在N，N-二甲基甲酰胺(20ml)中，冷却到4℃后，添加N，N′-二环己基碳化二亚胺(280mg)。在该溶液中，加入溶解了DX-8951的甲磺酸盐(600mg)和三乙胺(0.16mg)的N，N-二甲基甲酰胺(30ml)溶液，在避光、室温下，一边搅拌16小时；一边进行反应。该反应液进行减压干固，用硅胶柱色谱(洗脱液含有0.5％醋酸的二氯甲烷∶甲醇＝10∶1溶液)精制，得到标题化合物(700mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.57(d，1H，J＝7.8Hz)，8.19(d，1H)，8.05-8.07(m，2H)，7.79(d，1H，J＝11.2Hz)，7.32(s，1H)，7.10(d，2H，J＝7.8Hz)，6.93-7.03(m，4H)，6.51(s，1H)，5.52-5.55(m，1H)，5.44(s，2H)，5.18(d，1H，J＝18.5Hz)，4.84(d，1H，J＝18.5Hz)，4.57-4.59(m，1H)，3.57-3.71(m，6H)，3.15-3.25(m，2H)，3.00-3.02(m，1H)，2.80-2.90(m，1H)，2.40(s，3H)，2.05-2.25(m，1H)，1.86(m，2H)，1.35(s，9H)，0.88(t，3H，J＝7.35Hz).Mass(FAB)；m/e 854(M＋1)例33′-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)的合成将Boc-Gly-Gly-Gly-Gly(120mg)及N-羟基丁二酰亚胺(39mg)，溶解在N，N-二甲基甲酰胺(20ml)中，冷却到4℃后，添加N，N′-二环己基碳化二亚胺(70mg)。在该溶液中，加入溶解了DX-8951的甲磺酸盐(150mg)和三乙胺(0.039ml)的N，N-二甲基甲酰胺(10ml)溶液，在避光、室温下，一边搅拌16小时；一边进行反应。将该反应液进行减压干固，用硅胶柱色谱(洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝10∶1溶液)精制残渣，得到标题化合物(100mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.40(d，1H，J＝8.3Hz)，8.10-8.17(m，2H)，7.91-8.01(m，1H)，7.78(d，1H，J＝10.75Hz)，7.32(s，1H)，6.94-6.96(m，1H)，6.50(s，1H)，5.57(t，1H，J＝4.5Hz)，5.43(s，2H)，5.23(s，2H)，3.77(dd，2H，J＝5.85Hz，J＝8.80Hz)，3.70(d，2H，J＝4.40Hz)，3.65(d，2H，J＝5.35Hz)，3.56(d，2H，J＝5.85Hz)，3.15-3.25(m，2H)，2.40(s，3H)，2.05-2.25(m，1H)，1.86(m，2H)，1.35(s，9H)，0.88(t，3H，J＝7.35Hz).Mass(FAB)；m/e 764(M＋1)例43′-N-(Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)三氟醋酸盐的合成
将3′-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)(79mg)，溶解在三氟醋酸(3ml)中，放置1小时。馏去溶剂，用甲醇(30ml)共沸2次，用乙醇(30ml)共沸2次后，用乙醚洗涤残渣，得到标题化合物(80mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.59-8.61(m，1H)，8.50(d，1H，J＝8.3Hz)，8.21-8.27(m，2H)，7.91-8.01(br，3H)，7.81(d，1H，J＝11.2Hz)，7.32(s，1H)，6.50-6.52(br，1H)，5.57-5.59(m，1H)，5.43(s，2H)，5.23(s，2H)，3.80-3.82(m，3H)，3.70-3.75(m，3H)，3.15-3.25(m，2H)，2.41(s，3H)，2.05-2.25(m，1H)，1.86-1.88(m，2H)，0.88(t，3H，J＝7.35Hz).
例5羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐的合成将葡聚糖T 2000(10g，ファルマツア社制，平均分子量2,000,000)，溶解到0.1M醋酸缓冲液(pH5.5、1,000ml)中，加入高碘酸钠(33.0g)的水溶液(1000ml)。避光，4℃下，搅拌10天后，加入乙二醇(7.0ml)，搅拌1夜。在冰冷下，使用8M氢氧化钠水溶液，将反应液调节到pH为7.5。加入硼氢化钠(14g)，溶解后，在室温下搅拌1夜。在冰冷下，用醋酸调节反应液的pH为5.5，在4℃下，搅拌1小时后，在冰冷下，使用8M氢氧化钠水溶液调节pH为7.5。通过使用BIOMAX-30膜(ミリポア社制)的超滤法，从得到的水溶液中除去低分子成分。将高分子成分进行冷冻干燥，得到葡聚糖多元醇。将该葡聚糖多元醇，在pH3.0下，处理1小时后，用BIOMAX-50膜除去低分子成分，接着，用BIOMAX-100膜除去高分子成分，冷冻干燥，得到精制的葡聚糖多元醇(2.0g)。该物质的分子量(凝胶过滤法、葡聚糖标准)是220K。
将该精制葡聚糖多元醇(1.8g)、加入到将氢氧化钠(10.5g)溶解在水(45ml)得到的水溶液中，在室温下溶解。在该溶液中，在冰冷下，加入一氯醋酸(15g)溶解后，在室温下反应20小时。用醋酸将该反应液的pH调节到8后，通过使用BIOMAX-10膜的超滤法除去低分子成分。将高分子成分进行冷冻干燥，得到羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(1.8g)。该物质的分子量(凝胶过滤、葡聚糖标准)是330K，羧甲基化度是0.8。
将上述的羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(300mg)溶解在水中，装入到Bio-Rad AG50W-X2(200-400目、H+型)柱(1.5×8.6cm)，用水洗脱。在该洗脱液中加入三乙胺(0.5ml)后，冷冻干燥，得到羧甲基葡聚糖多元醇的三乙铵盐(380mg)。将羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(各300mg)，与上述相同地处理，得到羧甲基葡聚糖多元醇的三乙铵盐(380mg、400mg)。
例6羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐的合成将用上述例5得到的羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(0.15g)，加入到将氢氧化钠(1.05g)溶解在水(4.5ml)中得到的水溶液中，在室温下溶解。在该溶液中，在冰冷下，加入一氯醋酸(1.5g)溶解后，在室温下反应18小时。用醋酸将该反应液的pH调节到8，滴入到90ml的甲醇中后，加入3M氯化钠水溶液(0.15ml)，用离心分离(3500rpm、8分钟)，收集析出的沉淀。用甲醇洗涤该沉淀后，溶解到水(5ml)中，加入3M氯化钠水溶液(0.15ml)。用米利波阿过滤器(0.45μm)过滤该水溶液，将滤液滴入到35ml的乙醇中，收集用离心分离(3500rpm、8分钟)析出的沉淀。用乙醇洗涤该沉淀后，溶解到水中，使用透析膜(スペクトラポア1、切割下的分子量是6,000-8,000)，对于纯水进行透析。用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤透析内液后，冷冻干燥，得到羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(0.18g)。该物质的每个糖残基的羧甲基化度(碱滴定法)是1.2。
例7羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐的合成将由例5得到的精制葡聚糖多元醇(0.2g)，加入到将氢氧化钠(0.84g)溶解在水(6ml)中得到的水溶液中，在室温下溶解。在冰冷下，在该溶液中加入一氯醋酸(1.2g)、溶解后，在室温下反应18小时。用醋酸将该反应液的pH调节成8，滴入到120ml的甲醇中，加入3M氯化钠水溶液(0.2ml)，收集用离心分离(350rpm、8分钟)析出的沉淀。用甲醇洗涤该沉淀后，溶解到5ml的水中，加入3M氯化钠水溶液(0.2ml)。用米利波阿过滤器(0.45μm)过滤该水溶液，将滤液滴入到35ml的乙醇中，用离心分离收集(3500rpm、8分钟)析出的沉淀。用乙醇洗涤该沉淀后，溶解在水中、使用透析膜(スペクトラポア1、临界(cut off)分子量6,000-8,000)，对于纯水进行透析。用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤透析内液后，冷冻干燥，得到羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(0.20g)。该物质的每个糖残基的羧甲基化度(碱滴定法)是0.4。
例8羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A′(A-NH2＝DX-8951)的合成将由例5得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙铵盐(380mg、羧甲基化度0.8)，溶解到N，N-二甲基甲酰胺(30ml)中。在该溶液中，依次加入3′-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)的三氟醋酸盐(49mg)的N，N-二甲基甲酰胺(5ml)溶液、三乙胺(0.017ml)、1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二羟基喹啉(380mg)，在室温下，一边搅拌1夜，一边反应。用1M氢氧化钠水溶液，将反应液的pH调节到10后，每5ml滴入到25ml的乙醇中。在该混合物中，加入3M氯化钠水溶液(1ml)、乙醚(5ml)，用离心分离收集(3500rpm、8分钟)析出的沉淀。
将该沉淀溶解到水中，使用透析膜(スペクトルポア1、临界分子量6,000-8,000)对于纯水进行透析，用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤透析内液后，冷冻干燥，将得到的粗生成物溶解到水(30ml)，用0.1M氢氧化钠水溶液调节pH为9，在37℃下，处理1小时。将该处理液与上述相同地透析后，将得到的透析内液用米利波阿过滤器(0.22μm)进行过滤，冷冻干燥，得到标题化合物289mg。将本化合物溶解到0.1M氯化钠水溶液中后，用GPC(柱东ソ-株式会社制TSK Gel PW-4000XL、溶剂0.1M NaCl、流速0.8ml/min)分析的结果及本化合物的紫外线吸收光谱(0.1M Tris缓冲液、pH 9.0、0.25mg/ml)分别如图1及图2所示。根据0.1M Tris(トリス)缓冲液(pH9.0)中的362nm的吸光度，定量本化合物的医药化合物残基含量是5.3％(W/W)。
例9羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A′(A-NH2＝DX-8951)合成按照与例8相同的方法，将用与例4相同方法从3′-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)(50mg)脱Boc化得到的3′-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A的三氟醋酸盐导入到由例5得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(380mg)，合成标题化合物(300mg)。将本化合物溶解到0.1M氯化钠水溶液中，用GPC(柱东ソ-株式会社制TSK Gel PW-4000 XL、溶剂0.1M NaCl、流速0.8ml/min)分析的结果及本化合物的紫外线吸收光谱(0.1M Tris缓冲液、pH9.0、0.19mg/ml)分别如图3及图4所示。根据0.1M Tris缓冲液(pH9.0)中的362nm的吸光度，定量本化合物的医药化合物残基含量是5.3％(W/W)。
例10羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Gly-Gly-NH-A′(A-NH2＝DX-8951)的合成用与例8相同的方法，将3′-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)(41mg)用与例4相同的方法脱Boc化得到的3′-N-(Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A的三氟醋酸盐，导入到由例5得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(380mg)中，合成标题化合物(190mg)。本化合物的紫外线吸收光谱(0.1M Tris缓冲液、pH9.0、0.34mg/ml)如图5所示。根据在0.1M Tris缓冲液(pH9.0)中的362nm的吸光度定量本化合物的医药化合物残基含量是5.3％(W/W)。
例11本发明的药物复合物的抗肿瘤作用将小鼠纤维肉瘤Meth A细胞1×106个，移植到BALB/c系的雄性小鼠(7周龄)的右鼠趾部皮下，作成感染Meth A癌小鼠(1组7只)。第7天，将溶解在注射用蒸馏水中的例9的药物复合物，每4天，4次给药于感染Meth A癌小鼠的尾静脉中。移植后的第21天，摘出肿瘤，测定重量，用下式
肿瘤增殖抑制率(％)＝[1－(检体给药组的平均肿瘤重量/对照组的平均肿瘤重量)]×100算出肿瘤增殖抑制率。其结果，由例9得到的本发明的药物复合物未发现毒性(体重减少)，与上述医药化合物本身(没有间隔基及多糖衍生物)比较，抗肿瘤效果大幅度地增强。多糖衍生物本身(例5)及仅导入间隔基的医药化合物残基(按照例4的方法，从例1的化合物脱Boc化得到的H2N-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A(A-NH2＝DX-8951)的三氟醋酸盐)是无效的。
表2被测化合物 给药量(mg/kg) 抑制率(％)医药化合物本身7.5×4 761.875×4 460.9375×4 36例9的化合物 1.41)×4 940.71)×4 590.351)×4 411)医药化合物换算量例12本发明的药物复合物的抗肿瘤作用用与例11相同方法，作成感染Meth A癌小鼠(1组6只)、第7天，与例8及例9的药物复合物单次给药时的抗肿瘤作用比较。其结果，抗肿瘤作用的程度是(多糖衍生物)-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A′＞(多糖衍生物)-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A′＞医药化合物本身。不通过间隔基而将医药化合物残基与例5的羧甲基葡聚糖多元醇的羧基直接结合的化合物(医药化合物残基的导入量6.2重量％)是无效的。
表3被测化合物给药量(mg/kg) 抑制率(％)医药化合物本身 60 7720 59例8的化合物 101)8551)76例9的化合物 51)982.51)871)医药化合物换算量例13羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐的合成将葡聚糖T 500(10g、ファルマツア社制、分子量500K)，溶解到0.1M醋酸缓冲液(pH5.5、1000ml)中，加入高碘酸钠(33g)的水溶液(1000ml)。在避光下，在4℃下搅拌10天，加入乙二醇(7.0ml)，搅拌1夜。使用8M氢氧化钠水溶液，将反应液的pH调节成7.5。加入硼氢化钠(14g)溶解后，搅拌1夜。冰冷反应液后，用醋酸调节pH为5.5，在4℃下搅拌1小时后，用8M氢氧化钠水溶液调节pH为7.5，得到溶解1。另外，对于葡聚糖T500(10g、ファルマツア社、分子量500K)，进行上述一系列操作，得到溶液2。进而，对于葡聚糖T250(各10g、ファルマツア社制、分子量250K)，进行上述的一系列操作，得到溶液3和溶液4。将这些溶液1～4混合，通过使用BIOMAX-50膜的超滤法，除去低分子成分，将高分子级分冷冻干燥，得到葡聚糖多元醇(25g)。该物质的分子量(凝胶过滤、プルラン标准)是163K。
将该葡聚糖多元醇(11g)，加入到在水(330ml)中溶解氢氧化钠(46.2g)得到的水溶液中，在室温下溶解。在冰冷下，在该溶液中加入一氯醋酸(66g)，使其溶解后，在室温下，反应1夜。用醋酸将该反应液的pH调节到9后，通过使用BIOMAX-30膜的超滤法脱盐。将未通过膜的残留溶液冷冻干燥，得到羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(13g)。该物质的分子量(凝胶过滤、プルラン标准)是228K、羧甲基化度是0.4。
将该羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(600mg)溶解在水中，放到Bio-Rad AG 50W-X2(200-400目、H+型)柱(直径44mm、长210mm)中，用水洗脱。在该洗脱液中加入三乙胺(0.93ml)后，冷冻干燥，得到标题化合物(690mg)。
例143′-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)三氟醋酸盐的合成将由例1得到的3′-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)(79mg)溶解在三氟醋酸(3ml)中，放置1小时。馏去溶剂，用甲醇(30ml)共沸2次、用乙醇(30ml)共沸2次后，将残渣用乙醚洗涤，得到标题化合物(80mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.53(d，1H，J＝8.3Hz)，8.40-8.48(m，2H)，8.28(d，1H，J＝8.3Hz)，7.95-8.07(br，3H)，7.81(d，1H，J＝10.2Hz)，7.30-7.37(m，2H)，7.15-7.30(m，5H)，6.50-6.55(br，1H)，5.50-5.57(m，1H)，5.41(d，2H，J＝7.82Hz)，5.25(s，2H)，4.55-4.62(m，1H)，3.55-3.92(m，6H)，3.15-3.25(br，2H)，2.98-3.03(m，1H)，2.73-2.82(m，1H)，2.40(s，3H)，2.05-2.25(m，1H)，1.84-1.92(m，2H)，0.88(t，3H，J＝7.35Hz).
例15羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A′(A-NH2＝DX-8951)的合成将由例13得到的羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(400mg)置换成三乙铵盐(470mg)，溶解在N，N-二甲基甲酰胺(30ml)中。在该溶液中，依次加入由例14得到的3′-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)的三氟醋酸盐(62mg)的N，N-二甲基甲酰胺(5ml)溶液、三乙胺(0.02ml)、1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二羟基喹啉(470mg)，避光下在室温下搅拌1夜，一边进行反应。将每5ml的该反应液滴入到各10ml的乙醇中。在其中加入3M氯化钠水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，离心分离收集析出的沉淀。将该沉淀溶解到0.5M氯化钠水溶液中，冰冷下，用0.1M氢氧化钠水溶液将pH调到9后，使用透析膜(スペクトルポア1、临界分子量6000～8000)，对于纯水进行透析。用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤透析内液后，冷冻干燥，得到标题化合物(600mg)。将本化合物溶解到0.1M氯化钠水溶液中，用GPC(柱东ソ-TSK Gel PW-4000XL、溶剂0.1M NaCl、流速0.8ml/min)分析的结果及本化合物的紫外线吸收光谱(0.1M Tris缓冲液、pH9.0、0.01mg/ml)分别如图6及图7所示。根据在0.1M Tris缓冲液(pH9.0)中的362nm的吸光度，定量本化合物的医药化合物残基含量是5.8％(W/W)。
例163′-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)三氟醋酸盐的合成将由例2所得到的3′-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)(79mg)，溶解在三氟醋酸(3ml)中，放置1小时。馏去溶剂，用甲醇(30ml)共沸2次、用乙醇(30ml)共沸2次后，用乙醚洗涤残渣，得到标题化合物(80mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.62-8.66(m，2H)，8.23(d，1H，J＝8.3Hz)，8.18-8.20(m，1H)，7.98-8.10(br，2H)，7.79(d，1H，J＝10.7Hz)，7.32(s，1H)，7.09(d，2H，J＝7.3Hz)，6.93-7.03(m，4H)，6.50-6.60(br，1H)，5.52-5.55(m，1H)，5.44(s，2H)，5.18(d，1H，J＝18.5Hz)，4.80(d，1H，J＝18.5Hz)，4.57-4.59(m，1H)，3.57-3.71(m，6H)，3.15-3.25(m，2H)，3.00-3.02(m，1H)，2.80-2.90(m，1H)，2.50(s，3H)，2.05-2.25(m，1H)，1.86-2.00(m，2H)，0.88(t，3H，J＝7.35Hz).
例17羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A′(A-NH2＝DX-8951)的合成将由例13得到的羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(1.0g)，置换成三乙基铵盐(1.2g)，溶解在N，N-二甲基甲酰胺(90ml)中。在该溶液中，依次加入由例16得到的3′-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)的三氟醋酸盐(158mg)的N，N-二甲基甲酰胺(15ml)溶液、三乙胺(0.05ml)、1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二羟基喹啉(1.2g)，避光、室温下，一边搅拌1夜、一边反应。将每5ml该反应液滴入到各10ml的乙醇中。在其中加入3M氯化钠水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，离心分离收集析出的沉淀。将该沉淀溶解在0.5M氯化钠水溶液中，冰冷下，用0.1M氢氧化钠水溶液调节pH为9后，使用透析膜(スペクトルポア1、临界分子量6000-8000)，对于纯水进行透析。用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤透析内液后，冷冻干燥，得到标题化合物(1.4g)。根据0.1M Tris缓冲液(pH9.0)中的362nm的吸光度，定量本化合物的医药化合物残基含量是5.2％(W/W)。
例18Boc-Gly-Phe-Leu-OH的合成将H-Gly-Phe-Leu-OH(3.0g)，加入到50％的二噁烷水溶液(48ml)中、冰冷。在该溶液中加入含有1N氢氧化钠水溶液(9.45ml)和(Boc)2O(2.27g)的二噁烷(24ml)溶液，搅拌1夜。在反应液中加入1N盐酸(9.45ml)，馏去溶剂。用硅胶柱色谱(洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝5∶1溶液)精制得到的残渣，得到标题化合物(2.5g)。
例19Boc-Gly-Phe-Leu-Gly-OBzl的合成将由例18得到的Boc-Gly-Phe-Leu-OH(2.4g)及N-羟基丁二酰亚胺(656mg)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(50ml)中，冷却到4℃后，加入N，N′-二环己基碳化二亚胺(1.17g)，搅拌2小时。在该溶液中加入溶解了H-Gly-OBzl的甲苯磺酸盐(1.9g)和三乙胺(0.79ml)的N，N-二甲基甲酰胺(40ml)溶液，在室温下一边搅拌16小时；一边反应。将该反应液减压干固，用硅胶柱色谱(洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝50∶1溶液)精制残渣，得到标题化合物(2.0g)。1H-NMR(DNSO-d6)δ8.20-8.30(m，1H)，8.12(d，1H，J＝8.3Hz)，7.83(d，1H，J＝8.3Hz)，7.32-7.37(m，5H)，6.89-6.95(m，1H)，5.12(s，1H)，4.52-4.59(br，1H)，4.34(dd，1H，J＝7.3Hz，J＝15.1Hz)，3.93(dd，1H，J＝5.5Hz，J＝17.2Hz)，3.84(dd，1H，J＝5.5Hz，J＝17.2Hz)，3.54(dd，1H，J＝5.9Hz，J＝16.7Hz)，3.42(dd，J＝5.9Hz，J＝16.7Hz)，3.00(dd，1H，J＝4.4Hz，13.7Hz)，2.78(dd，1H，J＝8.8Hz，J＝13.2Hz)，1.50-1.65(m，1H)，1.45(t，2H，J＝7.3Hz)，1.36(s，9H)，0.86(d，3H，J＝6.4Hz)，0.82(d，3H，J＝6.4Hz).
例20Boc-Gly-Phe-Leu-Gly-OH的合成将由例19得到的Boc-Gly-Phe-Leu-OBzl(1.7g)溶解到醋酸乙酯(30ml)和甲醇(30ml)的混合溶液中后，加入5％Pd-C(1.5g)，进行接触还原。过滤反应液，减压干固滤液，得到标题化合物(1.15g)。
例213′-N-(Boc-Gly-Phe-Leu-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)的合成将由例20得到的Boc-Gly-Phe-Leu-Gly-OH(200mg)及N-羟基丁二酰亚胺(58mg)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(5ml)中，冷却到4℃后，加入N，N′-二环己基碳化二亚胺(104mg)、溶解。在该溶液中加入溶解了DX-8951的甲磺酸盐(224mg)和三乙胺(0.059ml)的N，N-二甲基甲酰胺(5ml)溶液，在避光、室温下，一边搅拌16小时；一边反应。将该反应液减压干固，用硅胶柱色谱(洗脱液含有0.5％醋酸的二氯甲烷∶甲醇＝10∶1溶液)精制残渣，得到标题化合物(200mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.35(d，1H，J＝7.8Hz)，8.08-8.18(m，2H)，7.75-7.85(m，2H)，7.32(s，1H)，7.10(d，2H，J＝6.8Hz)，7.08-7.13(m，3H)，6.85-6.95(br，1H)，6.40-6.65(br，1H)，5.52-5.55(m，1H)，5.46(d，1H，J＝18.5Hz)，5.37(d，1H，J＝18.5Hz)，5.24(s，2H)，4.44-4.52(m，1H)，4.15-4.25(m，1H)，3.68-3.72 (m，2H)，3.40-3.52(m，2H)，3.15-3.25(br，2H)，2.85-2.95(m，1H)，2.65-2.75(m，1H)，2.40(s，3H)，2.05-2.25(m，1H)，1.80-1.91(m，2H)，1.50-1.65(m，1H)，1.45(t，2H，J＝7.3Hz)，1.35(s，9H)，0.88(t，3H，J＝7.4)，0.86(d，3H，J＝6.4Hz)，0.82(d，3H，J＝6.4Hz).
例223′-N-(Gly-Phe-Leu-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)三氟醋酸盐的合成将由例21得到的3′-N-(Boc-Gly-Phe-Leu-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)(97mg)溶解在三氟醋酸(3ml)中，放置1小时。馏去溶剂，用甲醇(30ml)共沸2次、用乙醇(30ml)共沸2次后，用乙醚洗涤残渣，得到标题化合物(95mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.57(d，1H，J＝8.3Hz)，8.47(d，1H，J＝8.3Hz)，8.32(d，1H，J＝7.8Hz)，8.17(t，1H，J＝5.5Hz)，7.81-7.91(br，3H)，7.79(d，1H，J＝10.7Hz)，7.32(s，1H)，7.21-7.23(m，5H)，7.12-7.17(m，1H)，6.45-6.55(br，1H)，5.57(q，1H，J＝4.4Hz)，5.43(d，1H，J＝16.1Hz)，5.34(d，1H，J＝16.1Hz)，5.23(s，2H)，4.67(dt，1H，J＝4.0Hz，J＝9.0Hz)，4.31(dd，1H，J＝8.5Hz，J＝15.0Hz)，4.0-4.4(br，1H)，3.74-3.76(m，2H)，3.56(dd，1H，J＝6.0Hz，J＝16.0Hz)，3.41(dd，1H，J＝6.0Hz，J＝16.0Hz)，3.17-3.19(br，2H)，3.02(dd，1H，J＝4.0Hz，J＝14.0Hz)，2.70(dd，1H，J＝10.0Hz，J＝14.0Hz)，2.40(s，3H)，2.05-2.15(m，1H)，1.85(dt，2H，J＝7.0Hz，J＝14.0Hz)，1.50-1.55(m，1H)，1.45(t，2H，J＝6.0Hz)，1.35(s，9H)，0.88(t，3H，J＝7.4)，0.85(d，3H，J＝6.4Hz)，0.80(d，3H，J＝6.4Hz).
例23羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Phe-Leu-Gly-NH-A′(A-NH2＝DX-8951)的合成将由例13得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(690mg)，溶解到N，N-二甲基甲酰胺(50ml)中。在该溶液中，依次加入由例22得到的3′-N-(Gly-Phe-Leu-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)的三氟醋酸盐(95mg)的N，N-二甲基甲酰胺(10ml)溶液、三乙胺(0.03ml)、1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二羟基喹啉(690mg)，在室温下一边搅拌1夜；一边反应。将每5ml该反应液滴入到各10ml的乙醇中。在其中，加入3M氯化钠水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，离心分离收集析出的沉淀。将该沉淀溶解在0.5M食盐水中，冰冷下用0.1M氢氧化钠水溶液调节pH为9后，使用透析膜(スペクトルポア1、临界分子量6000-8000)，对于纯水进行透析。用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤透析内液后，冷冻干燥滤液，得到标题化合物(600mg)。根据0.1M Tris缓冲液(pH9.0)中的362nm的吸光度，定量本化合物的医药化合物残基含量是4.8％(W/W)。
例24羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐的合成将葡聚糖T 500(50g、ファルマツア社制、分子量500K)，溶解到0.1M醋酸缓冲液(pH5.5、5000ml)中，加入高碘酸钠(165.0g)的水溶液(5000ml)。一边避光；一边在4℃下搅拌10天后，加入乙二醇(35.0ml)，搅拌1夜。使用8M氢氧化钠水溶液，将反应液的pH调到7.5后，加入硼氢化钠(70g)、溶解后，搅拌1夜。冰冷反应液，用醋酸将反应液的pH调到5.5，在4℃下搅拌1小时后，使用8M氢氧化钠水溶液，将pH调到7.5。从得到的水溶液，通过使用BIOMAX-50膜用超滤法除去低分子成分。将高分子成分冷冻干燥，得到葡聚糖多元醇(27.1g)。该物质的分子量(凝胶过滤、プルラン标准)是140K。
将该葡聚糖多元醇(5g)，加入到将氢氧化钠(21g)溶于水(150ml)得到的水溶液中，在室温下溶解。在冰冷下，在该溶液中加入一氯醋酸(30g)、溶解后，在室温下，反应1夜。用醋酸将该反应液的pH调节到8后，通过使用BIOMAX-50膜用超滤法脱盐。将未通过膜的残留溶液冷冻干燥，得到羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(5.6g)。该物质的分子量(凝胶过滤、プルラン标准)是263K、羧甲基化度是0.4。
将该羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(2.0g)溶解在水中，装入到Bio-Rad AG 50W-X2(200-400目、H+型)柱(直径44mm、长210mm)，用水洗脱。在该洗脱液中加入三乙胺(4ml)后，冷冻干燥，得到标题化合物(2.2g)。
例25羧甲基葡聚糖多元醇的三甲基铵盐的合成将由例24得到的羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(1.0g)溶解在水中，装入到Bio-Rad AG 50W-X2(200-400目、Me3NH+型)柱中，用水洗脱。将该洗脱液冷冻干燥，得到标题化合物(950mg)。
例263′-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)盐酸盐的合成将用与例4相同方法从3′-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)(400mg)得到的3′-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A三氟醋酸盐溶解在水-MeOH(1∶4)中，装入到Bio-Rad AG 1-X8(200-400目、Cl-型)柱(1.5cm×8.6cm)中，用上述溶剂洗脱。将该洗脱液浓缩后，冷冻干燥，得到标题化合物(310mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.53(d，1H，J＝8.5Hz)，8.46-8.48(m，1H)，8.37-8.39(m，1H)，7.95(d，1H，J＝8.0Hz)，7.80(s，3H)，7.78(d，1H，J＝11.1Hz)，7.34(s，1H)，7.14-7.24(m，5H)，6.50(s，1H)，5.56-5.60(m，1H)，5.35-5.40(m，2H)，5.24(s，2H)，4.51-4.56(m，1H)，3.86(dd，J＝4.8，13.5Hz，1H)，3.68-3.79(m，3H)，3.54(s，2H)，3.15-3.22(m，2H)，3.01(dd，J＝5.6，13.5Hz，1H)，2.78(dd，J＝9.6，3.5Hz，1H)，2.41(s，3H)，2.12-2.23(m，2H)，1.81-1.89(m，2H)，0.88(t，3H，J＝7.2Hz).Mass(FAB)；m/e 753(M＋1)
例27羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A′(A-NH2＝DX-8951)的合成将由例25得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三甲基铵盐(0.1g)溶解到N，N-二甲基甲酰胺(6ml)中。在该溶液中，依次加入由例26得到的3′-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)NH-A(A-NH2＝DX-8951)的盐酸盐(24mg)的N，N-二甲基甲酰胺(10ml)溶液、三乙胺(5μl)、1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二羟基喹啉(0.1g)，在室温下一边搅拌1夜；一边反应。将每5ml的该反应液滴入到各10ml的乙醇中。在其中加入3M氯化钠水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，离心分离收集(3500rpm、8分钟)析出的沉淀。将该沉淀溶解到0.5M食盐中，冰冷下用0.1M氢氧化钠水溶液调节pH为9。将得到的水溶液，通过使用BIOMAX-30膜用超滤法脱盐。用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤未通过膜的残留溶液后，冷冻干燥，得到标题化合物(90mg)。根据在0.1M Tris缓冲液(pH9.0)中的362nm的吸光度，定量本化合物的医药化合物残基含量是11％(W/W)。
例28羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A′(A-NH2＝DX-8951)的合成将由例25得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三甲基铵盐(0.1g)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(6ml)中。在该溶液中依次加入由例26得到的3′-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)的盐酸盐(36mg)的N，N-二甲基甲酰胺(10ml)溶液、三乙胺(8μl)、1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二羟基喹啉(0.1g)，在室温下，一边搅拌1夜；一边反应。将每5ml的该反应液滴入到各10ml的乙醇中。在其中加入3M氯化钠水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，离心分离收集(3500rpm、8分钟)析出的沉淀。将该沉淀溶解到0.5M食盐水中，在冰冷下用0.1M氢氧化钠水溶液调节pH为12。通过使用BIOMAX-30膜用超滤法，将得到的水溶液脱盐。用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤未通过膜的残留溶液后，冷冻干燥，得到标题化合物(80mg)。将本化合物溶解到0.1M氯化钠水溶液中，用GPC(柱东ソ-TSK Gel PW-4000XL、溶剂0.1M NaCl、流速0.8ml/min)分析的结果及本化合物的紫外线吸收光谱(0.1M Tris缓冲液、pH9.0、36μg/ml)分别如图8及图9所示。根据在0.1M Tris缓冲液(pH9.0)中的362nm的吸光度，定量本化合物的医药化合物残基含量是15％(W/W)。
例29羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A′(A-NH2＝DX-8951)的合成将葡聚糖T 250(20g、EXTRASYNTHESE制、平均分子量250K)溶解在0.1M醋酸缓冲液(pH5.5、2000ml)中，加入高碘酸钠(66.0g)的水溶液(2000ml)。避光下，在4℃下搅拌10天后，加入乙二醇(14.0ml)，搅拌1夜。在冰冷下使用8M氢氧化钠水溶液，将反应液的pH调节成7.5。加入硼氢化钠(28g)、溶解后，在室温下搅拌1夜。冰冷反应液，用醋酸调节反应液的pH为5.5，在4℃下搅拌1小时，在冰冷下使用8M氢氧化钠水溶液，调pH为7.5。通过使用BIOMAX-30膜用超滤法，从得到的水溶液中除去低分子成分，得到未通过膜的残留溶液1。另外，将葡聚糖T 250(50g、EXTRASYNTHESE制、平均分子量250K)溶解到0.1M醋酸缓冲液(pH5.5、5000ml)中，加入高碘酸钠(165g)的水溶液(5000ml)。一边避光；一边在4℃下搅拌10天后，加入乙二醇(35.0ml)，搅拌1夜。在冰冷下使用8M氢氧化钠水溶液调节反应液的pH为7.5。加入硼氢化钠(70g)溶解后，在室温下搅拌1夜。在冰冷下，用醋酸将反应液的pH调节成5.5，在4℃下搅拌1小时后，冰冷下使用8M氢氧化钠水溶液调节pH为7.5。通过使用BIOMAX-30膜用超滤法，从得到的水溶液中除去低分子成分，得到未通过膜的残留溶液2。将残留溶液1和残留溶液2混合，使用BIOMAX-30膜，用超滤法将通过BIOMAX-50膜的成分中除去低分子成分、冷冻干燥，得到葡聚糖多元醇(25.7g)。该物质的分子量(凝胶过滤、プルラン标准)是47K。
将该葡聚糖多元醇(5g)加入到将氢氧化钠(35g)溶于水(150ml)得到的水溶液中，在室温下溶解。在冰冷下，在该溶液中加入一氯醋酸(50g)、溶解后，在室温下反应18小时。用醋酸将该反应液的pH调到8后，通过使用BIOMAX-50膜用超滤法脱盐。冷冻干燥未通过膜的残留溶液，得到羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(7.2g)。该物质的分子量(凝胶过滤、プルラン标准)是127K、羧甲基化度是0.8。将该羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(2.2g)溶解在水中，装入到Bio-RadAG 50W-X2(200-400目、H+型)柱(直径44mm、长210mm)中，用水洗脱。在该洗脱液中加入三乙胺(4ml)，冷冻干燥，得到羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(2.69g)。
将该羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(2.67g)溶解到N，N-二甲基甲酰胺(200ml)中。在该溶液中依次加入将从与例2相同地合成的3′-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)(350mg)与例16相同方法脱Boc化，得到的3′-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A的三氟醋酸盐和三乙胺(0.116ml)溶解到N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中形成的溶液、将1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二羟基喹啉(2.67g)溶解到N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中得到的溶液，在室温下，一边搅拌1夜；一边反应。在该反应液中加入3M氯化钠水溶液(100ml)，将该反应液每8ml滴入到各30ml的乙醇中。分别加入3M氯化钠水溶液(1ml)、乙醚(5ml)，离心分离收集(3500rpm、8分钟)析出的沉淀。用丙酮洗涤该沉淀，溶解在水中，加入3M氯化钠水溶液(10ml)后，用0.1M氢氧化钠水溶液调节pH为9，在37℃下处理1小时。通过使用BIOMAX-10膜用超滤法，将该处理液脱盐。用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤未通过膜的残留溶液后，冷冻干燥，得到标题化合物(2.30g)。将本化合物溶解到0.1M氯化钠水溶液中，用GPC(柱东ソ-TSK Gel PW-4000XL、溶剂0.1M NaCl、流速0.8ml/min)分析的结果及本化合物的紫外线吸收光谱(0.1M Tris缓冲液、pH9.0、0.20mg/ml)分别如图10及图11所示。根据0.1M Tris缓冲液(pH9.0)中的362nm的吸光度，定量本化合物的医药化合物残基含量是5.8％(W/W)。
例30羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐的合成在葡聚糖T10(20g、ファルマツア社制、平均分子量10K)的0.1M醋酸缓冲液(pH5.5)溶液(2000ml)中，加入高碘酸钠(66.0g)的水溶液(2000ml)。一边避光；一边在4℃下搅拌10天后，加入乙二醇(14.0ml)，搅拌1夜。在冰冷下，使用8M氢氧化钠水溶液，将反应液的pH调到7.5。加入硼氢化钠(28g)、溶解后，在室温下搅拌1夜。冰冷反应液，用醋酸调节pH为5.5、在4℃下搅拌1小时后，冰冷下用8M氢氧化钠水溶液调节pH为7.5。通过使用BIOMAX-5膜(ミリポア社制)用超滤法，从得到的水溶液中除去低分子成分，将未通过膜的残留溶液通过BIOMAX-30膜。将得到的通过液冷冻干燥，得到葡聚糖多元醇(8.0g)。该物质的分子量(凝胶过滤、プルラン标准)是13K。
将该葡聚糖多元醇(3.7g)加入到将氢氧化钠(25.9g)溶于水(111ml)中得到的水溶液中，在室温下溶解。在冰冷下，在该溶液中加入一氯醋酸(37g)、溶解后，在室温下反应20小时。用醋酸将该反应液的pH调节到8后，通过使用BIOMAX-5膜用超滤法脱盐。将未通过膜的残留溶液冷冻干燥，得到羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(6.2g)。该物质的分子量(凝胶过滤、プルラン标准)是37K、羧甲基化度是0.9。
将该羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(6.0g)溶解在水中，装入到Bio-Rad AG 50W-X2(200-400目、H+型)柱中，用水洗脱。在该洗脱液中加入三乙胺(9.3ml)后，冷冻干燥，得到标题化合物(7.2g)。
例31羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐的合成将由例30得到的葡聚糖多元醇(3.9g)加入到将氢氧化钠(16.3g)溶解到水(117ml)得到的水溶液中，在室温下溶解。在冰冷下，在该溶液中加入一氯醋酸(23.4g)、溶解后，在室温下反应18小时。用醋酸将该反应液的pH调节成8后，通过使用BIOMAX-5膜用超滤法脱盐。将未通过膜的残留液冷冻干燥，得到羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(5.0g)。该物质的分子量(凝胶过滤、プルラン标准)是28K，羧甲基化度是0.5、将该羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(4.8g)与例30相同地变成三乙基铵盐，得到标题化合物(5.6g)。
例32羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐的合成在葡聚糖4(20g、フナコシ社制、平均分子量4K-6K)的0.1M醋酸缓冲液(pH5.5)溶液(2000ml)中，加入高碘酸钠(66.0g)的水溶液(2000ml)中。一边避光；一边在4℃下搅拌10天后，加入乙二醇(14.0ml)，搅拌1夜。在冰冷下，用8M氢氧化钠水溶液，将反应液的pH调节到7.5。加入硼氢化钠(28g)、溶解后，在室温下搅拌1夜。冰冷反应液，用醋酸调节pH为5.5、在4℃下搅拌1小时后、冰冷下使用8M氢氧化钠水溶液，调节pH到7.5。通过使用BIOMAX-3膜(ミリポア社制)用超滤法从得到的水溶液中除去低分子成分。将得到的通过液冷冻干燥，得到葡聚糖多元醇(6.0g)。该物质的分子量(凝胶过滤、プルラン标准)是9K。将该葡聚糖多元醇(2.7g)，加入到将氢氧化钠(18.9g)溶解到水(81ml)得到的水溶液中，在室温下洗脱。在冰冷下，在该溶液中加入一氯醋酸(27g)、溶解后，在室温下反应20小时。用醋酸将该反应液的pH调节成8后，使用BIOMAX-5膜用超滤法脱盐。将未通过膜的残留溶液冷冻干燥，得到羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(4.2g)。该物质的分子量(凝胶过滤、プルラン标准)是20K、羧甲基化度是0.9。
将该羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(4.0g)，与例30相同地变成三乙基铵盐，得到标题化合物(4.8g)。
例33羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐的合成将由例32得到的葡聚糖多元醇(2.7g)，加入到将氢氧化钠(11.3g)溶在水(81ml)得到的水溶液中，在室温下溶解。在冰冷下，在该溶液中加入一氯醋酸(16.2g)、溶解后，在室温下反应18小时。用醋酸将该反应液的pH调到8后，使用BIOMAX-5膜用超滤法脱盐。将未通过膜的残留溶液冷冻干燥，得到羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(2.7g)。该物质的分子量(凝胶过滤、プルラン标准)是16K、羧甲基化度是0.5。将该羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(2.7g)与例30相同地置换成三乙基铵盐，得到标题化合物(3.1g)。
例34羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A′(A-NH2＝DX-8951)的合成将由例30得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(1.5g)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(90ml)中。在该溶液中依次加入三乙胺(0.07ml)和3′-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)的三氟醋酸盐(210mg)的N，N-二甲基甲酰胺(40ml)溶液、1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二羟基喹啉(1.5g)，在室温下，一边搅拌1夜；一边反应。将每5ml的该反应液滴入到各10ml的乙醇中。分别加入3M氯化钠水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，离心分离收集(3500rpm、8分钟)析出的沉淀。将该沉淀溶解到0.5M食盐水中，冰冷下用0.1M氢氧化钠水溶液调节pH为9。通过使用BIOMAX-3膜用超滤法，将得到的水溶液脱盐。用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤未通过膜的残留溶液后，冷冻干燥，得到标题化合物(1.3g)。将本化合物溶解在0.1M氯化钠水溶液后，用GPC(柱东ソ-TSK Gel PW-4000XL、溶剂0.1M NaCl、流速0.8ml/min)分析的结果及本化合物的紫外线吸收光谱(0.1M Tris缓冲液、pH9.0、65μg/ml)分别如图12及图13所示。根据0.1M Tris缓冲液(pH9.0)中的362nm的吸光度，定量本化合物的医药化合物残基含量是6.4％(W/W)。
例35羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A′(A-NH2＝DX-8951)的合成将由例31得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(1.2g)，溶解在N，N-二甲基甲酰胺(90ml)中。在该溶液中依次加入三乙胺(0.056ml)和3′-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)的三氟醋酸盐(168mg)的N，N-二甲基甲酰胺(30ml)溶液、1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二羟基喹啉(1.2g)，在室温下一边搅拌1夜；一边反应。将每5ml的该反应液滴入到各10ml的乙醇中。分别地加入3M氯化钠水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，离心分离收集(3500rpm、8分钟)析出的沉淀。将该沉淀溶解在0.5M食盐水中、冰冷下用0.1M氢氧化钠水溶液调节pH为9。通过使用BIOMAX-3膜用超滤法将得到的水溶液脱盐。用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤未通过膜的残留溶液，冷冻干燥，得到标题化合物(1.0g)。根据0.1M Tris缓冲液(pH9.0)中的362nm的吸光度，定量本化合物的医药化合物残基含量是4.8％(W/W)。
例36羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A′(A-NH2＝DX-8951)的合成将由例32得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(1.2g)，溶解在N，N-二甲基甲酰胺(90ml)中。在该溶液中依次加入三乙胺(0.056ml)和3′-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)的三氟醋酸盐(168mg)的N，N-二甲基甲酰胺(30ml)溶液、1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二羟基喹啉(1.2g)，在室温下，一边搅拌1夜；一边反应。将每5ml的该反应液滴入到各10ml的乙醇中。分别加入3M氯化钠水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，离心分离收集(3500rpm、8分钟)析出的沉淀。将该沉淀溶解在0.5M食盐水中，冰冷下用0.1M氢氧化钠水溶液调节pH为9。通过使用BIOMAX-3膜用超滤法将得到的水溶液脱盐。用米利波阿(0.22μm)过滤未通过膜的残留溶液后，冷冻干燥、得到标题化合物(1.0g)。根据0.1M Tris缓冲液(pH9.0)中的362nm的吸光度，定量本化合物的医药化合物残基含量是5.9％(W/W)。
例37羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A′(A-NH2＝DX-8951)的合成将由例33得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(1.5g)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(90ml)中。在该溶液中依次加入三乙胺(0.07ml)、3′-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)的三氟醋酸盐(210mg)的N，N-二甲基甲酰胺(40ml)溶液、1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二羟基喹啉(1.5g)，在室温下一边搅拌1夜；一边反应。将每5ml的该反应液滴入到各10ml的乙醇中。分别加入3M氯化钠水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，离心分离收集(3500rpm、8分钟)析出的沉淀。将该沉淀溶解到0.5M食盐水中，冰冷下用0.1M氢氧化钠水溶液调节pH为9。通过使用BIOMAX-3膜用超滤法，将得到的水溶液脱盐。用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤未通过膜的残留溶液后，冷冻干燥，得到标题化合物(1.3g)。根据0.1M Tris缓冲液(pH9.0)中的362nm的吸光度定量本化合物的医药化合物残基含量是4.6％(W/W)。
例38Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A(A-NH2＝DW-8286)的合成将Boc-Gly-Gly-Phe-Gly(42mg)及N-羟基丁二酰亚胺(12mg)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(2ml)中，在4℃下冷却后，加入N，N′-二环己基碳化二亚胺(22mg)。在该溶液中加入溶解了用下式
表示的化合物[(1S，9S)-1-氨基-5-氯-9-乙基-2，3-二氢-9-羟基-1H，12H-苯并[de]吡喃并(3′，4′6，7)中氮茚并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮DW-8286]的盐酸盐(50mg)和三乙胺(0.01ml)的N，N-二甲基甲酰胺(6ml)溶液，在室温，一边避光搅拌16小时；一边反应。将该反应液减压干固，用硅胶柱色谱(洗脱液含有0.5％醋酸的二氯甲烷∶甲醇＝10∶1溶液)精制残渣，得到标题化合物(27mg)。1H-NMR(CDCl3)δ8.10-8.20(br，1H)，7.95-8.05(br，1H)，7.70-7.80(br，2H)，7.50-7.60(br，1H)，7.40-7.50(br，1H)，7.10-7.25(m，5H)，7.05-7.15(br，1H)，5.85-5.95(br，1H)，5.50-5.60(br，1H)，5.40-5.50(m，1H)，5.25-5.35(m，1H)，5.05-5.15(m，1H)，4.90-5.00(m，1H)，4.70-4.80(br，1H)，4.10-4.25(br，2H)，3.60-3.90(m，4H)，3.10-3.40(m，3H)，2.95-3.05(br，1H)，2.15-2.30(br，1H)，1.75-1.90(br，2H)，1.39(s，9H)，0.80-1.00(m，3H).
例39羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A′(A-NH2＝DW-8286)的合成将由例24得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(175mg)，溶解在N，N-二甲基甲酰胺(20ml)中。在该溶液中，依次加入用与例4相同方法从由例38得到的3′- N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2＝DW-8286)(27mg)脱Boc化得到的3′-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A的三氟醋酸盐(29mg)和三乙胺(9μl)的N，N-二甲基甲酰胺(5ml)溶液、1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二羟基喹啉(175mg)、在室温下，一边搅拌1夜；一边反应。将每5ml的该反应液滴入到各10ml的乙醇中。在其中加入3M氯化钠水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，离心分离收集(3500rpm、8分钟)析出的沉淀。将该沉淀溶解在0.5M食盐水中，冰冷下，用0.1M氢氧化钠溶液调节pH为9。通过使用BIOMAX-30膜用超滤法，将得到的水溶液脱盐。用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤未通过膜的残留溶液后，冷冻干燥，得到标题化合物(135mg)。将本化合物溶解到0.1M氯化钠水溶液中后，用GPC(柱东ソ-TSK Gel PW-4000XL、溶剂0.1M NaCl、流速0.8ml/min)分析的结果及本化合物的紫外线吸收光谱(0.1M Tris缓冲液、pH9.0、99μg/ml)分别如图14及图15所示。根据0.1M Tris缓冲液(pH9.0)中的362nm的吸光度定量，本化合物的医药化合物残基含量是6.1％(W/W)。
例403′-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2＝DW-8089)的合成将Boc-Gly-Gly-Phe-Gly(163mg)及N-羟基丁二酰亚胺(45mg)溶解到N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中，冷却到4℃后，加入N，N′-二环己基碳化二亚胺(79mg)。在该溶液中加入溶解了用下式
表示的化合物[(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-2，3-二氢-9-羟基-1H，12H-苯并[de]吡喃并(3′，4′6，7)中氮茚并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮DW-8089]的甲苯磺酸盐(170mg)和三乙胺(0.054ml)的N，N-二甲基甲酰胺(30ml)溶液，在避光、室温下，一边搅拌1夜；一边反应。将该反应液减压干固，用硅胶柱色谱(洗脱液含有0.5％醋酸的二氯甲烷∶甲醇＝94∶6溶液)精制残渣，得到标题化合物(100mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.51(d，1H，J＝8.5Hz)，8.41(t，1H，J＝5.6Hz)，8.29(s，1H)，8.17(d，1H，J＝8.0Hz)，8.03(d，1H，J＝8.0Hz)，7.90(dd，1H，J＝4.8，5.6Hz)，7.79(t，1H，J＝5.6Hz)，7.53(d，1H，J＝7.2Hz)，7.36(s，1H)，7.13-7.25(m，5H)，6.94-6.95(m，1H)，5.60-5.63(m，1H)，5.36-5.47(m，2H)，5.21-5.30(m，2H)，4.42-4.47(m，1H)，3.63-3.96(m，3H)，3.51-3.59(m，3H)，3.31-3.40(m，1H)，3.09-3.21(m，1H)，3.02(dd，1H，J＝4.8，13.5Hz)，2.76-2.81(m，1H)，2.13-2.17(m，2H)，1.85-1.90(m，2H)，1.37(s，9H)，0.89(t，3H，J＝8.0Hz)。Mass(FAB)；m/e 822(M＋1)
例41羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A′(A-NH2＝DW-8089)的合成将由例24得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(1.6g)溶解到N，N-二甲基甲酰胺(60ml)中。在该溶液中，依次溶解将从例40得到的3′-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2＝DW-8089)(200mg)用与例4相同方法脱Boc化得到的3′-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A的三氟醋酸盐和三乙胺(0.07ml)溶于N，N-二甲基甲酰胺(20ml)得到的溶液、1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二羟基喹啉(1.6g)，在室温下，一边搅拌1夜；一边反应。将每5ml的该反应液滴入到各10ml的乙醇中。分别加入3M氯化钠水溶液(2.5ml)、乙醚(25ml)，离心分离收集(2500rpm、8分钟)析出的沉淀。用乙醇洗涤该沉淀后，溶解在水中，加入3M氯化钠水溶液(20ml)，用0.1M氢氧化钠水溶液调节pH为9。通过使用BIOMAX-10膜用超滤法，将该溶液脱盐。用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤未通过膜的残留溶液后，冷冻干燥，得到标题化合物(1.20g)。将本化合物溶解到0.1M氯化钠水溶液中，用GPC(柱东ソ-TSK Gel PW-4000XL、溶剂0.1M NaCl、流速0.8ml/min)分析的结果及本化合物的紫外线吸收光谱(0.1M Tris缓冲液、pH9.0，0.26mg/ml)分别如图16及图17所示。根据0.1M Tris缓冲液(pH9.0)中的362nm的吸光度，定量本化合物的医药化合物残基含量是5.0％(W/W)。
例42Trt-Gly-Gly-Phe-Gly-OH的合成将Trt-Gly-Gly-Phe-Gly-OBzl(670mg)、10％Pd-C(100mg)及甲酸铵(200mg)加入到DMF(5ml)中，搅拌3小时。过滤反应液，将滤液减压干固，用硅胶柱色谱(洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝8∶1溶液)精制残渣，得到标题化合物(300mg)。1H-NMR(CD3OD)δ7.1 6-7.45(m，20H)，4.66(dd，1H，J＝9.8，5.4Hz)，3.93(d，1H，J＝16.6Hz)，3.80(d，1H，J＝17.6Hz)，3.78(d，1H，J＝16.6Hz)，3.68(d，1H，J＝17.1Hz)，3.23(dd，1H，J＝14.2，5.4Hz)，2.90(d，1H，J＝13.7Hz)，2.90(s，1H).
例433′-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR盐酸盐的合成。
将Trt-Gly-Gly-Phe-Gly-OH(100mg)及N-羟基丁二酰亚胺(22mg)溶在DMF(4ml)中，冰冷下，加入N，N′-二环己基碳化二亚胺(40mg)，在4℃下搅拌2小时。在该溶液中加入溶解了N-甲基吗啉(0.019ml)和阿霉素(DXR)盐酸盐(92mg)的DMF(20ml)溶液，在4℃下搅拌16小时。将该反应液减压干固，用硅胶柱色谱(洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝20∶1溶液)精制残渣。将得到的化合物溶解在75％醋酸1ml中，搅拌1小时。加入水(20ml)，过滤析出的固体并除去，将滤液冷冻干燥，将得到的粉末溶于水(5ml)中。将该溶液通过AG-1X8(Cl-型)柱，用水洗脱后，用二氯甲烷洗涤，将水层冷冻干燥，得到标题化合物(40mg)。1H-NMR(CD3OD)δ7.95(d，1H，J＝7.3Hz)，7.82(t，1H，J＝7.8Hz)，7.54(d，1H，J＝8.3Hz)，7.16-7.26(m，5H)，5.43(d，1H，J＝3.4Hz)，5.14(br，1H)，4.72(s，2H)，4.42(dd，1H，J＝8.3，6.8Hz)，4.30(q，1H，J＝6.8Hz)，4.14-4.18(m，1H)，4.03(d，1H，J＝16.6Hz)，4.02(s，3H)，3.86(d，1H，J＝18.5Hz)，3.83(d，1H，J＝17.1Hz)，3.75(d，1H，J＝16.1Hz)，3.73(d，1H，J＝16.1Hz)，3.62(br，1H)，3.58(d，1H，J＝16.6Hz)，3.10-3.15(m，2H)，3.00(d，1H，J＝18.6Hz)，2.94(dd，1H，J＝14.2，8.8Hz)，2.38(d，1H，J＝14.2Hz)，2.18(dd，1H，J＝14.2，4.4Hz)，1.94-2.00(m，1H)，1.71(dd，1H，J＝12.7，4.4Hz)，1.28(d，3H，J＝6.3Hz).
例44羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-DXR的合成将例24得到的羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(1.5g)，用与例25相同方法变换成三乙基铵盐(1.2g)后，将该化合物的400mg溶解在N，N-二甲基甲酰胺(24ml)中。在该溶液中依次加入3′-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR的盐酸盐(76mg)的N，N-二甲基甲酰胺(24ml)溶液、三乙胺(24μl)、1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二羟基喹啉(400mg)，在室温下一边搅拌1夜；一边反应。将每5ml的反应液滴入到各10ml的乙醇中。在其中加入3M氯化钠水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，离心分离收集(3500rpm、8分钟)析出的沉淀。将该沉淀溶解0.5M食盐水中，通过使用BIOMAX-30膜用超滤法脱盐。用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤未通过膜的残留溶液后，冷冻干燥，得到标题化合物(40mg)。将本化合溶解到0.1M氯化钠水溶液中，用GPC(柱东ソ-TSK Gel PW-4000XL、溶剂0.1M NaCl、流速0.8ml/min)分析的结果及本化合物的紫外线吸收光谱(0.01MTris缓冲液、pH7.4、36μg/ml)分别如图18及图19所示。根据在PBS(pH7.4)中的480nm的吸光度定量，本化合物的医药化合物残基含量是6.0％(W/W)。
例45羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐的合成将葡聚糖T150(20g、ファルマツア社制、平均分子量150K)溶解在0.1M醋酸缓冲液(pH5.5、2000ml)中，加入高碘酸钠(66.0g)的水溶液(2000ml)中。一边避光；一边在4℃下搅拌10天后，加入乙二醇(14.0ml)，搅拌1夜。在冰冷下使用8M氢氧化钠水溶液，将反应液的pH调为7.5。加入硼氢化钠(28g)、溶解后，在室温下搅拌1夜。冰冷反应液，用醋酸调节pH为5.5，在4℃下搅拌1小时。在冰冷下，用8M氢氧化钠水溶液调节pH为7.5。通过使用BIOMAX-5膜(ミリポア社制)用超滤法，将得到的水溶液浓缩到500ml，得到溶液1。对于葡聚糖T110(20g)，进行一系列的上述操作，得到溶液2。将溶液1和溶液2混合，将混合溶液的pH调为3.0，在40℃下恒温4小时后，将pH调为7，得到含有低分子化的葡聚糖多元醇的溶液。使之通过BIOMAX-30膜，再使用BIOMAX-5膜脱盐后冷冻干燥，得到葡聚糖多元醇(4.6g)。该物质的分子量(凝胶过滤、プルラン标准)是17K。
将该葡聚糖多元醇(2.5g)加入到将氢氧化钠(17.5g)溶于水(75ml)得到的水溶液中，在室温下溶解。在该溶液中、冰冷下，加入一氯醋酸(25g)，溶解后，在室温下反应20小时。用醋酸将该反应液的pH调为9后，通过使用BIOMAX-5膜用超滤法脱盐。将来通过膜的残留溶液冷冻干燥，得到羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(4.0g)。该物质的分子量(凝胶过滤、プルラン标准)是45K、CM化度是0.9。
将该羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(3.7g)溶解在水中，加到Bio-Rad AG 50W-X2(200-400目、H+型)柱上，用水洗脱。在该洗脱液中加入三乙胺(5.8ml)后，冷冻干燥，得到标题化合物(4.4g)。
例46羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A′(A-NH2＝DX-8951)的合成将由例45得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(4.4g)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(300ml)中。在该溶液中依次加入含有三乙胺(0.19ml)和3′-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)的三氟醋酸盐(580mg)的N，N-二甲基甲酰胺(45ml)溶液、1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二羟基喹啉(4.4g)，避光、室温下，一边搅拌，一边反应。用1M氢氧化钠水溶液调节该反应液的pH为10后，将每5ml滴入到各25ml的乙醇中。在其中加入3M氯化钠水溶液(1ml)、乙醚(5ml)、离心分离收集(3500、8分钟)析出的沉淀。将该沉淀溶解在水中，使用透析膜(スペクトルポア1、临界分子量6000-8000)，对于纯水进行透析，用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤透析内液后，冷冻干燥，得到标题化合物(3.4g)。根据0.1 Tris缓冲液(pH9.0)中的362nm的吸光度，定量本化合物的医药化合物残基含量是4.6％(W/W)。
例47α-甲基羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A′(A-NH2＝DX-8951)的合成将由例45得到的葡聚糖多元醇(2g)加入到将氢氧化钠(14g)溶于水(60ml)得到的水溶液中，在室温下溶解。在该溶液中，在冰冷下，加入α-溴丙酸(19ml)、溶解后，在室温下反应18小时。用醋酸将该反应液的pH调成8后，通过使用BIOMAX-50膜的超滤法脱盐。将未通过膜的残留溶液冷冻干燥，得到α-甲基羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(2.95g)。该物质的分子量(凝胶过滤、プルラン标准)是45K。每个糖残基的α-甲基羧基甲基化度，以羧甲基葡聚糖多元醇为基准，如下求出。将α-甲基羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐水溶液放入到Bio-Rad AG 50W-X2(H+型)柱中，将通过液冷冻干燥，作为试样使用。将该试样溶解在规定的过剩量的0.1N氢氧化钠水溶液中，将酚酞作为指示剂，用0.1N盐酸滴定。取试样的采取量为smg、0.1N氢氧化钠水溶液的规定过剩量为a(ml)、0.1N盐酸的滴定量为b(ml)、用13.4(a-b)/[s-7.2(a-b)]公式求出α-甲基羧甲基化度。其结果，α-甲基羧甲基化度是0.8。
将该α-甲基羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(2.2g)溶解于水中，装入到Bio-Rad AG 50W-X2(200-400目、H+型)柱(直径44mm、长210mm)，用水洗脱。在该洗脱液中加入三乙胺(4ml)后，冷冻干燥，得到α-甲基羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(2.69g)。
将该α-甲基羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(2.68g)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(60ml)中。在该溶液中依次加入将从与例2相同合成的3′-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)(350mg)用与例16相同方法脱Boc化得到的3′-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A的三氟醋酸盐和三乙胺(0.116ml)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(10ml)得到的溶液、将1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二羟基喹啉(2.68g)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(10ml)得到的溶液，在室温下，一边搅拌1夜；一边反应。在该反应液中加入3M氯化钠水溶液，将每6ml滴入到各30ml的乙醇中。分别加入3M氯化钠水溶液(1ml)、乙醚(5ml)，离心分离收集(3500rpm、8分钟)析出的沉淀。用丙酮洗涤该沉淀后，溶解于水中，加入3M氯化钠水溶液(10ml)，用0.1M氢氧化钠水溶液调节pH为9。在37℃下，处理1小时。通过使用BIOMAX-10膜用超滤法将该处理液脱盐。用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤来通过膜的残留溶液后，冷冻干燥，得到标题化合物(2.15g)。将本化合物溶解到0.1M氯化钠水溶液中后，用GPC(柱东ソ-TSK Gel PW-4000XL、溶剂0.1M NaCl、流速0.8ml/min)分析的结果及本化合物的紫外线吸收光谱(0.1M Tris缓冲液、pH9.0、0.21mg/ml)分别如图20及图21所示。根据0.1M Tris缓冲液(pH9.0)中的362nm的吸光度，定量本化合物的医药化合物残基含量是5.9％(W/W)。
例483′-N-(Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)三氟醋酸盐的合成将Phe-Gly-OBzl的对甲苯磺酸盐(3.06g)、Boc-Gly-OH(1.10g)、N-羟基丁二酰亚胺(941mg)、N-甲基吗啉(0.725ml)、N，N-二甲基甲酰胺(40ml)的混合物，冷却到4℃后，加入N，N′-二环己基碳化二亚胺(1.56g)。在室温下一边搅拌1夜；一边反应后，将反应液减压干固。用硅胶柱色谱(洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝98∶2溶液精制残渣，得到Boc-Gly-Phe-Gly-OBzl(1.93g)。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.52(dd，1H，J＝5.6，6.4Hz)，7.97(d，1H，J＝8.8Hz)，7.30-7.39(m，5H)，7.15-7.26(m，5H)，6.83(t，1H，J＝5.6Hz)，5.14(s，1H)，4.52-4.57(m，1H)，3.87-3.96(m，2H)，3.57(dd，1H，J＝5.6，16.7Hz)，3.43(dd，1H，J＝5.6，16.7Hz)，3.01(dd，1H，J＝4.8，14.3Hz)，2.77(dd，1H，J＝5.6，14.3Hz)，1.37(s，9H).
将得到的Boc-Gly-Phe-Gly-OBzl(1.78g)溶解到醋酸乙酯(60ml)中，在5％-Pd-C(1.8g)存在下，接触还原24小时。过滤掉催化剂，将滤液减压浓缩，得到Boc-Gly-Phe-Gly-OH(1.41g)。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.35(t，1H，J＝5.6Hz)，7.94(d，1H，J＝8.8Hz)，7.15-7.26(m，5H)，6.85(dd，1H，J＝5.6，6.4Hz)，4.52-4.58(m，1H)，3.76(d，2H，J＝5.6Hz)，3.56(dd，1H，J＝6.4，16.7Hz)，3.43(dd，1H，J＝5.6，16.7Hz)，3.03(dd，1H，J＝5.0，13.5Hz)，2.79(dd，1H，J＝9.5，13.5Hz)，1.37(s，9H).
将由上述得到的Boc-Gly-Phe-Gly-OH(500mg)及N-羟基丁二酰亚胺(161mg)溶解到N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中。在该溶液中加入溶解了DX-8951的甲磺酸盐(530mg)和三乙胺(0.146ml)的N，N-二甲基甲酰胺(50ml)的溶液，冷却到4℃后，加入N，N′-二环己基碳化二亚胺(268mg)，避光、室温下，一边搅拌1夜；一边反应。将该反应液减压干固，用硅胶柱色谱(洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝96∶4溶液)精制残渣，得到3′-N-(Boc-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)(100mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.39(d，1H，J＝8.0Hz)，8.34(t，1H，J＝5.6Hz)，7.98(d，1H，J＝7.2Hz)，7.78(d，1H，J＝10.3Hz)，7.33(s，1H)，7.13-7.24(m，5H)，6.80(dd，1H，J＝5.6，6.4Hz)，5.55-5.61(m，1H)，5.44(d，1H，J＝16.0Hz)，5.41(d，1H，J＝16.0Hz)，5.25(s，2H)，4.43-4.46(m，1H)，3.69-3.79(m，2H)，3.50(dd，1H，J＝5.6，16.7Hz)，3.41(dd，1H，J＝5.6，16.7Hz)，3.16-3.19(m，2H)，2.98(dd，1H，J＝4.8，14.3Hz)，2.79(dd，1H，J＝9.5，14.3Hz)，2.41(s，3H)，2.19-2.25(m，1H)，2.10-2.15(m，1H)，1.82-1.90(m，2H)，1.35(s，9H)，0.88(t，3H，J＝8.0Hz).Mass(FAB)；m/e 797(M＋1)
将得到的3′-N-(Boc-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)(100mg)溶解在三氟醋酸(3ml)中，放置1小时。馏去溶剂，用甲醇(30ml)共沸2次、用乙醇(30ml)共沸2次后，用醚洗涤残渣，得到标题化合物(80mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.52-8.62(m，1H)，7.94(s，3H)，7.79(t，1H，J＝11.1Hz)，7.34(s，1H)，7.15-7.27(m，5H)，6.52(s，1H)，5.57-5.61(m，1H)，5.36-5.46(m，2H)，5.24(s，2H)，4.66-4.70(m，1H)，3.69-3.81(m，2H)，3.61-3.68(m，1H)，3.40-3.47(m，1H)，3.15-3.23(m，1H)，3.01(dd，1H，J＝4.0，13.5Hz)，2.77(dd，1H，J＝9.5，13.5Hz)，2.12-2.23(m，2H)，1.81-1.91(m，2H)，0.89(t，3H，J＝7.2Hz).Mass(FAB)；m/e 697(M＋1)例493′-N-(Phe-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)三氟醋酸盐的合成将Boc-Phe-Gly(771mg)及N-羟基丁二酰亚胺(300mg)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中。在该溶液中加入溶解了DX-8951的甲磺酸盐(1058mg)、三乙胺(0.293ml)的N，N-二甲基甲酰胺(50ml)溶液，冷却到4℃后，加入N，N′-二环己基碳化二亚胺(494mg)，在避光、室温下，一边搅拌1夜；一边反应。将该反应液减压干固，用硅胶柱色谱(洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝98∶2溶液)精制残渣，得到3′-N-(Boc-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)(1.20g)。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.29(d，1H，J＝8.0Hz)，8.21(t，1H，J＝4.8Hz)，7.76(d，1H，J＝10.3Hz)，7.32(s，1H)，7.13-7.25(m，5H)，6.92(d，1H，J＝7.2Hz)，6.49(s，1H)，5.56-5.61(m，1H)，5.44(d，1H，J＝15.9Hz)，5.38(d，1H，J＝15.9Hz)，5.25(s，2H)，4.08-4.12(m，1H)，3.78(d，1H，J＝4.8Hz)，3.16-3.25(m，2H)，2.99(dd，1H，J＝4.0，13.5Hz)，2.72(dd，1H，J＝10.3，13.5Hz)，2.40(s，3H)，2.09-2.35(m，2H)，1.80-1.91(m，2H)，1.16(s，9H)，0.88(t，3H，J＝8.0Hz).Mass(FAB)；m/e 741(M＋1)将由上述得到的3′-N-(Boc-Phe-Gly)-NH-A(170mg)溶在三氟醋酸(4ml)中，放置1小时。馏去溶剂，用甲醇(10ml)共沸2次、用乙醇(10ml)共沸2次后，用乙醚洗涤残渣，得到标题化合物(100mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.88(t，1H，J＝4.8Hz)，8.68(d，1H，J＝8.7Hz)，8.05-8.15(m，3H)，7.79(d，1H，J＝11.11Hz)，7.26-7.36(m，5H)，6.52(d，1H，J＝7.2Hz)，5.57-5.62(m，1H)，5.43(d，1H，J＝15.9Hz)，5.38(d，1H，J＝15.9Hz)，5.19-5.28(m，1H)，4.10-4.18(m，1H)，3.93(dd，1H，J＝4.8，16.7Hz)，3.82(dd，1H，J＝4.8，16.7Hz)，3.17-3.24(m，2H)，3.14(dd，1H，J＝4.8，13.5Hz)，2.95(dd，1H，J＝8.0，13.5Hz)，2.42(s，3H)，2.14-2.25(m，2H)，1.83-1.91(m，2H)，0.89(t，3H，J＝8.0Hz).Mass(FAB)；m/e 640(M＋1)例503′-N-Gly-NH-A(A-NH2＝DX-8951)三氟醋酸盐的合成将DX-5981的甲磺酸盐(530mg)和三乙胺(0.28ml)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中，冷却到4℃后，加入Boc-Gly的N-羟基丁二酰亚胺酯(327mg)。避光、室温下，一边搅拌1夜；一边反应。将该反应液减压干固，用硅胶柱色谱(洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝98∶2溶液)精制残渣，得到3′-N-(Boc-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)(500mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.38(d，1H，J＝8.3Hz)，7.77(d，1H，J＝10.7Hz)，7.31(s，1H)，6.89-6.91(m，1H)，6.49(s，1H)，5.55-5.59(m，1H)，5.45(d，1H，J＝16.1Hz)，5.38(d，1H，J＝16.1Hz)，5.27(d，1H，J＝19.0Hz)，5.18(d，1H，J＝19.0Hz)，3.50-3.62(m，2H)，3.15-3.19(m，2H)，2.41(s，3H)，2.18-2.24(m，1H)，2.08-2.12(m，1H)，1.81-1.91(m，2H)，1.31(s，9H)，0.87(t，3H，J＝8.0Hz).Mass(FAB)；m/e 593(M＋1)将由上述得到的3′-N-(Boc-Gly)-NH-A(100mg)溶解到三氟醋酸(2ml)中，放置1小时。蒸出溶剂，用甲醇(10ml)共沸2次、用乙醇(10ml)共沸2次后，用乙醚洗涤残渣，得到标题化合物(70mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.88(d，1H，J＝8.8Hz)，8.08(s，3H)，7.81(d，1H，J＝11.2Hz)，7.34(s，1H)，6.52(s，1H)，5.63-5.67(m，1H)，5.45(d，1H，J＝16.7Hz)，5.40(d，1H，J＝16.7Hz)，5.36(d，1H，J＝19.1Hz)，5.25(d，1H，J＝19.1Hz)，3.56(s，2H)，3.11-3.19(m，2H)，2.43(s，3H)，2.23-2.28(m，1H)，2.11-2.19(m，1H)，1.81-1.91(m，2H)，0.88(t，3H，J＝8.0Hz).Mass(FAB)；m/e 493(M＋1)例51羧甲基葡聚糖多元醇的三甲基铵盐的合成将葡聚糖T500(50g、ファルマツア社制、分子量500K)溶解到0.1M醋酸缓冲液(pH5.5、5000ml)中，加入高碘酸钠(165.0g)的水溶液(5000ml)。一边避光；一边在4℃下搅拌10天后，加入乙二醇(35.0ml)，搅拌1夜。用8M氢氧化钠水溶液，将反应液的pH调到7。加入硼氢化钠(70g)、溶解后，搅拌1夜。冰冷反应液，用醋酸调节pH为5.5，在4℃下搅拌1小时后，用8M氢氧化钠水溶液调节pH为7.5。通过使用BIOMAX-50膜用超滤法，将得到的水溶液脱盐。将未通过膜的残留液冷冻干燥，得到葡聚糖多元醇(20.2g)。该物质的分子量(凝胶过滤、プルラン标准)是159K。
将该葡聚糖多元醇(7.5g)加入到将氢氧化钠(31.5g)溶于水(225ml)得到的水溶液中，在室温下使其溶解。在冰冷下，在该溶液中加入一氯醋酸(45g)、溶解后，在室温下反应1夜。用醋酸将该反应液的pH调成8后，通过用BIOMAX-50膜用超滤法脱盐。将未通过膜的残留溶液冷冻干燥，得到羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(8.5g)。该物质的分子量(凝胶过滤、プルラン标准)是274K，羧甲基化度是0.4。将该羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(2.0g)溶于水中，加入到Bio-Rad AG 50W-X2(200-400目、H+型)柱(直径44mm、长度210mm)中，用水洗脱。在该洗脱液中加入三乙胺(4ml)后，冷冻干燥，得到标题化合物(2.2g)。
例52羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Phe-Gly-NH-A′(A-NH2＝DX-8951)的合成将由例51得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(200mg)，溶解在N，N-二甲基甲酰胺(7ml)中。在该溶液中，依次加入由例48得到的3′-N-(Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)的三氟醋酸盐(41mg)的N，N-二甲基甲酰胺(5ml)溶液、三乙胺(0.014ml)、1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二羟基喹啉(100mg)，在室温下一边搅拌1夜；一边反应。将每5ml的该反应液滴入到各10ml的乙醇中。在其中加入3M氯化钠水溶液(2.0ml)、乙醚(25ml)，离心分离收集(3500rpm、8分钟)析出的沉淀。将该沉淀溶于0.5M食盐水中，在冰冷下，用0.1M氢氧化钠水溶液调pH为9。通过使用BIOMAX-50膜用超滤法，将得到的水溶液脱盐。用米利波阿过滤器(0.22μm)，将未通过膜的残留溶液过滤后，冷冻干燥，得到标题化合物(190mg)。根据0.1M Tris缓冲液(pH9.0)的362nm的吸光度，定量本化合物的医药化合物残基含量是4.5％(W/W)。
例53羧甲基葡聚糖多元醇-Phe-Gly-NH-A′(A-NH2＝DX-8951)的合成将由例24得到的羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(2.5g)溶解于水中，放入到Bio-Rad AG 50W-X2(200-400目、Et3NH+型)柱中，用水洗脱。将该洗脱液冷冻干燥，得到羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(2.5g)。
将该羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(200mg)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(12ml)。在该溶液中依次加入由例49得到的3′-N-(Phe-Gly)-NH-A(A-NH2＝DX-8951)的三氟醋酸盐(42mg)和三乙胺(0.016ml)的N，N-二甲基甲酰胺(5ml)溶液、1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二羟基喹啉(200mg)中，避光、室温下，一边搅拌1夜；一边反应。在该反应液中，加入水(300ml)，使用超滤膜10K(フィルトロン社制)进行超滤。用0.1N氢氧化钠水溶液，将未通过膜的残留溶液的pH调为10，使之通过滤膜(0.16μm、フィルトロン社制)。通过使用BIOMAX-50膜，将通过的溶液脱盐，接着，用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤后，冷冻干燥，得到标题化合物(180mg)。根据0.1M Tris缓冲液(pH9.0)中的362nm的吸光度，定量本化合物的医药化合物残基含量是6.1％(W/W)。
例54羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-NH-A′(A-NH2＝DX-8951)的合成将由例51得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(370mg)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中。在该溶液中依次加入由例50得到的3′-N-Gly-NH-A(A-NH2＝DX-8951)的三氟醋酸盐(57mg)的N，N-二甲基甲酰胺(3ml)溶液、三乙胺(0.027ml)、1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二羟基喹啉(185mg)，在室温下，一边搅拌1夜；一边反应。将每5ml的该反应液，滴入到各10ml的乙醇中。在其中加入3M氯化钠水溶液(2.0ml)、乙醚(25ml)，离心分离(3500rpm，8分钟)收集析出的沉淀。将该沉淀溶解在0.5M食盐水中，冰冷下，用0.1M氢氧化钠水溶液，将pH调为9。通过使用BIOMAX-50膜用超滤法，将得到的水溶液脱盐。用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤来通过膜的残留溶液后，冷冻干燥，得到标题化合物(290mg)。根据0.1M Tris缓冲液(pH9.0)中的362nm的吸光度，定量本化合物的医药化合物残基含量是0.5％(W/W)。
例55羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-D51-7059的合成将Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-OH(200mg)，溶解在三氟醋酸(4ml)中，搅拌1.5小时。馏去溶剂，用甲醇(10ml)共沸2次、用乙醇(10ml)共沸2次后，用乙醚洗涤残渣，得到Gly-Gly-Phe-Gly-OH的三氟醋酸盐(225mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.48(dd，1H，J＝5.6，5.6Hz)，8.59(dd，1H，J＝5.6，6.4Hz)，8.29(d，1H，J＝4.8Hz)，7.23-7.26(m，4H)，7.16-7.20(m，1H)，4.58(ddd，1H，J＝4.8，4.8，10.4Hz)，3.89(dd，1H，J＝5.6，16.7Hz)，3.76-3.79(m，2H)，3.67(dd，1H，J＝5.6，16.7Hz)，3.56(s，2H).
将由上述得到的Gly-Gly-Phe-Gly-OH的三氟醋酸盐(200mg)，溶解到水(10ml)中，加入三乙胺，将pH调成9后，加入9-芴基(フレォレニル)甲基N-羟基丁二酰亚胺二碳酸盐(200mg)的乙腈(5ml)溶液，接着，使用三乙胺，一边将pH维持在8.0-8.5；一边在室温下搅拌4小时。在反应液中加入1.5N盐酸(50ml)，滤出析出的沉淀，用水洗涤后，用硅胶柱色谱(洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝4∶1溶液)精制，得到Fmoc-Gly-Gly-Phe-Gly-OH(151mg)。1H-NMR(DMS0-d6)δ8.28-8.32(m，1H)，8.08-8.12(m，1H)，7.85-7.89(m，2H)，7.68-7.72(m，2H)，7.57-7.65(m，1H)，7.38-7.43(m，2H)，7.29-7.34(m，2H)，7.20-7.25(m，4H)，7.14-7.17(m，1H)，4.45-4.52(m，1H)，4.26-4.30(m，2H)，4.19-4.24(m，1H)，3.77(dd，1H，J＝5.6，16.7Hz)，3.58-3.69(m，4H)，3.42-3.52(m，1H)，3.06(dd，1H，J＝4.0，13.5Hz)，2.78(dd，1H，J＝4.0，13.5Hz).
将由上述得到的Fmoc-Gly-Gly-Phe-Gly-OH(24mg)、用下式
表示的紫杉醇衍生物(D51-70599，10-O-(2-氨基亚乙基)-13-O-[ 3-(叔丁氧羰基氨基)-2-羟基-3-苯基]-丙酰基-10-二乙酰基-9-二氢バカチンIII)及N-羟基丁二酰亚胺(7mg)溶解到N，N-二甲基甲酰胺(1ml)中。将该溶液冷却到4℃后，加入N，N′-二环己基碳化二亚胺(9mg)，在室温下，一边搅拌1夜；一边反应。将该反应液减压干固，用硅胶柱色谱(洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝96∶4溶液)精制残渣，得到Fmoc-Gly-Gly-Phe-Gly-D51-7059(21mg)。1H-NMR(CDCl3)δ8.06(d，2H，J＝8.1Hz)，7.75(d，2H，J＝8.1Hz)，7.18-7.61(m，23H)，7.62(dd，1H，J＝7.2，8.0Hz)，6.07(dd，1H，J＝7.9，8.8Hz)，5.98(d，1H，J＝4.8Hz)，5.63(d，1H，J＝8.8Hz)，5.00-5.40(m，4H)，4.92(s，1H)，4.60-4.69(m，2H)，4.41(d，2H，J＝6.4Hz)，4.35(d，1H，J＝8.0Hz)，4.29(d，1H，J＝8.0Hz)，4.21(t，1H，J＝7.5Hz)，3.96-4.07(m，3H)，3.73-3.86(m，4H)，3.37-3.41(m，1H)，3.19-3.23(m，1H)，3.00(dd，1H，J＝8.0，13.5Hz)，2.85-2.89(m，3H)，2.29(s，3H)，2.05-2.40(m，4H)，1.57(s，3H)，1.56(s，3H)，1.53(s，3H)，1.40(s，9H)，1.22(s，3H).Mass(FAB)；m/e 1413(M＋Na)将由上述得到的Fmoc-Gly-Gly-Phe-Gly-D51-7059(21mg)溶解在二氯甲烷(1.8ml)中，加入哌嗪(0.2ml)后，在室温下，反应1小时。用硅胶柱色谱(洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝94∶6溶液)精制该反应液，得到Gly-Gly-Phe-Gly-D51-7059(16mg)。1H-NMR(CDCl3)δ8.10(d，2H，J＝8.1Hz)，7.89-7.94(m，1H)，7.62(dd，1H，J＝7.2，8.0Hz)，7.45-7.50(m，2H)，7.17-7.42(m，12H)，7.10-7.16(m，1H)，6.97(dd，1H，J＝5.6，6.4Hz)，6.08(dd，1H，J＝8.0，8.7Hz)，6.02(d，1H，J＝4.8Hz)，5.62(d，1H，J＝11.1Hz)，5.23-5.30(m，1H)，5.23(d，1H，J＝7.2Hz)，5.10(s，1H)，4.98-5.00(m，1H)，4.60-4.63(m，1H)，4.38(d，1H，J＝8.8Hz)，4.33(d，1H，J＝8.8Hz)，4.13(s，1H)，4.04(dd，1H，J＝5.6，16.7Hz)，3.93(dd，1H，J＝5.6，16.7Hz)，3.82(d，1H.J＝7.2Hz)，3.73-3.82(m，2H)，3.43-3.49(m，1H)，3.30-3.38(m，2H)，3.24(dd，1H，J＝6.4，14.3Hz)，3.04(dd，1H，J＝8.0，14.3Hz)，2.89-3.07(m，3H)，2.30(s，3H)，2.01-2.50(m，4H)，1.70(s，3H)，1.62(s，3H)，1.61(s，3H)，1.40(s，9H)，1.26(s，3H).Mass(FAB)；m/e 1169(M＋1)将由上述方法合成的Gly-Gly-Phe-Gly-D51-7059(33mg)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(0.5ml)中。在该溶液中，依次加入由例24得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(180mg)的N，N-二甲基甲酰胺(7ml)溶液、1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二羟基喹啉(180mg)、在室温下，一边搅拌1夜，一边反应。将每4ml的该反应液滴入到各10ml的乙醇中。分别加入3M氯化钠水溶液(2.0ml)、乙醚(25ml)，离心分离收集(2500rpm、8分钟)析出的沉淀。用乙醇洗涤该沉淀后，溶解在水中，放到Bio-Rad AG 50W-X2(200-400目、Na+型)柱(直径15mm、长85mm)中，用水洗脱，得到洗脱液1。另外，将Gly-Gly-Phe-Gly-D51-7059(10mg)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(0.5ml)中后，依次加入由例24得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙铵盐(60mg)的N，N-二甲基甲酰胺(5ml)溶液、1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二羟基喹啉(60mg)的N，N-二甲基甲酰胺(0.25ml)溶液，在室温下，一边搅拌1夜；一边反应。将该反应液滴入10ml的乙醇中后，加入3M氯化钠水溶液(2.0ml)、乙醚(25ml)，离心分离收集(2500rpm、8分钟)析出的沉淀。用乙醇洗涤该沉淀后，溶解于水中，放入Bio-Rad AG 50W-X2(200-400目、Na+型)柱(直径15mm、长85mm)，用水洗脱，得到洗脱液2。将洗脱液1及洗脱液2混合后，通过使用BIOMAX-50膜的超滤法，进行脱盐。用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤未通过膜的残留溶液后，冷冻干燥，得到标题化合物(208mg)。将本化合物溶解在0.1M氯化钠水溶液中后，用GPC(柱东ソ-TSK Gel PW-4000XL、溶剂0.1M NaCl、流速0.8ml/min)分析结果及本化合物的紫外线吸收光谱(甲醇∶水＝10∶1溶液、1.69mg/ml)分别如图22及图23所示。根据甲醇∶水＝10∶1溶液中的240nm的吸光度，定量本化合物的医药化合物残基含量是5.3％(W/W)。
例56本发明的药物复合物的抗肿瘤作用用与例11相同方法，作成感染Meth A癌小鼠(1组6只)，对于例15的药物复合物，用与例12相同方法，研究单次给药时的抗肿瘤作用。其结果，例15的药物复合物，与例12的医药化合物本身相比，显示出显著增强的抗肿瘤效果及有效用量范围的扩大。被测化合物 给药量(mg/kg)1)抑制率(％)例15的化合物 101005 992.5 951.25 831)医药化合物换算量例57本发明的药物复合物的抗肿瘤作用将人的胃癌SC-6的肿块，移植到裸鼠(BALB/c-nu/nu、雄性)的右鼠颈(径)部皮下，作成感染SC-6癌的裸鼠(1组5只)。移植后的第24天将溶解在注射用蒸馏水中的例15的药物复合物静脉内单次给药、将其抗肿瘤作用，与医药化合物本身进行比较。其结果，例15的药物复合物，与医药化合物本身比较，没有显示毒性死亡、发挥了高的抗肿瘤效果。被测化合物给药量(mg/kg) 抑制率(％)死亡小鼠数/使用小鼠数医药化合物本身60 982/515 610/5例15的化合物 81)100 0/521)710/51)医药化合物换算量例58本发明的药物复合物的抗肿瘤作用用与例57相同方法，作成感染人肺癌的QG-90癌的裸鼠(1组5只)。在移植后的第16天，将溶解在注射用蒸馏水中的例15的药物复合物单次静脉给药，将其抗肿瘤作用与医药化合物本身进行比较。其结果，例15的药物复合物，与医药化合物本身比较，显示显著增强的抗肿瘤效果和有效用量范围的扩大。被测化合物给药量(mg/kg) 抑制率(％)死亡小鼠数/使用小鼠数医药化合物本身5060 0/512.5 51 0/5例15的化合物 71)98 0/51.751)97 0/51)医药化合物换算量例59本发明的药物复合物的抗肿瘤作用用与例11相同方法，作成感染Meth A癌白鼠(1组6只)，用与例12相同方法，将单次给与例41的药物复合物时的抗肿瘤作用，与医药化合物本身相比较，其结果，例41的药物复合物，与医药化合物本身比较，显示显著增强的抗肿瘤效果及有效用量范围的扩大。被测化合物 给药量(mg/kg)1)抑制率(％)医药化合物本身100 6450 5625 34例41的化合物 251)9912.51)956.251)813.1251)611)医药化合物换算量例60本发明的药物复合物的抗肿瘤作用用与例11相同方法，作成感染Meth A癌小鼠(1组6只)，用与例12相同方法，研究分别单次给与例29、例46及例47的各药物复合物时的抗肿瘤作用。
其结果，任何一种药物复合物都显示了高的抗肿瘤效果和宽的有效用量范围。被测化合物给药量(mg/kg)1)抑制率(％)例29的化合物3099209910895 79例46的化合物100 94809240822075例47的化合物100 968094409720751)医药化合物换算量例61本发明的药物复合物的抗肿瘤作用用与例11相同方法，作成感染Meth A癌小鼠(1组6只)，对于例44的药物复合物，用与例12相同方法单次给药，将其抗肿瘤作用与医药化合物本身(阿霉素)比较。其结果，例44的药物复合物与医药化合物比较，显示了显著的抗肿瘤效果的增强及有效用量范围的扩大。被测化合物给药量(mg/kg) 抑制率(％)死亡小鼠数/使用小鼠数医药化合物本身20 6/610 640/65 390/6例44的化合物 401)960/6201)960/6101)870/651)760/61)医药化合物换算量例62本发明的药物复合物的体内动态用与例11相同方法，作成感染Meth A癌小鼠，对于例15的药物复合物，用与例12相同方法，单次给药(10mg/kg医药化合物换算量)，研究药物复合物在各组织内的浓度推移。其结果，例15的药物复合物显示了显著高的血液中滞留性、向肿瘤组织高移送性及对于肝脏和小肠的高肿瘤选择性。其结果如图24所示。
产业上的可利用性导入抗肿瘤剂的医药化合物残基的本发明药物复合物，其特征是肿瘤部位选择性优良、可发挥高效抗肿瘤作用的同时，显示的毒性也降低。
权利要求
1.药物复合物，其特征是通过含有1个氨基酸的间隔基或含有肽式键合的2～8个氨基酸的间隔基，使羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇和医药化合物的残基结合。
2.权利要求1所述的药物复合物，其特征是构成羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇是在实质上可完全多元醇化的条件下处理葡聚糖而得到的葡聚糖多元醇。
3.权利要求1或2所述的药物复合物，其特征是羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇是羧甲基葡聚糖多元醇。
4.权利要求1至3任何一项所述的药物复合物，其中的医药化合物是抗肿瘤剂或抗炎剂。
5.权利要求4所述的药物复合物，其中的医药化合物是显示浓度依赖型的抗肿瘤作用的抗肿瘤剂。
6.权利要求4所述的药物复合物，其中的医药化合物是显示时间依赖型的抗肿瘤作用的抗肿瘤剂。
7.权利要求4所述的药物复合物，其中的抗肿瘤剂是阿霉素或(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并(3′，4′6，7)中氮茚并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮。
8.权利要求5至7任何一项的药物复合物，其中的间隔基是用-X-Z-表示的二肽(-X-Z-表示疏水性氨基酸(X)和亲水性氨基酸(Z)进行肽式键合分别成为N末端侧及C末端侧后，从形成的二肽的N末端的氨基及C末端的羧基分别除去1个氢原子及1个羟基后的残基)或含有该二肽作为部分肽序列的间隔基。
9.权利要求8所述的药物复合物，其中的疏水性氨基酸是苯基丙氨酸，亲水性氨基酸是甘氨酸。
10.权利要求9所述的药物复合物，其中的间隔基是(N末端)-Gly-Gly-Phe-Gly-。
11.权利要求5至10任何一项所述的药物复合物，其中抗肿瘤剂的残基导入量是1-15重量％范围。
12.权利要求5至10任何一项所述的药物复合物，其中抗肿瘤剂的残基导入量是3～10重量％范围。
13.权利要求5至10任何一项所述的药物复合物，其中抗肿瘤剂的残基导入量是5-6重量％范围。
14.权利要求1所述的药物复合物，其中用N2H-Gly-Gly-Phe-Gly-COOH表示的肽的N末端是以酰胺键与羧甲基葡聚糖多元醇的羧基结合，该肽的C末端是以酰胺键与(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并(3′，4′6，7)中氮茚并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-氨基结合。
15.权利要求14所述的药物复合物，其中(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并(3′，4′6，7)中氮茚并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮残基的导入量是2～10重量％的范围。
16.权利要求14或15所述的药物复合物，其中羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇是分子量为5,000～500,000范围的羧甲基葡聚糖多元醇，羧甲基化度是0.01～2.0范围。
17.权利要求14或15所述的药物复合物，其中羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇是分子量50,000～450,000范围的羧甲基葡聚糖多元醇，羧甲基化度是0.1～1.0范围。
18.权利要求14或15所述的药物复合物，其中羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇是分子量200,000～400,000范围的羧甲基葡聚糖多元醇，羧甲基化度是0.3～0.5范围。
19.权利要求14所述的药物复合物，其中(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并(3′，4′6，7)中氮茚并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮残基的导入量5～6重量％的范围、羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的分子量大约是228,000，羧甲基化度约是0.4。
20.药物传递载体，其特征是用于结合医药化合物的药物传递载体，其含有羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇。
21.权利要求20所述的药物传递载体，其中羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的分子量是5,000～500,000，羧基C1-4烷基化度是0.01～2.0范围。
22.权利要求20所述的药物传递载体，其中羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的分子量是50,000～450,000，羧基C1-4烷基化度是0.1～1.0范围。
23.权利要求20所述的药物传递载体，其中羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的分子量是200,000～400,000范围，羧基C1-4烷基化度是0.3～0.5范围。
24.权利要求20至23任何一项所述的药物传递载体，其中羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇是羧甲基葡聚糖多元醇。
25.羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇在制备含有结合医药化合物残基的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的药物复合物中的应用。
26.羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇在通过间隔基或不通过间隔基制备医药化合物残基和羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇相结合的药物复合物中的应用。
全文摘要
药物复合物，其特征是通过含有1个氨基酸的间隔基或含有肽式键合的2～8个氨基酸的间隔基，使实质上在可完全多元醇化的条件下处理的羧基C
文档编号A61K47/48GK1227499SQ97197008
公开日1999年9月1日 申请日期1997年6月5日 优先权日1996年6月6日
发明者井上和泓, 洲崎浩, 池田政浩, 久我洋, 熊泽荣治, 东乡明子 申请人:第一制药株式会社, 株式会社药物靶向输送系统研究所