专利名称：siRNA微乳载体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，涉及一种可将特定疾病相关基因的SiRNA包封于其中的经皮转运系统——siRNA微乳载体及其制备方法。
背景技术：
基因治疗是疾病治疗理念、技术和方法中的重大突破，其中RNA干扰现象的发现及siRNA的应用为基因治疗提供了新的手段，也丰富了基因药物开发的内容。RNA干扰(RNA interfering, RNAi)现象是由与祀基因序列同源的双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)裂解成由21 25个核苷酸组成的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)而引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程(参见文献①HannonGJ. RNA interferences. Nature. 2002Jul 11；418(6894) :244-51.②Dykxhoorn DM,NovinaCD, Sharp P. Killing the messenger Short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003Jun ;4 (6) :457-67.)。目前RNAi技术被广泛应用于基因功能研究领域，而且在疾病治疗领域也日益引起重视。其相对于传统药物和抗体治疗的优势在于
(I)siRNA设计远比一个化学药物或抗体药物的设计合成制备周期要短，因为所有siRNA药物的合成路线是一样，而每一个化学药物都有其特殊性；(2) siRNA药物可靶向任何一个基因，包括药物或抗体不能靶向的基因或蛋白；(3)其对致病基因的高特异性也是传统药物无法相比的；(4)因为所有siRNA具有相似的化学结构，其药代动力学特点是相似的，不需要专门的研究。因此RNAi技术可以大大简化药物研发过程，基于以上优点，可以看到以siRNA作为治疗手段的前景诱人，许多科研机构在致力于研究siRNA药物，甚至一些公司已经开始开发这类药物，并进入I期或II期临床实验或临床前实验，目前的siRNA药物主要是针对黄斑变性、病毒(如HIV)感染，炎症性疾病(如哮喘)及肿瘤等，涉及的基因主要有 VEGF、VEGFR、IL4R 等(Liu G, Wong-Staal F，Li QX. Development of new RNAitherapeutics. Histol Histopathol. 2007 Feb ；22 (2) :211-7. )。siRNA 用于科研或药物研发，其给药方式一般为整体给药，如静脉注射，或局部给药，如皮内、皮下注射，吸入、滴入。siRNA治疗学面临的主要问题是给药方法问题，几家RNAi治疗学公司正在通过开发复合给药系统发展siRNA治疗学。第一类RNAi技术治疗学方法是将siRNA直接应用到病变的部位。例如，Sirna公司的先导siRNA分子就是直接注射到眼部，用以治疗年龄相关的黄斑退化症；位于麻省剑桥市的Alnylam制药公司是将siRNA直接吸入肺部，治疗呼吸道合胞体病毒感染。据Sirna(旧金山)公司负责科研工作的副总裁Berry Pollisk讲道“核酸治疗学还是一种理想中的治疗方法，最终还有待去实现。咎其原因，完全是由于对给药系统没有给予足够的重视，对这个问题的重要性也没有作出准确的判断。”麻省理工大学医学院专门从事RNAi研究的Philip D. Zamore说，“我们对RNAi治疗学中的药物输送系统问题保持一种乐观的态度。向肺部给药很有希望，但如果想向肺部以外的其他器官或组织给药，那还需要做很多工作。如果你已经能将RNAi输送到肝脏和肺脏，并不意味着就完成了 RNAi给药方法研究的使命，因为不同组织和器官的给药方法不同，所需要的辅助材料和药物载体也不同。有好多人患有不同的组织和器官疾病，意味着需要很多的给药系统和方法。”(张殿增(编译)，RNAi技术产业化最新动向.生物技术世界，2007，(I))因此，siRNA作为药物用于治疗主要的瓶颈问题主要是一个是稳定性的问题，siRNA非常容易被环境中的核酸酶水解而失去活性；另一个是转运问题，目前用于局部基因敲除的siRNA经常采用皮下注射或靶器官注射，但这些方法不方便真正应用于临床，只能用于科研中的动物给药。目前对于siRNA药物研发，还没有经皮给药的给药模式，因为缺乏经皮给药的转运系统。目前尚无文献报道一种能够有利于保护siRNA的稳定性，又要有利于其顺利透过皮肤或粘膜的siRNA载体。
发明内容
本发明拟在研究一种将siRNA包封于其中，能够实现经皮转运的载体，同时解决siRNA的稳定性和经皮或经粘膜的转运问题。
本发明的目的是提供一种可将特定疾病相关基因的siRNA包封于其中的经皮转运系统——siRNA微乳载体，该siRNA微乳载体不仅保护了包封其中的siRNA的稳定性而且透皮能力强。本发明的另一目的是提供该siRNA微乳载体制备方法。本发明人设想本发明的技术方案既要能够有利于保护siRNA的稳定性，又要有利于siRNA顺利透过皮肤，因此，制备siRNA微乳载体应该是最优化的技术方案。首先，微乳中的水相可以将siRNA很好地进行包封，不受核酸酶的影响，进一步提高其稳定性；其次，微乳的透皮能力使的分子量较大的siRNA(平均分子量为13300)更容易进入皮下；再次，微乳的乳滴是由表面活性剂构成的双分子层形成，而不是固体层，所以进入皮肤后，能够迅速释放药物，发挥作用；最后，微乳这种剂型具有一定粘度，适合皮肤给药，也可以作为中间剂型进一步制成其他剂型，如凝胶、乳膏等剂型使用等。微乳是由水相、油相、表面活性剂和助表面活性剂按适当比例混和而自发形成的各向同性、透明、热力学稳定的胶体分散体系，结构上分为水/油(W/0)、油/水(0/W)和双连续型，液滴粒径通常在IOnm lOOnm，既具亲脂性又具亲水性，与角质层的细胞间脂质双分子层有更高的相容性，可穿透角质层进入体循环而发挥治疗作用。作为一种非常有前景的经皮给药载体，微乳主要具有以下几个优点(I)W/0型则可延长水溶性药物的释放时间，起到缓释作用；(2)微乳属于热力学稳定体系，易于制备和保存；(3)微乳粒径小，可采用过滤灭菌；(4)微乳液滴的特殊构造，使经皮给药后的药物释放时间更长；(5)微乳作为包合药物的载体可以提高药物的稳定性，降低药物刺激性(① Peltola S, Saarinen-Savolainen P, Kiesvaara J, SuhonenTM, Urtti A. Microemulsions for topical delivery of estradiol. Int J Pharm. 2003Mar 26 ；254(2) :99-107.② Rhee YS, Choi JG, Park ES, Chi SC. Transdermal deliveryof ketoprofen using microemulsions. Int J Pharm. 2001 0ct9 ;228 (1-2) 161-70.③寇欣.微乳给药系统的研究进展.天津药学，2005，17 (6) 52-5.④吴晓辉，刘玉玲等.微乳作为经皮给药载体的研究进展·中国药学杂志，2006,41(22) 681.⑤Kogan A，GartiN. Microemulsions as transdermal drug delivery vehicles. Adv Colloid InterfaceSci.2006 Nov 16 ; 123-126 :369-85. Epub2006Jul 14.)因此，微乳用于经皮给药已经成为目前药剂学研究的热点。本课题的研究药物为siRNA，基于siRNA为水溶性的物理性质，我们采用W/0型微乳。而且微乳与可以经皮给药其他剂型，如脂质体、纳米粒相比，对于siRNA的包裹和转运更俱优势的特点在于(I)微乳是由脂质双分层构成，而不是固体层，当进入皮内后，由于其脂质双分子层的流动性和与细胞膜的亲和力，将里面包裹的siRNA释放，进入靶细胞发挥作用，而不会象纳米粒或脂质体等载体，由于其为固体颗粒，难以透皮后释放药物，更容易直接进入血液循环。(2)微乳制备工艺简单，在制备过程中仅需要搅拌，这对于性质不稳定，极易被核酸酶分解且遇热、一些试剂后易发生变性的siRNA来说非学重要，许多载体剂型的制备工艺中均含加热和需要有机溶剂等环节，如纳米粒、脂质体的制备。所以微乳是适合包裹和经皮肤或粘膜转运siRNA的最佳载体剂型。本发明提供了一种siRNA微乳载体，由油相基质、乳化剂、助乳化剂和水相基质组成，各组分的重量百分比如下
油相基质 40-70%
乳化剂10-20%
助乳化剂 10-20%
水相基质 5-20%，其中的油相基质选自辛酸甘油三酯或癸酸甘油三酯；其中的乳化剂(表面活性剂)是聚甘油-6双异油酸酯；其中的助乳化剂(助表面活性剂)是聚乙二醇-8辛酸酯或聚乙二醇-8癸酸酯；其中的水相基质是无酶水(RNase, DNase-free water)；微乳为W/0型，siRNA包封在水相中。上述的siRNA微乳载体，较佳地，油相基质乳化剂助乳化剂水相基质的重量百分比为 50-60% 15-20% 15-20% 10-15%。最佳地，一种siRNA微乳载体，其配方及配比具体如下
油相基质辛酸/癸酸甘油三酯5.6 g
乳化剂聚甘油-6双异油酸酯1.7 g
助乳化剂聚乙二醇-8辛酸/癸酸酯 1.7 g 水相基质无酶水I mL
共10 g本发明还提供上述siRNA微乳载体的制备方法，油相基质及乳化剂、助乳化剂于烘箱中，60-90°C (75°C最佳)烘烤6-10小时(8小时最佳)；按比例称取油相和乳化剂、助乳化剂，使用搅拌器搅拌混合5-20分钟(IOmin最佳)，使混匀，在搅拌状态下逐渐滴加水相(只滴加水相，即为空乳载体，不含siRNA，做考察用)或溶有siRNA的水相，体系开始呈现乳浊并有粘度增加现象，浊度逐渐降低，恒速搅拌至完全澄清，为均一无色澄清液体，即成siRNA微乳。于4°C或_20°C储存备用。
上述制备方法中为防止RNA酶污染，在微乳配制过程中，所有使用的药品、容器、材料均需无酶处理或本身为无酶产品。其中制备微乳所用的油相及两种乳化剂于烘箱中，75°C烘烤8h ;金属容器于烘箱中180°C烘烤3h ;塑料、胶皮及其他不耐高温的材料于O. 1% DEPC水中浸泡24h，可以耐受高温高压的再120°C，20min灭菌；一次性材料使用无酶产品。本发明的siRNA微乳载体可将一种或多种人工合成的与特定疾病相关的基因的siRNA包封于W/0型微乳的脂质双分子层中，形成siRNA微乳，将微乳局部给药于皮肤或粘膜，将siRNA带入皮内、皮下或粘膜下，并且使siRNA较长时间储留在皮内、皮下或粘膜下，进入细胞，导致疾病相关基表达的下调从而起到治疗作用，也可使siRNA经皮进入血液循环，发挥系统性基因敲除效应而达到治疗疾病的目的，亦可用于基因表达相关的科学研究。本发明的技术方案既要能够有利于保护siRNA的稳定性，又要有利于其顺利透过皮肤，其特点是(I)微乳可以将溶于无酶水的siRNA很好地进行包封，不受核酸酶的影响， 进一步提高其稳定性；(2)微乳的透皮能力使的分子量较大的siRNA(平均分子量为13300)更容易进入皮下；(3)微乳的乳滴是由表面活性剂构成的双分子层形成，而不是固体层，所以进入皮肤后，能够迅速释放药物，发挥作用；(4)微乳的制备条件温和，制备时间短，仅需要搅拌即可形成，有利于保护对外界环境敏感的siRNA的活性；(5)利用其缓释作用使siRNA滞留于皮肤功粘膜的时间更长，则siRNA与皮肤及粘膜细胞充分接触，提高细胞摄取量，提高靶向基因敲除效率；(6)具有一定粘度，适合皮肤给药，也可以作为中间剂型进一步制成其他剂型，如凝胶、乳膏等剂型使用；(7)即可作为皮肤和粘膜组织内基因敲除的转运载体，又可作为以系统性基因敲除为目的的发挥全身作用的siRNA载体。此外，通过以下实施例证实，本发明所制备的siRNA微乳载体，可以将siRNA包封于微乳载体中，形成规则、均一的热力学稳定体系，粒径小至纳米级，有利于透过皮肤。zeta电位为正电，易于与带负电的细胞膜亲和，而产生渗透作用。该载体的包封作用还延长了siRNA药物在皮内的滞留时间，为其在皮内或皮下充分发挥作用提供了有利条件。该微乳载体很大程度上保护了 siRNA的稳定性，使其生物学活性保持较长时间，这也是作为药物需要有一定贮备时间所必须的。其冻存于_20°C，微乳仍然保持其特性而没有破乳等情况发生，提示该类药物还可冷冻保存，这对siRNA稳定性的提高又是一有利条件。模型药物eotaxin特异的siRNA微乳证实了其可以将eotaxin特异的siRNA带入皮内，发挥疗效。因此，本发明所制备的siRNA微乳载体可以完全达到对siRNA药物保护及经皮转运作用，发挥siRNA的治疗效果，作为siRNA药物的有效载体剂型。
图I :siRNA微乳伪三元相2 =SiRNA微乳外观及包封情况其中A为微乳类型判定染色实验，B为激光共聚焦显微镜下微乳形态及包封效果观察，C为冷冻蚀刻技术处理后透射电镜下微乳形态观察图3 =SiRNA微乳理化性质考察其中A为粒径测量，B为zeta电位测量，C为粘度测量图4 =SiRNA微乳透皮吸收及消除速率考察
其中A为微NC-FAM siRNA乳透皮吸收过程，B为NC-FAM siRNA微乳皮内消除过程，C为NC-FAM siRNA皮下注射后消除过程图5 :模型药物嗜酸粒细胞趋化因子(eotaxin) siRNA微乳(ESM)生物效应稳定性
考察其中A为不同时间ESM及eotaxin水溶液对细胞中eotaxin mRNA敲除效果检测，B为不同时间ESM及eotaxin水溶液对细胞中eotaxin蛋白分泌量的影响图6 =ESM对接触性皮炎(AOT)模型小鼠皮肤组织中eotaxin分泌的抑制作用其中A为ESM对小鼠A⑶模型皮肤中eotaxin mRNA表达的影响，B为ESM对小鼠A⑶模型皮肤中eotaxin蛋白表达的影响
具体实施方式
现结合实施例和说明书附图对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。实施例I :NC-FAM siRNA微乳的制备为防止RNA酶污染，在微乳配制过程中，所有使用的药品、容器、材料均需无酶处理或本身为无酶产品。其中制备微乳所用的油相及两种乳化剂于烘箱中，75°C烘烤8h ;金属容器于烘箱中180°C烘烤3h ;塑料、胶皮及其他不耐高温的材料于0. 1% DEPC水中浸泡24h，可以耐受高温高压的再120°C，20min灭菌；一次性材料使用无酶产品。NC-FAM siRNA微乳配方及配比
NC-FAM siRNA400 pg
无酶水I mL
辛酸甘油三酯5.4 g
聚甘油-6双异油酸酯1.8 g
聚乙二醇-8辛酸酯1.8 g
共IOg制备方法为设计任意序列的siRNA (NC siRNA)，并加以羧基荧光素(FAM)修饰，成NC-FAM siRNA，将其溶于无酶水中。按上述比例称取油、乳化剂和助乳化剂，使用磁力搅拌器搅拌混合lOmin，使混匀，在搅拌状态下逐渐滴加溶有NC-FAM siRNA的水相，体系开始呈现乳浊并有粘度增加现象，之后浊度逐渐降低，恒速搅拌至完全澄清，为均一无色澄清液体，即成NC-FAM siRNA微乳。于4°C或_20°C储存备用。本实施例制备了一种荧光标记的任意序列的SiRNA微乳，可用于科研探索，如实施例5中用于微乳形态和包封效果的考察，实施例6中用于观察其微乳的透皮效果。凡需要荧光检测，包括定量和定性观察等要求，均可以此作为一个研究工具来使用。使微乳的质量评价指标更丰富和易于掌握。实施例2 :eotaxin siRNA微乳的制备为防止RNA酶污染，在微乳配制过程中，所有使用的药品、容器、材料均需无酶处理或本身为无酶产品。其中制备微乳所用的油相及两种乳化剂于烘箱中，75°C烘烤8h ;金属容器于烘箱中180°C烘烤3h ;塑料、胶皮及其他不耐高温的材料于0. 1% DEPC水中浸泡24h，可以耐受高温高压的再120°C，20min灭菌；一次性材料使用无酶产品。Eotaxin siRNA微乳配方及配比
Eotaxin siRNA800 pg
无酶水0.8 mL
癸酸甘油三酯5.4 g
聚甘油-6双异油酸酯1.9 g
聚乙二醇-8癸酸酯1.9 g
共IOg制备方法为设计eotaxin 特异的 siRNA,即 eotaxin siRNA(按 NCBI GenBank核酸序列数据库中序列 Accession Number 为 NM_011330 的 Mus musculus smallchemokine (C_C motif) ligand 11 (CCLll)mRNA(982bp)设计，Sense strand :5，GCU UUAUCA UGA CCA GUA ATT 3，；Antisense strand :5，UUA CUG GUC AUG AUA AAG CAG 3，)，将其溶于无酶水中。按上述比例称取油、乳化剂和助乳化剂，使用磁力搅拌器搅拌混合lOmin，使混匀，在搅拌状态下逐渐滴加溶有eotaxin siRNA的水相，体系开始呈现乳浊并有粘度增加现象，之后浊度逐渐降低，恒速搅拌至完全澄清，为均一无色澄清液体，即成eotaxin siRNA微乳。于4°C或_20°C储存备用。实施例3 STAT6siRNA微乳的制备SATA6siRNA微乳配方及配比
STAT6 siRNA800 μ g
辛酸甘油三酯6.6 g
聚甘油-6双异油酸酯1.2g
聚乙二醇-8癸酸酯1.2 g
无酶水ImL
共10 gSTAT6 (Signal transducers and activators of transcription 6,信号转导与转录活化因子6)特异的siRNA,即STAT6siRNA,序列参考Rippmann JF等的报道(RippmannJF,Schnapp A,Weith A,Hobbie S. Gene silencing with STAT6specific siRNAs blockseotaxin release in IL-4/TNFalpha stimulated human epithelial cells.FEBSLett. 2005Jan 3 ；579(1) :173-8.)，Sense strand :5，CAG UUC CGC CAC UUG CCA ATT 3，；Antisense strand :5’ UUG GCA AGU GGC GGA ACU GTT3’。其余同实施例 2。实施例4 C0X-2siRNA微乳的制备C0X_2siRNA微乳配方及配比COX-2 siRNA800 μ g
辛酸甘油三酯5.6 g
聚甘油-6双异油酸酯1.7g
聚乙二醇-8癸酸酯1.7 g
无酶水ImL 共10 g设计C0X-2 (Cycloxygenase-2,环氧化酶-2)特异的 siRNA,即COX-2 si RNA (GenBank Accession No NM_000963), 5; -CUGCUCAACACCGGAAUUUtt-3'，其余同实施例2。 实施例5 :本发明的siRNA微乳载体的产品质量评定(I)伪三元相图将一对实施例I中NC siRNA作为siRNA药物，溶于水相，用于制备微乳。将乳化剂聚乙二醇-8辛酸/癸酸酯、助乳化剂聚甘油-6双异油酸酯和油相辛酸/癸酸甘油三酯不同比例混匀，于室温滴加水相，观察系统由澄清变混浊，由混浊变澄清的临界点，用0rigin7. O软件绘制伪三元相图，图1，其阴影区域为可以成乳的区域。(2)微乳类型采用染色法(安红丽，欧阳五庆，等.非离子型表面活性剂微乳的研制.西北农林科技大学学报(自然科学版)· 2007, 35 (3) :65-9. Watnasirichaikul S, Davies NM,Rades T，Tucker IG. Preparation of biodegradable insulin nanocapsules frombiocompatible microemulsions. Pharm Res. 2000Jun ; 17 (6) :684-9.)鉴别 siRNA 微乳的类型。取相同体积的siRNA微乳，同时分别加入苏丹红III染料(和亚甲蓝染料溶液各两滴，观察两种染料在微乳中的扩散速度以及外观变化，确定微乳的类型。如图2-A，油溶性的苏丹红滴入到微乳中后，很快在作为外相的油相中形成均一的溶液，而水溶性的亚甲蓝则无法与油相相溶，以液滴形式分散在微乳中，证明所制备的微乳为W/0型。(3)包封情况将实施例I中NC-FAM siRNA微乳(40 μ g/mL)及空乳各I滴于激光共聚焦显微镜下观察液体内荧光分布情况。如图2-B，视野中为密集的圆形绿色荧光亮点，大小均匀，证明siRNA可以很好地包裹于微乳之中。不载药的空乳(图2-B-a)在镜下视野中则无荧光斑点。⑷形态观察米用冷冻蚀刻技术处理NC siRNA微乳样品，于透射电镜下观察,如图2-C,微乳颗粒基本为大小均一的球形。(5)粒径、zeta电位和粘度我们考察了 NC siRNA于制备完成时及于4°C放置3个月后(平衡至室温)的粒径(图3-A)、zeta电位(图3_B)、粘度(图3_C)等理化参数，没有显著性差异，说明微乳在一定时间内性质稳定。用粒度仪测得其平均粒径约为50nm，呈正态分布，分散系数为
0.075，表明该制剂粒径小且均一。其zeta电位显示带正电。且粘度远远大于水(20°C时为I.005mPa. s)，说明其附着力较强，可以用于皮肤给药。结果见表I。表I :siRNA微乳理化性质考察(η = 3)
存贝士时间粒径(nm)Zeta电位mV) 粘度(mPa.s)
^Od50.4±3.264.32士2.7886.30±1.68
3 mon49.5±2.765.82±2.0988.73±1.34实施例6 :本发明的siRNA微乳载体的透皮效果考察 将40 μ LNC-FAM siRNA微乳(200 μ g/mL)涂于裸鼠背部皮肤，将裸鼠置于小动物整体成像系统中(异氟烷吸入呈麻醉状态)，至荧光强度增至最强，即透皮吸收与体内消除达平衡状态。在siRNA微乳透皮吸收已达峰值时，将背部微乳用棉签轻轻拭去，每间隔一定时间拍照一次，至皮下荧光全部消失。同时设对照组，皮下注射40 μ L NC-FAM siRNA水溶液，观察荧光消失速度。比较两者皮下消除的时间。如图4-A，NC-FAM siRNA微乳皮下吸收Ih 2h可达至高峰。如图4-B，NC-FAM siRNA微乳并可于皮下保持约5h。如图4-C，NC-FAM siRNA水溶液皮下注射组只可以在皮下维持2h 3h，说明微乳具有延长siRNA在 皮下滞留时间的作用。实施例7 :本发明的siRNA微乳载体稳定性实验嗜酸粒细胞趋化因子(eotaxin)在皮肤过敏性疾病中趋化嗜酸粒细胞的重要因子(Palframan RT, Collins PD, Williams TJ, Rankin SM. Eotaxin induces a rapidrelease of eosinophils and their progenitors from the bone marrow. Blood. 1998Aprl ；91(7) :2240-8.)，且肿瘤坏死因子-a (TNF- a )可诱导成纤维细胞中eotaxin的产生(Matsukura S, Stellato C, Plitt JR, Bickel C, Miura K, Georas SN, Casolaro V,Schleimer RP. Activation of eotaxin gene transcription by NF—kappa B and STAT6in human airway epithelial cells. J Tmmunol.19 Dec 15 ；163 (12) :6876-83.)。实施例2将eotaxin作为祀基因，设计eotaxin特异的siRNA,并制备eotaxin特异的siRNA微乳(ESM)将微乳，同时对照组为相同浓度的eotaxin siRNA的水溶液(ES)，与ESM做相同处理。成品置于4°C,于不同时间点(2wk、4wk、6wk、8wk、10wk、12wk)取出进行检测，另一组于_20°C储存16wk。微乳中eotaxin生物活性检测方法如下采用小鼠成纤维细胞株NIH3T3细胞做为模型细胞。首先将微乳进行破乳，取水层，用Am-blue法检测使siRNA成IOOnM时对NIH3T3细胞的生存性无显著影响，48h生存率大于90%。并将保存了不同时间的微乳破乳后取水层，作用于正常细胞和TNF- α刺激的细胞，检测eotaxin敲除效率,real-time PCR法检测eotaxin mRNA的表达(见图5_A),ELISA检测eotaxin蛋白的分泌情况(见图5-B)，来判定微乳中siRNA的生物活性。研究表明在IOwk内，微乳可以很好地保护siRNA不受外界核酸酶的影响，依然保持对目的基因的干扰活性，在12wk时其活性有下降趋势，但仍未形成统计学差异。而储存于_20°C 16wk的两组微乳样品中的eotaxinsiRNA活性没有下降,但ES组中eotaxin siRNA的活性只能保持4wk左右。实施例8 :模型产品药效学验证制备小鼠接触性皮炎(AO))动物模型(NagaiH, UedaY, Tanaka H, Hirano Y,Nakamura N,Inagaki N,Takatsu K,Kawada K. Effect of overproduction of interleukin5 on dinitrofluorobenzene-induced allergic cutaneous response in mice. JPharmacol Exp Ther. 1999 Jan ;288 (I) :43-50.),于小鼠皮肤过敏反应激发前 24h 给药,20 μ L实施例2制备得到的eotaxin特异的siRNA微乳(ESM，40 μ g/mL)涂于鼠耳，每8h给药一次，共给药三次，观察ESM对小鼠过敏皮肤中eotaxin表达的影响。除给药组外，另设两组对照组正常组和疾病模型组，采用real-time PCR法检测小鼠皮肤中eotaxin mRNA的 表达(见图6-A)，western blotting法检测eotaxin蛋白的分泌情况(见图6-B)，GAPDH为管家基因。检测结果表明，ESM可以显著抑制小鼠A⑶模型皮肤组织中eotaxin的上调，从在体的角度证明了其透皮效果和治疗效果。
权利要求
1.一种siRNA微乳载体，由油相基质、乳化剂、助乳化剂和水相基质组成，各组分的重量百分比如下油相基质 40-70%乳化剂10-20%助乳化剂 10-20%水相基质 5-20%， 其中的油相基质选自辛酸甘油三酯或癸酸甘油三酯； 其中的乳化剂是聚甘油-6双异油酸酯； 其中的助乳化剂是聚乙二醇-8辛酸酯或聚乙二醇-8癸酸酯； 其中的水相基质是无酶水； 微乳为W/0型，siRNA包封在水相中。
2.根据权利要求I所述的siRNA微乳载体，其特征在于，各组分的重量百分比如下油相基质 50-60%乳化剂 15-20%助乳化剂 15-20%水相基质 10-15%。
3.根据权利要求I或2所述的siRNA微乳载体，其特征在于，其配方及配比具体如下油相基质辛酸/癸酸甘油三酯5.6 g乳化剂聚甘油-6双异油酸酯1.7 g助乳化剂聚乙二醇-8辛酸/癸酸酯 1.7 g水相基质无酶水I mL共10 g。
4.一种如权利要求I所述的siRNA微乳载体制备方法，其特征在于，包括如下步骤油相基质及乳化剂、助乳化剂于烘箱中，60-90°C烘烤6-10小时；按比例称取油相和乳化剂、助乳化剂，使用搅拌器搅拌混合5-20分钟，使混匀，在搅拌状态下逐渐滴加溶有siRNA的水相，体系开始呈现乳浊并有粘度增加现象，浊度逐渐降低，恒速搅拌至完全澄清，为均一无色澄清液体，即成siRNA微乳。
5.根据权利要求4所述的siRNA微乳载体制备方法，其特征在于油相基质及乳化剂、助乳化剂于烘箱中，75°C烘烤8小时；金属容器于烘箱中180°C烘烤3小时；塑料、胶皮及其他不耐高温的材料于0. 1% DEPC水中浸泡24小时；一次性材料使用无酶产品。
6.根据权利要求4或5所述的siRNA微乳载体制备方法，其特征在于制备得到的siRNA微乳于4°C或_20°C储存备用。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，目前尚无siRNA的经皮给药的给药模式，因为缺乏经皮给药的转运系统。本发明的目的是提供一种可将特定疾病相关基因的siRNA包封于其中的经皮转运系统——siRNA微乳载体，该siRNA微乳载体不仅保护了包封其中的siRNA的稳定性而且透皮能力强。本发明的另一目的是提供该siRNA微乳载体制备方法。本发明提供一种siRNA微乳载体其油相∶乳化剂∶助乳化剂∶水相的比例为40-70％∶10-20％∶10-20％∶5-20％。本发明siRNA微乳载体可将大分子siRNA包封于水相之中，经皮及粘膜将siRNA带入皮肤和粘膜，解决了siRNA经皮转运的问题，同时大提高了siRNA的稳定性，可用于siRNA药物的开发及科研应用。
文档编号A61K47/34GK102805726SQ20121008724
公开日2012年12月5日 申请日期2012年3月29日 优先权日2012年3月29日
发明者胡晋红, 彭程 申请人:中国人民解放军第二军医大学