专利名称：树状大分子修饰多壁碳纳米管复合材料负载阿霉素的制备的制作方法
技术领域：
本发明属于阿霉素靶向运输领域，特别涉及一种树状大分子修饰多壁碳纳米管复合材料负载阿霉素的制备方法。
背景技术：
碳纳米管(CNTs)是由单层或 层碳石墨片层卷曲而成的ー种新型纳米碳材料，分为单壁碳纳米管(SWCNTs)和多壁碳纳米管(MWCNTs)。CNTs特殊的管状结构使其具有独特的力学、光学、电磁特性、场发射性和热学特性，并在高强度复合材料、场发射装置、传感器、探測器等诸多领域都有潜在的应用前景。研究表明，CNTs可通过被动扩散和主动胞吞作用进入细胞而不产生毒性(Yang ff. , Thordarson P. , Gooding J. J. , Ringer S. P. , BraetR ,Carbon nanotubes for biological and biomedical applications. Nanotechnology,2007. 18 :412001.),而且CNTs中碳原子以SP2杂化作用为主，其表面由大量芳香结构构成，能与多种无机和有机分子以共价或非共价形式结合。CNTs独特的中空结构使其比球形纳米载体有更大的比表面积，更高的药物装载量(李杉杉，何华，焦庆才，碳纳米管在药物和基因转运领域的应用.化学进展，2008. 20(11) :1798-1803)。经功能改性后的CNTs亲水性好，生物相容性好，并具有较长的血液循环时间，可通过代谢安全清除(Bianco A. ,KostarelosK.，Partiaos C. D.，Prato M.，Biomeaical applications of functionalisea carbonnanotubes. Chemical Communications, 2005 (5) :571-577)。因此 CNTs 作为载体可以装载药物、固定化酶、输送DNA等，在功能材料、生物技术和生物医学领域得到越来越广泛的应用。阿霉素(DOX)是临床常用抗肿瘤药物，广泛用于白血病、肺癌、恶性淋巴癌、软组织肿瘤、骨肉瘤、膀胱癌、乳腺癌、甲状腺癌等的化疗。由于DOX可以嵌入DNA而抑制核酸的合成，因此其可对机体产生广泛的生物化学效应，具有強烈的细胞毒性。但是在传统化疗过程中，由于缺乏选择性，在杀死癌细胞的同吋，它也对正常组织产生很大的毒害，其临床最常见的毒副作用就是心脏毒性。最近的研究表明，CNTs可以通过JI-Ji堆积作用负载阿霉素，而且这种负载是PH依赖性的，可以在pH值低的环境下释放药物分子。而肿瘤组织与正常组织相比具有微弱的酸性，因此，CNTs的这种负载作用可以有效地将药物分子释放在肿瘤部位，从而減少药物对正常组织和器官的毒副作用(Liu Z. , Sun X.，NaKayama-Ratchiord N.，Dai H.，Supramolecular chemistry on water-soluble carbonnanotubes for drug loading and delivery. ACS Nano, 2007. I (I) :50-56) 另外结合CNTs在近红外激光的照射下可引发药物的控制释放以及其自身产热的特性，可实现对肿瘤细胞的革巴向化疗和热疗(Chakravarty P. ,Marches R. ,Zimmerman N. S. , Swafford A. D. E.，Bajaj P.，Musselman I. H.，Pantano P.，Draper R. K.，Vitetta E. S.，Thermal ablationof tumor cells with antibody-functionalized single-walled carbon nanotubes.Proceedings of the National Academy of Sciences，2008. 105(25) :8697-8702)。PAMAM树状大分子所具备的单分散性、内部空腔结构和经修饰后具有的良好生物相容性等特点，使其可以有效地修饰、组装及生物功能化无机纳米材料，广泛应用于多功能分子成像，以及肿瘤的早期诊断和治疗。Shi等(Shi X.，Wang S. H.，Shen M.，Antwerp M. E. , Chen X. ,Li C. , Petersen E. J. , Huang Q. , Weber Jr ff. J. , BakerJr J.R. , Multifunctional dendrimer-modified multiwalled carbon nanotubes Synthesis, characterization, and in vitro cancer cell targeting and imaging.Biomacromolecules, 2009. 10(7) :1744-1750)利用多功能化第五代PAMAM树状大分子修饰MWCNTs，不仅提高了 MWCNTs的分散性和生物相容性，同时还可以连接荧光基团以及靶向基团，以实现荧光示踪和增加组织特异性，并成功地用于相关癌细胞的靶向成像。
然而，检索国内外有关DOX靶向运输方面的文献和专利表明以多功能化树状大分子修饰的MWCNTs为载体材料，通过JI-Ji堆积作用负载阿霉素，达到靶向、pH控释和荧光成像的多重功效方面的研究还没有报道。它不仅可以实现癌细胞的成像，还可以选择性地杀死癌细胞，而对正常组织和细胞不产生毒害。因此这一方法将拓展DOX在临床医学上的应用范围。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种树状大分子修饰多壁碳纳米管复合材料负载阿霉素的制备方法，该方法制备过程简单，实验条件为常温常压，易于操作，所采用的制备程序可用于制备其它功能化树状大分子的制备，具有很好的实用价值。本发明的一种树状大分子修饰多壁碳纳米管复合材料负载阿霉素的制备方法，包括(I)将11. 92-17. 88mg的末端为氨基的第五代聚酰胺-胺树状大分子G5_NH2溶解于4-6mL的DMSO溶液中，并逐滴加入2_3mL含0. 893-1. 340mg的异硫氰酸荧光素FI的DMSO溶液，在室温下搅拌反应12-24h得到G5-FI ；(2)将I. 012-1. 653mg的叶酸FA溶解在5-7. 5mL的DMSO溶液中，然后加入
4.393-6. 590mg的I-こ基-(3- ニ甲基氨基丙基)碳ニ亚胺盐酸盐，在室温下搅拌反应2_4h后，逐滴加入到上述G5-FI的DMSO溶液当中，搅拌反应1-3天，透析反应液，将反应溶剂DMS0、过量的反应物以及反应副产物除去，最后将产物的水溶液冷冻干燥得到G5-FI-FA ；(3)将40. 00-60. OOmg的羧基化的多壁碳纳米管MWCNTs溶解在20_30mL水中，然后加入32. 39-48. 59mg的I-こ基-(3- ニ甲基氨基丙基)碳ニ亚胺盐酸盐，在室温下搅拌反应2-4h后，然后加入5-7. 5mL含上述9. 17-13. 76mg的G5-FI-FA的水溶液，搅拌反应1_3天得到 MWCNT-G5-FI-FA ；(4)在步骤(3)的反应液中加入20-30ii L三こ胺，搅拌混合20_40min后，再加入13. 44-20. 16 ii L的こ酸酐，室温下搅拌反应12-24h，透析反应液，将过量的反应物以及反应副产物除去，最后将产物的水溶液冷冻干燥得到MWCNT-G5-FI-FA-Ac ；(5)称取16-24mg上述MWCNT-G5-FI-FA_Ac并分散在超纯水中，配成2mg/mL的分散液，放在超声波清洗仪中超声分散均匀；然后加入等体积的2mg/mL的盐酸阿霉素DOX的水溶液；然后调节混合溶液PH至9. 5，在避光的条件下，持续搅拌12-24h，使DOX与MWCNT-G5-FI-FA-Ac充分结合；离心，移去上清液，再用pH为9. 5的水清洗沉淀物，直至上清液为无色，即得载药复合物D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac。
所述步骤(2)和(4)中的透析具体エ艺为采用透析袋，先在pH为7. 4的PBS缓冲液中透析，再在蒸馏水中透析。所述步骤(5)中MWCNT-G5-FI-FA-Ac 和 DOX 的质量比为 I : 1，MWCNT-G5-FI_FA-Ac和DOX的浓度均为lmg/mL。所述步骤(5)中采用0. IM的氢氧化钠溶液调节pH至9. 5。本发明中将FI接枝到末端为氨基的第五代聚酰胺-胺树状大分子表面，FI采用在快速搅拌下逐滴滴加的方式加入到树状大分子溶液中，以保证树状大分子接枝FI的均一性。本发明中使用5-10倍量EDC活化羧基和氨基的反应，增强反应活性。以こ酰化树状大分子表面剰余的氨基以降低其表面电势，提高材料的生物相容性。以三こ胺保持溶液的碱性环境保证こ酰化反应的顺利进行。对多功能树状大分子修饰的MWCNTs负载DOX的制备、药物缓释及肿瘤靶向治疗研究，进行了 UV-Vis(紫外可见光谱)、TEM(透射电子显微镜)、TGA(热失重分析)、MTT(细胞活力分析)和激光共聚焦显微镜分析(I)1H NMR 测试结果以1H NMR测试表征多功能化树状大分子的修饰，结果表明已经成功合成了多功能树状大分子G5-FI-FA和G5-FI。平均每个树状大分子表面健合的FI和FA的数量分别为5.0和4. 6。參见
I。(2) UV-Vis 测试结果FA在280nm处有较强的吸收峰，FI在501nm处有较强的吸收峰，UV-Vis图谱验证了这些基团修饰在了树状大分子上，參见附图2和3。从图2中可以看出，G5-FI在501nm处有吸收峰，同时在280nm有一个较小的吸收，而G5-FI-FA在280nm和501nm处都有较强的吸收峰，与G5-FI相比，280nm处的吸收更加高，表明FI和FA分子已经成功的连接到了树状大分子上。从图3可以看出，MWCNT-G5-FI-Ac在501nm处有吸收峰，MWCNT-G5-FI-FA_Ac在280nm和501nm处都有较强的吸收峰，与MWCNT-G5-FI_Ac相比280nm处的吸收更加高，表明G5-FI-FA分子已经成功的连接到了 MWCNTs上。(3) TGA测试结果用TGA分析对功能化树状大分子在MWCNTs上的接枝量进行了分析，參见附图4。以566 °C作为计算热重损失的温度，在此温度下，MWCNTs仅有5 %的重量损失，而MWCNT-G5-FI-Ac和MWCNT-G5-FI-FA_Ac的热重损失分别为22%和22. 2 %。所以大约有17%的重量损失来自于修饰在MWCNTs表面的G5-FI-Ac和G5_FI-FA_Ac。(4) TEM 表征为了验证树状大分子的修饰化作用对MWCNTs结构没有影响，对MWCNT-G5-FI-FA-Ac的形貌做了 TEM表征，參见附图5。从图中可以看出，MWCNTs经过多功能化树状大分子修饰后仍然是中空的管状结构，即修饰化作用对MWCNTs的形貌不产生影响。(5)药物释放结果分别在pH 5. 4的醋酸盐缓冲液和pH 7. 4的磷酸盐缓冲液中研究DOX/MWCNT-G5-FI-FA-Ac和D0X/MWCNT-G5-FI_Ac复合物中DOX的释放行为，其释放曲线參见附图6。结果表明D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac和D0X/MWCNT-G5-FI_Ac载药复合材料都表现出明显的pH控释效果。对于D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac来说，在pH = 5. 4和pH = 7. 4的缓释液中12h后药物的释放量分别为66. 7%和12. I %。缓释24h后，前者有77. 4%的DOX释放，而后者只有13. 5%的释放。因此pH值对DOX的释放存在较大的影响，pH值比较低吋，DOX水溶性好，更容易从多功能化树状大分子修饰的MWCNTs上脱离下来，可以达到pH控制释放的目的(6) MTT细胞毒性分析用KB 细胞来研究 D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac 和 D0X/MWCNT-G5-FI_Ac 的药效。将不同 DOX 浓度(0. 5，1，2，4 ii M)的自由药物 DOX、D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac 复合物和 DOX/MWCNT-G5-FI-Ac复合物与KB细胞共培养48h后，用MTT法检测细胞的活力，參见附图7。从图中可以看出，相对于未处理的KB细胞，自由药物D0X、D0X/MWCNT-G5-FI-Ac复合物和DOX/MWCNT-G5-FI-FA-Ac复合物对KB细胞都具有很大的毒性，且它们之间DOX的药效并没有太大的差別。同时所得到的未载药MWCNT-G5-FI-FA-Ac和MWCNT-G5-FI_Ac载体材料的细胞毒性MTT分析发现(參见附图8，其中多功能化MWCNTs的浓度取的是当DOX浓度达到1，2，
4ii M时MWCNTs的浓度)，这两个材料本身是无毒的(和对照相比，p值> 0. 05)，表明DOX/MWCNT-G5-FI-FA-Ac和D0X/MWCNT-G5-FI_Ac对KB细胞的药效只与DOX药物有夫，而与载体材料无关。(7) MTT药物靶向分析将D0X/MWCNT-G5-FI-Ac 和 D0X/MWCNT-G5-FI-FA_Ac (D0X 浓度为 I y M)与KB-HFAR (高叶酸受体表达)和KB-LFAR (低叶酸受体表达)细胞共培养Ih后，倒掉含有材料的培养基，用PBS缓冲液洗三次后再加入对应的不含材料的培养基接着培养48h，用MTT方法来检测细胞的活力，參见附图9。用D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac处理过的KB-HFAR细胞的细胞活力大大减少(大约是对照细胞活力的67% ) (p值< 0. 05)。相反地,不含FA的D0X/MWCNT-G5-FI-Ac复合物处理过的KB-HFAR细胞大约仍有90%存活。同时，大约96%的KB-LFAR细胞在D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac 处理后仍然存活。这表明 D0X/MWCNT-G5-FI-FA_Ac可以靶向地抑制表面高表达叶酸受体的癌细胞的生长。(8)激光共聚焦显微镜分析异硫氰酸荧光素连接到第五代树状大分子表面，是为了当DOX/MWCNT-G5-FI-FA-Ac被细胞摄入时，可以通过荧光成像进行跟踪检测，观察药物和载体分子的细胞内吞作用。由于药物分子DOX本身可以发红色荧光，而我们的载体材料上含有荧光素(FI)可以发绿色荧光，因此我们进ー步用激光共聚焦显微镜观察载药材料在不同细胞(KB-HFAR 和 KB-LFAR)中的内吞情况。将 D0X/MWCNT-G5-FI-FA_Ac (D0X 浓度为 I U M)与KB-HFAR和KB-LFAR细胞共培养后Ih后，倒掉含有材料的培养基，用PBS洗三次后再加入对应的不含材料的培养基接着培养4h，用激光共聚焦显微镜来观察细胞对药物的内吞效果，只有那些KB-HFAR有较强的荧光信号，这说明D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac复合物已经靶向进入到细胞内部。相反地，在相同条件下，KB-LFAR却没有明显的荧光信号。这说明，DOX/MWCNT-G5-FI-FA-Ac具有很好的靶向效果。本发明充分利用PAMAM树状大分子表面众多的功能基团，通过共价键对其进行修饰与功能化，连接荧光成像分子和靶向分子，再修饰到MWCNTs表面，不仅提高碳纳米管的水溶液分散性和生物相容性，还赋予碳纳米管荧光成像和靶向性。通过荧光分子成像可以进行跟踪检测，观察药物和载体分子的细胞内吞作用。通过靶向分子，可以将药物定向输送到癌细胞。同时利用MWCNTs与DOX的JI-Ji堆积作用实现DOX的高效负载和肿瘤微酸性环境释放的优点，进ー步实现药物的癌细胞靶向输送和治疗。有益.效果(I)本发明的制备过程简单，实验条件为常温常压，易于操作，所采用的制备程序可用于制备其它功能化树状大分子的制备，具有很好的实用价值；(2)本发明实现了 DOX药物的癌细胞靶向输送，可以有效的減少其毒副作用；同时利用MWCNTs与DOX的JI-Ji堆积作用实现DOX的高效负载和肿瘤微酸性环境释放，具有很好的实用价值；(3)本发明利用荧光素为荧光标记分子，进而观察药物和载体材料的细胞内吞作 用。
图I为本发明制备的多功能树状大分子G5-FI (a)和G5_FI_FA(b)的1H NMR图谱；图2为本发明制备的多功能树状大分子G5-FI (曲线a)和G5_FI_FA(曲线b)的UV-Vis 图谱；图3 为 MWCNTs (曲线 a)、MWCNT-G5-FI_Ac (曲线 b)和 MWCNT-G5-FI-FA_Ac (曲线c)的UV-Vis图谱；图4 为 MWCNTs (曲线 a)、MWCNT-G5-FI-FA-Ac (曲线 b)和 MWCNT-G5-FI_Ac (曲线c)的TGA分析；图5 为 MWCNT-G5-FI-FA-Ac 的 TEM 图片；图6为在不同pH值条件下，DOX在树状大分子修饰化MWCNTs上的缓释曲线；图7为不同浓度DOX以及DOX多功能化碳纳米管复合物处理的KB细胞活力的MTT分析；图8为未载药的多功能化碳纳米管的KB细胞活力MTT分析；图9 为对照 KB-HFAR 细胞(a)，用 D0X/MWCNT-G5-FI-FA_Ac 处理过的 KB-HFAR 细胞(b)和 D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac 处理过的 KB-LFAR 细胞(c)以及 D0X/MWCNT-G5-FI_Ac 处理过的KB-HFAR细胞(d)的活力图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进ー步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例I 将G5-NH2 (11. 92mg)溶解于4mL的DMSO溶液中，在搅拌的情况下，逐滴加入2mL含FI (0. 893mg)的DMSO溶液。该反应在室温下搅拌12_24h后，得到未纯化的G5-FI的DMSO溶液。将FA(I. 012mg)溶解在5mL的DMSO溶液中，然后加入EDC(4. 393mg)，在室温条件下搅拌反应2h后，将混合溶液逐滴加入到未纯化的G5-FI的DMSO溶液当中，搅拌反应I天，最后将反应溶液放入透析袋(MWCO= 14，000)中，通过透析法将反应溶剂DMS0、过量的反应物以及反应副产物除去，先用PBS缓冲液透析3次，毎次2L，再用蒸馏水透析5次，毎次2L，最后将产物的水溶液冷冻干燥得到G5-FI-FA ；将羧基化的MWCNTs (40. OOmg)溶解在20mL水中，然后加入EDC(32. 39mg)，在室温条件下搅拌反应2h后，加入5mL含G5-FI-FA(9. 17mg)的水溶液，搅拌反应2天。再加入2011し三こ胺，搅拌混合301^11后，再加入13. 44 ii Lこ酸酐，室温下搅拌反应15h。最后将反应溶液放入透析袋(MWC0 = 50，000)中，通过透析法将过量的反应物以及反应副产物除去，先用PBS缓冲液透析3次，毎次2L，再用蒸馏水透析5次，毎次2L，最后将产物的水溶液冷冻干燥得到MWCNT-G5-FI-FA-Ac ；
产物G5-FI-FA的1H NMR图谱如附图lb，结果表明平均每个树状大分子表面接枝5.0个FI分子和4. 6个FA分子。同时UV-Vis图谱(见附图2，曲线b)也可以看到FI的特征吸收峰在501nm，FA的特征吸收峰在280nm，说明FI和FA成功接枝在了树状大分子表面。从产物MWCNT-G5-FI-FA-Ac的UV-Vis图谱(见附图3，曲线c)也可以看到FI的特征吸收峰在501nm，FA的特征吸收峰在280nm，说明G5-FI-FA成功地接枝到多壁碳纳米管表面。用TGA对多功能化树状大分子在MWCNTs表面的接枝量进行了分析，參见附图4b。以566°C作为计算热重损失的温度，在此温度下，MWCNTs仅有5%的重量损失，而MWCNT-G5-FI-FA-Ac的热重损失为22.2%。所以大约有17 %的重量损失来自于修饰在MWCNTs 表面的 G5-FI-FA-Ac。进ー步对MWCNT-G5-FI-FA-Ac做了 TEM表征，參见附图5。从图中可以看出，MWCNTs经过多功能化树状大分子修饰后仍然是中空的管状结构，即修饰化作用没有改变MWCNTs的形貌。实施例2将G5-NH2 (17. 88mg)溶解于6mL的DMSO溶液中，在搅拌的情况下，逐滴加入3mL含FI (I. 340mg)的DMSO溶液。该反应在室温下搅拌24h后，得到未纯化的G5-FI的DMSO溶液。将FA(I. 653mg)溶解在7. 5mL的DMSO溶液中，然后加入EDC(6. 590mg)，在室温条件下搅拌反应4h后，将混合溶液逐滴加入到未纯化的G5-FI的DMSO溶液当中，搅拌反应3天，最后将反应溶液放入透析袋(MWCO= 14，000)中，通过透析法将反应溶剂DMS0、过量的反应物以及反应副产物除去，先用PBS缓冲液透析3次，毎次2L，再用蒸馏水透析5次，毎次2L，最后将产物的水溶液冷冻干燥得到G5-FI-FA ；将羧基化的MWCNTs (60. OOmg)溶解在30mL水中，然后加入EDC(48. 59mg)，在室温条件下搅拌反应3h后，加入7. 5mL含G5-FI-FA(9. 17-13. 76mg)的水溶液，搅拌反应3天。再加入30 ii L三こ胺，搅拌混合40min后，再加入20. 16 u Lこ酸酐，室温下搅拌反应24h。最后将反应溶液放入透析袋(MWC0 = 50，000)中，通过透析法将过量的反应物以及反应副产物除去，先用PBS缓冲液透析3次，毎次2L，再用蒸馏水透析5次，毎次2L，最后将产物的水溶液冷冻干燥得到MWCNT-G5-FI-FA-Ac ；产物G5-FI-FA的1H NMR图谱(附图Ib)结果表明平均每个树状大分子表面接枝
5.OfFI分子和4. 6个FA分子。同时UV-Vis图谱也可以看到FI的特征吸收峰在501nm，FA的特征吸收峰在280nm(见附图2，曲线b)。同时，产物MWCNT-G5-FI-FA_Ac的UV-Vis图谱(见附图3,曲线c)也可以看到FI的特征吸收峰在501nm,FA的特征吸收峰在280nm,说明G5-FI-FA成功地接枝到多壁碳纳米管表面。 实施例3 分别称取MWCNT-G5-FI-Ac 和 MWCNT-G5-FI-FA_Ac (20. Omg)并分散在超纯水中，配成2mg/mL的分散液,放在超声波清洗仪中超声分散均勻。然后加入等体积的2mg/mL的DOX的水溶液，使DOX和MWCNTs的质量比为I : 1，浓度均为lmg/mL。然后用0. IM氢氧化钠水溶液调节pH为9. 5。在避光的条件下，持续搅拌混合溶液24h，使DOX与MWCNT-G5-FI_Ac或MWCNT-G5-FI-FA-Ac充分结合。之后，将混合溶液离心，移去上清液，再用pH = 9. 5的水清洗沉淀物，直至上清液为无色，收集所有的洗脱的上清液，通过计算洗掉的DOX的量来推算上载到多功能化碳纳米管上的DOX的百分比，其包封率和载药量均为98%。实施例4分别选择pH = 5. 4的醋酸盐缓冲液和pH = 7. 4的磷酸盐缓冲液作为缓释媒介，分析DOX在两种pH环境下的释放性能。首先分别称取MWCNT-G5-FI-Ac和MWCNT-G5-FI-FA-Ac (2. Omg)，分别加入2mL的醋酸盐缓冲液(pH = 5. 4)或PBS缓冲液(pH= 7.4)。将分散好的溶液置入透析袋中(分子截留量为14，000)，然后把装有样品的透析袋置入装有13mL对应缓冲液的小瓶子中，瓶子中溶液总体积为15mL，每个样品三个平行。在恒温(37°C )摇床，90转每分钟下测试其释放性能。对于所有的缓释样品，根据设计好的时间间隔(0. 5，1，2，4，6，9，12，24，48和7211)，在每个时间点从样品瓶中取出5111し缓释液，再加入5mL新的缓冲液，保持溶液的体积不变。根据释放出来的DOX在481nm处的吸光值以及DOX在两种缓冲液下的浓度-吸光值标准曲线，求出DOX在不同的时间点累计释放的总量，分析药物的释放动力学特征。其释放曲线參见附图6。从图中可以看出，无论是带叶酸的DOX/MWCNT-G5-FI-FA-Ac还是不带叶酸的D0X/MWCNT-G5-FI_Ac的载药复合材料都表现出明显的pH控释效果。对于D0X/MWCNT-G5-FI-Ac来说，在pH = 5. 4和pH = 7. 4的缓释液中，12h后药物的释放量分别为68. 5%和13. I %。缓释24h后，前者有80. 4%的DOX释放，而后者只有14. 3%的释放。对于D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac来说，在pH = 5. 4和pH = 7. 4的缓释液中12h后药物的释放量分别为66. 7%和12. I %。缓释24h后，前者有77. 4%的DOX释放，而后者只有13. 5%的释放。因此pH值对DOX的释放存在较大的影响，pH值比较低吋，DOX水溶性好，更容易从多功能化树状大分子修饰的MWCNTs上脱离下来，可以达到pH控制释放的目的，实现肿瘤组织的微酸性环境定向释放。实施例5先收集对数期细胞，加入到96孔细胞培养板，每孔加入200 U L含细胞的培养基使细胞密度至8000/孔，边缘孔用无菌PBS缓冲液填充；然后在细胞培养箱(5% CO2, 370C )中孵育24h，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)；第二天倒掉培养基，然后加入180 UL培养基，再加入含有不同浓度的DOX、D0X/MWCNT-G5-FI-Ac或D0X/MWCNT-G5-FI-FA_Ac的20 u LPBS缓冲液(各个材料以DOX为基准设为4个浓度，即0. 5，1，2，4 y M)。同时设计未载药MWCNT-G5-FI-FA-Ac和MWCNT-G5-FI_Ac材料对照组，每孔加含有相应浓度的材料的PBS缓冲液20 u L，再加培养基180 u L，以验证材料本身对细胞生长的影响。所有的试验组和对照组均设3个孔为ー个平行组；在培养箱中孵育48h后，用倒置相差显微镜对各组细胞形态进行观察。然后每孔加入20 ii L的MTT溶液，继续培养4h，使细胞与MTT充分反应。最后终止培养，小心吸去孔内培养液，在每孔加入200 ii L DMSO，置摇床上避光低速振荡15min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪492nm处测量各孔的MTT甲臜溶液吸光值。统计学分析借助于ANOVA方法实施。在所有的评估中，认为P < 0. 05时，样品之间的差异具有统计学显著性。分析结果以细胞存活率来显示D0X、D0X/MWCNT-G5-FI-Ac和D0X/MWCNT-G5-FI-FA_Ac对KB细胞的毒性作用。 MTT法检测处理后细胞的活力，參见附图7。从图中可以看出，相对于未处理的 KB 细胞，纯药 DOX、D0X/MWCNT-G5-FI-Ac 和 D0X/MWCNT-G5-FI-FA_Ac 对 KB 细胞都具有很大的毒性，且它们之间DOX的药效并没有大大的差別。同时我们所得到的未载药MWCNT-G5-FI-FA-Ac和MWCNT-G5-FI_Ac材料的MTT分析可知(參见附图8，其中多功能化MWCNTs的浓度取的是当DOX浓度达到1，2，4 ii M时MWCNTs的浓度)，这两个材料本身是无毒的(和对照相比，P 值> 0. 05)，表明 D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac 和 D0X/MWCNT-G5-FI_Ac 对KB细胞的药效只与其负载的DOX有夫。实施例6收集对数期细胞，加入到96孔细胞培养板，每孔加入200 U L含细胞的培养基(细胞8000/孔)，其中KB-HFAR组使用正常不含有叶酸的培养基，KB-LFAR组使用含有叶酸的培养基(在细胞培养板中叶酸终浓度为2. 5iiM);然后在细胞培养箱(5% CO2, 37 0C )中孵育24h，倒掉原有的培养基后，加入180 u L对应培养基，再加入含有10 ii M DOX的DOX/MWCNT-G5-FI-Ac 或 D0X/MWCNT-G5-FI-FA_Ac 的 20 y L PBS 缓冲液(以 DOX 为基准的终浓度为lyM)。同时设计培养PBS缓冲液对照组，其培养基为不含叶酸的培养基。所有的试验组和对照组均设3个孔为ー个平行组；在培养箱中孵育Ih后，倒掉含有材料的培养基，用PBS缓冲液洗三次后再加入对应的不含材料的培养基继续培养48h，然后每孔加入20 ii L的MTT溶液，继续培养4h，做MTT测试，以PBS缓冲液处理的细胞为对照，测试材料组细胞的成活率。附图9为未处理的KB-HFAR细胞和用D0X/MWCNT-G5-FI_Ac和DOX/MWCNT-G5-FI-FA-Ac 处理过的 KB-HFAR 细胞以及 D0X/MWCNT-G5-FI-FA_Ac 处理过的KB-LFAR细胞的细胞活力MTT分析。从图中可以清楚地看到，用D0X/MWCNT-G5-FI_Ac处理过的KB-HFAR细胞的细胞活力大大减少(大约是对照细胞活力的67% ) (p值< 0. 05)。相反地，大约90 %的D0X/MWCNT-G5-FI-Ac处理过的KB-HFAR细胞仍然存活。同时，大约96 %的KB-LFAR细胞在D0X/MWCNT-G5-FI-FA_Ac处理后仍然存活。这个结果表明，DOX/MWCNT-G5-FI-FA-Ac可以靶向地抑制表面表达叶酸受体的癌细胞的生长，而这种靶向作用是由癌细胞表面的叶酸受体介导的。用激光共聚焦显微镜观察药物在不同细胞(KB-HFAR和KB-LFAR)中的内吞情况实验使用直径为6cm共聚焦显微镜培养皿培养细胞。即取对数期细胞，每个培养皿加入2000 u L含细胞的培养基(细胞20000/培养皿)，其中KB-HFAR组使用不含有叶酸的培养基，KB-LFAR组使用含有叶酸的培养基(在细胞培养皿中叶酸终浓度为2. 5 PM);然后在5%C02，37°C下孵育24h，倒掉原有的培养基后，加入1800ii L对应培养基，再加入含有IOyMDOX的D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac的200 u L PBS溶液(以DOX为基准的终浓度为I y M)。在培养箱中孵育Ih后，倒掉含有材料的培养基，用PBS洗三次后再加入对应的培养基接着培养4 h，然后用激光共聚焦显微镜观察药物在各组细胞中的内吞情況，只有那些KB-HFAR有较强的荧光信号，这说明D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac复合物已经靶向进入到细胞内部。相反地，在相同条件下，KB-LFAR却没有明显的荧光信号。这说明，D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac具有很好的靶向效果。对比例I将G5-NH2 (11. 82mg)溶解于4mL的DMSO溶液中，在搅拌的情况下，逐滴地加入2mL含FI (0. 885mg)的DMSO溶液。该反应在室温下搅拌24h。最后将反应溶液放入透析袋(MWC0=14, 000)中，通过透析法将反应溶剂DMS0、过量的反应物以及反应副产物除去，先用PBS缓冲液透析4次，毎次2L，再用蒸馏水透析4次，毎次2L，最后将产物的水溶液冷冻干燥得到 G5-FI。将羧基化的MWCNTs (40. OOmg)溶解在20mL水中，然后加入EDC(32. 39mg)，在室温条件下搅拌反应3h后，加入5mL含G5-FI(8. 5mg)的水溶液，搅拌反应3天。之后，在反应混和液中加入20 ii L三こ胺，搅拌混合30min后，再加入13. 44 u Lこ酸酐，室温下搅拌反应24h。最后将反应溶液放入透析袋(MWC0 = 50，000)中，通过透析法将过量的反应物以及反应副产物除去，最后将产物的水溶液冷冻干燥得到MWCNT-G5-FI-Ac。产物G5-FI的1H NMR图谱如附图la，结果表明平均每个树状大分子表面接枝5. 0个FI分子。同时UV-Vis图谱(见附图2a)也可以看到FI的特征吸收峰在501nm，说明FI成功接枝在了树状大分子表面。产物MWCNT-G5-FI-Ac的UV-Vis图谱也可以看到FI的特征吸收峰在501nm，说明G5-FI成功接枝到MWCNTs表面。用TGA对多功能化树状大分子在MWCNTs表面的接枝量进行 了分析，參见附图4c。以566°C作为计算热重损失的温度，在此温度下，MWCNTs仅有5%的重量损失，而MWCNT-G5-FI-Ac的热重损失为22%。所以大约有17%的重量损失来自于修饰在MWCNTs表面的 G5-FI-Ac。
权利要求
1.一种树状大分子修饰多壁碳纳米管复合材料负载阿霉素的制备方法，包括 (1)将11.92-17. 88mg的末端为氨基的第五代聚酰胺-胺树状大分子G5_NH2溶解于4-6mL的DMSO溶液中，并逐滴加入2_3mL含0. 893-1. 340mg的异硫氰酸荧光素FI的DMSO溶液，在室温下搅拌反应12-24h得到G5-FI ； (2)将I.012-1. 653mg的叶酸FA溶解在5_7. 5mL的DMSO溶液中，然后加入4. 393-6. 590mg的I-こ基-(3- ニ甲基氨基丙基)碳ニ亚胺盐酸盐，在室温下搅拌反应2_4h后，逐滴加入到上述G5-FI的DMSO溶液当中，搅拌反应1-3天，透析反应液，最后将产物的水溶液冷冻干燥得到G5-FI-FA ； (3)将40.00-60. OOmg的羧基化的MWCNTs溶解在20_30mL水中，然后加入32. 39-48. 59mg的I-こ基-(3- ニ甲基氨基丙基)碳ニ亚胺盐酸盐，在室温下搅拌反应2_4h后，然后加入5-7. 5mL含上述9. 17-13. 76mg的G5-FI-FA的水溶液，搅拌反应1_3天得到MWCNT-G5-FI-FA ； (4)在步骤(3)的反应液中加入20-30iiL三こ胺，搅拌混合20-40min后，再加入13. 44-20. 16 u L的こ酸酐，室温下搅拌反应12_24h，透析反应液，最后将产物的水溶液冷冻干燥得到 MWCNT-G5-FI-FA-Ac ； (5)称取16-24mg上述MWCNT-G5-FI-FA-Ac并分散在超纯水中，配成2mg/mL的分散液，然后加入等体积的2mg/mL的盐酸阿霉素DOX的水溶液；然后调节混合溶液pH至9. 5,在避光的条件下，持续搅拌12_24h ;离心，移去上清液，再用pH为9. 5的水清洗沉淀物，直至上清液为无色，即得载药复合物D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac。
2.根据权利要求I所述的ー种树状大分子修饰多壁碳纳米管复合材料负载阿霉素的制备方法，其特征在干所述步骤(2)和(4)中的透析具体エ艺为采用透析袋，先在pH为7.4的PBS缓冲液中透析，再在蒸馏水中透析。
3.根据权利要求I所述的ー种树状大分子修饰多壁碳纳米管复合材料负载阿霉素的制备方法，其特征在于所述步骤(5)中MWCNT-G5-FI-FA-Ac和DOX的质量比为I : 1，MWCNT-G5-FI-FA-Ac 和 DOX 的浓度均为 lmg/mL。
4.根据权利要求I所述的ー种树状大分子修饰多壁碳纳米管复合材料负载阿霉素的制备方法，其特征在干所述步骤(5)中采用0. IM的氢氧化钠溶液调节pH至9. 5。
全文摘要
本发明涉及一种树状大分子修饰多壁碳纳米管复合材料负载阿霉素的制备方法，包括(1)制备G5-FI；(2)制备G5-FI-FA；(3)制备MWCNT-G5-FI-FA；(4)制备MWCNT-G5-FI-FA-Ac；(5)制备载药复合物DOX/MWCNT-G5-FI-FA-Ac。本发明制备过程简单，实验条件为常温常压，易于操作，所采用的制备程序可用于制备其它功能化树状大分子的制备，具有很好的实用价值。
文档编号A61K47/04GK102614522SQ20121010934
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月13日 优先权日2012年4月13日
发明者史向阳, 温诗辉 申请人:东华大学