专利名称：二苯乙烯苷抑制肿瘤血管生成的新作用及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ニ苯こ烯苷抑制肿瘤血管生成的新作用，及其在制备抗癌药物中的应用，属于化合物药理作用技术领域。
背景技术：
恶性肿瘤是严重危害人民健康的重大疾病，近年死亡人数在全球迅猛上升。据WHO最新统计，目前全球毎年新增1500万癌症患者；2007年全球共有760万人死于癌症，预计到2030年这个数字可能会增至1320万。在我国，恶性肿瘤的危害尤为严重我国的新发癌症病人占全球的20%，癌症死亡病人占全球的24%。长期以来，国际社会花费巨资寻找治疗癌症的新技术、新方法。其中，作为肿瘤治疗主要手段之一的药物治疗虽然取得了较好的疗效，但由于化疗药物固有的毒副作用，如引起骨髄抑制、免疫功能低下以及治疗过程中出现的耐药等问题，使其在临床应用中受到诸多限制。因此寻找和开发新型抗肿瘤药物仍然是目前医药研究人员面临的艰巨任务之一。血管生成是肿瘤发生发展的重要因素。1971年，美国学者Folkman提出了 “肿瘤生长依赖于血管新生”学说，自此抗肿瘤血管生成逐渐成为人类研究肿瘤的热点之一。理论上，ー个血管内皮细胞可以支持50 100个肿瘤细胞。新生血管不仅为病理组织提供养分，保证其生长増殖；同时使得肿瘤细胞与个体的血液循环系统直接相通，是恶性肿瘤发生远处转移的必要条件。因此，肿瘤血管生成的研究成为肿瘤病理生理学研究的重要内容；肿瘤新生血管成为肿瘤治疗的重要靶点。Hanahand D等提出血管生成的“开关平衡假说”，认为血管生成受血管生成生长因子和血管生成抑制因子的共同调控。血管生成生长因子，如血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板源性生长因子(TOGF)等，在肿瘤组织中可过度表达，而抑制因子表达过低，导致新血管的生长，最終导致肿瘤的浸润和转移。肿瘤血管生成是ー个复杂过程，其基本步骤为肿瘤血管生成因子与血管生成抑制因子失衡，血管生成表型形成；血管内皮基底膜的降解；内皮细胞向肿瘤组织迁移及在迁移中増殖；内皮细胞管道化、分支化形成血管环；形成新的基底膜。可见，通过干扰肿瘤细胞、内皮细胞和基质细胞间的信号转导以及血管内皮细胞的功能，抑制内皮细胞的増殖和迁移，可抑制肿瘤新生血管生成。具体途径主要包括①直接抑制内皮细胞増殖抑制肿瘤血管生成因子的表达与释放、阻断肿瘤血管生成因子的作用促进肿瘤血管生成抑制因子(如PF-4)的表达；④抑制蛋白水解酶(如基质金属蛋白酶)的活性，从而抑制基底膜的降解；⑤抑制内皮细胞整合素的作用，阻断血管内皮细胞与基质之间的相互作用非特异性作用机制，如白介素-12、钙通道阻断剂等。抑制肿瘤新生血管生成的药物称为新生血管抑制剂(angiogenesis inhibitors,AIs) 0目前临床应用的包括两类药物，其ー是单克隆抗体；其ニ是小分子酪氨酸激酶抑制齐U。有贝伐单抗(bevacizumab)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)等，但存在并发心脑血管疾患、腹泻、肝功能异常以及皮肤过敏反应，甚则发生大咯血的危险。寻找新的高效低毒AIs仍然是目前新药研究的热点。2，3，5，4’ -四羟基ニ苯こ烯-2-0-β-D-葡萄糖苷(简称ニ苯こ烯苷)为何首乌中的主要水溶性成分，其含量常作为何首乌药材及制剂质量控制的指标。近年来，发现ニ苯こ烯苷有多种药理作用①ニ苯こ烯苷对多种脑损伤动物模型的学习记忆障碍有一定的改善作用对不同时程拟老年性痴呆转基因动物模型的研究表明，ニ苯こ烯苷不仅能早期预防学习记忆障碍的发生，还能逆转和治疗学习记忆障碍，对老年性痴呆等神经退行性疾病有治疗作用[张兰，邢颖，赵玲，等.不同时程APP转基因小鼠学习记忆改变及參乌胶囊、ニ苯こ烯苷的干预作用.中国行为医学科学，2006，15(3) :193-196]。②脑保护作用ニ苯こ烯苷可明显拮抗谷氨酸介导的神经毒性作用，细胞存活率明显增加，乳酸脱氢酶漏出減少，细胞死亡率降低。对Na2S2O4致缺血性损伤神经元细胞具有同样的保护作用[李雅莉，赵玲，李林.ニ苯こ烯苷对海马神经元细胞缺血性损伤模型大鼠的保护作用研究.中国药房，2006,17(1) :12-14] 0③清除自由基，延缓衰老的作用ニ苯こ烯苷可通过抑制花生四烯酸的合成，减少体内氧自由基的形成，降低体内脂质的过氧化水平，起到延缓衰老的作用[Lv LS, Gu XH, Tang J, et al. Antioxidant activity of stilbene glycosides from poygonum multiflorum. Food Chemistry, 2007,104 (4) :1678-1681]。④降血脂及抗动脉粥样硬化作用ニ苯こ烯苷能够降低高胆固醇血症动物和高脂小鼠的血浆胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、极低密度脂蛋白胆固醇及甘油三酯水平，显著降低动脉硬化指数[Yang PY,Almofti MR,Lu L,et al. Reduction of atherosclerosis in cholesterol-fedraobits and decrease of expressions of intracellular adhesion molecule-1 andvascular endothelial growth factor in foam cells by a water-solution fractionof polygonum multiflorum. J Pharmacol Sci, 2005,99 (3) :294-300] ; ニ苯こ烯苷还对氧化修饰低密度脂蛋白诱导的U937细胞间黏附分子-1 (ICAM-I)、血管细胞黏附分子-I(VCAM-I)及血管内皮生长因子(VEGF)等动脉粥样硬化危险因素的产生，抑制单核巨噬细胞黏附分子分泌产生抗动脉粥样硬化作用[张伟，王玉琴，李鋒，沈燕，王春华.ニ苯こ烯苷对ox-LDL诱导的U937细胞ICAM-1、VCAM-I及VEGF表达的影响·中国药理学通报.2008;24(5) :667-672]。⑤舒张血管作用ニ苯こ烯苷对动脉血管具有舒张作用，此作用主要是依血管内皮由NO介导的[刘其礼，班翊，张俊红，等.ニ苯こ烯苷对大鼠主动脉舒张作用及其一氧化氮含量的影响.中国药理学与毒理学杂志，2004，18 (4) :289-293]。⑥肝保护作用ニ苯こ烯苷能显著拮抗氧化玉米油所致的大鼠脂肪肝、肝功损伤、肝脏过氧化脂质的升高。⑦抗肿瘤作用ニ苯こ烯苷对肿瘤的生长有一定的抑制作用，可抑制肿瘤细胞DNA的合成(IC5Q = 81mmoL/L)[谢M .何首乌及ニ苯こ烯苷的研究进展.天津药学,2010,22(3) 70-73] 0但是，ニ苯こ烯苷抑制肿瘤血管生成的作用，目前还未见报道。本发明人对ニ苯こ烯苷抗肿瘤作用进行了深入研究，发现ニ苯こ烯苷的抗肿瘤作用完全不同于以上“抑制肿瘤细胞DNA的合成”的作用，而是通过对肿瘤新生血管的抑制产生明显抗肿瘤作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种ニ苯こ烯苷抑制肿瘤血管生成的新作用。本发明的另ー个目的是提供ニ苯こ烯苷抑制肿瘤血管生成的新作用，采用ニ苯こ烯苷及其药学上可接受的盐、酷或糖用于制备预防或治疗肿瘤药物领域中的应用，以及ニ苯こ烯苷及其药学上可接受的盐、酷或糖可以制备成的剂型为片剂、胶囊、溶液、注射液和滴丸等药学上可接受的剂型。
具体实施例方式下面列举典型实施例，对本发明进ー步说明，但不以任何形式构成对本发明的限制。试验例I :ニ苯こ烯苷对血管生成的抑制作用
实验试剂5_氟尿嘧啶(5-FU)购于江苏南通精华制药有限公司。对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)新血管生成的影响实验分5组对照组(生理盐水)，5-Fu(10mg/L)，50、100、200ymol/L ニ苯こ烯苷组，每组10个鸡胚。在无菌条件下，取孵化7d的受精白皮种蛋，剥去直径为Icm大小的蛋壳造成ー个人工气室，小心去除壳膜，暴露CAM。用打孔器制备直径为6mm的微孔滤膜圆片，高压消毒。将无菌条件下浸泡过一定浓度药物的滤纸轻轻置于CAM上，用胶布封住缺ロ，放入39V、湿度70%恒温箱内培养。48h后，取出鸡胚，局部采用丙酮-无水こ醇(I : I) ImL固定15min,剪下放有滤纸及周围的CAM,放入盛有水的平皿内展开，贴于载玻片拍照。在解剖显微镜下随机选取5个视野计数药膜周围8mm内大、中、小血管数,并摄影记录。统计学处理实验数据以均数土标准差(I士s)表示，组间比较采用t检验进行分祈。P <0.01表示两组差别具有显著性意义。结果对照组血管生长良好，血管在药膜下呈放射状生长，血管粗大，血管分支较多，微血管丰富。ニ苯こ烯苷组大血管无明显变化，但微血管明显减少；给药组浓度为lOOumol/L时放射状生长的血管数目明显减少，血管细小、稀疏，血管分支少，在药膜片下及周围局部鲜有血管区，或者血管断裂或消失。表明ニ苯こ烯苷能明显抑制血管生成，抑制作用具有浓度依赖性，结果见表I。表I ニ苯こ烯苷对CAM新生血管生成的影响G ±んη = 10)
分组剂量大血管数中血管数小血管数
对照-2. 8土O. 426. 7±0.9922. 3土2. 5750 μ mol/L2·7±0·515·9±0·8219.6±1·15 ニ苯こ烯苷100 μ mol/L2.3±0.334·0±0·7210·8±1.73*
200 μ raol/L 2.0±0.48 2·9±0.65 5.9±0·85* _5—Fu_10 mg/L _2. 4±0·40 _ 5. 4±0. 88 —13. 9±2· 74**Ρ < 0. 01与对照组比较。试验例2 :ニ苯こ烯苷对肺癌的抑制作用及血管生成的影响实验试剂环磷酰胺购于恒瑞医药股份有限公司。RPMI 1640、胰蛋白酶及小牛血清为Gibco产品。其余试剂均为国产分析纯。细胞培养使用RPMI 1640或培养液(含10%灭活的小牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素)，置于37°C、5% CO2孵箱中培养。CD31多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。
动物与细胞株C57BL/6小鼠，6_7周龄，购自第四军医大学实验动物中心；小鼠Lewis肺癌细胞株为本实验室传代保株。实验分组小鼠随机分为5组，即模型组、溶剂对照组(生理盐水)、ニ苯こ烯苷(20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg)组，阳性对照组(环磷酰胺)。对Lewis肺癌的抑制作用用PBS制成I X 107/mL的Lewis肺癌细胞悬液，每鼠右后背部接种O. 2mL。24h后将小鼠随机分组，每组10只，毎日小鼠称重后，按体重腹腔注射给药I次；每天观察动物的状态；连续给药18d后，处死小鼠，取瘤块，称质量，按公式计算抑瘤率肿瘤抑瘤率(％ ) = [I-(给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)]X 100%。对血管生成的抑制作用瘤组织制成冰冻切片，应用SABC法对上述冰冻切片进行CD31免疫组织化学染色。计算微血管密度(MVD):内皮细胞或幼稚内皮细胞被染成棕黄色的结构均被判定为明显的分隔，可以作为一个可计数的微血管。计数在5个高倍镜视野下被染色的血管平均值。统计学处理实验数据以均数土标准差表示，组间比较采用t检验进行分祈。结果=Lewis肺癌荷瘤鼠用ニ苯こ烯苷连续灌胃给药18d后，各组荷瘤鼠的抑瘤率见表2。ニ苯こ烯苷对小鼠Lewis肺癌的抑制作用呈现明显的剂量依赖关系。其中高剂量组(100mg/kg)的抑瘤作用最为显著，可达61.2%，高于环磷酰胺。通过肿瘤组织切片免疫组化染色发现生理盐水组中微血管密集。ニ苯こ烯苷高剂量组的肿瘤组织的微血管⑶31分子表达和血管均显著減少，其抑制作用呈现剂量依赖性。表明ニ苯こ烯苷具有抑制肿瘤组织中血管内皮细胞⑶31分子表达，抑制新生血管形成，从而发挥抗肿瘤的作用。表2 ニ苯こ烯苷对小鼠Lewis肺癌的抑制作用和MVD η = 10)
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权利要求
1.二苯乙烯苷抑制肿瘤血管生成的新作用，其特征在于二苯乙烯苷对肿瘤血管的生成具有显著抑制作用。
2.根据权利要求I所述，其应用特征在于可采用二苯乙烯苷及其药学上可接受的盐、酯或糖用于制备预防或治疗肿瘤药物，以及二苯乙烯苷及其药学上可接受的盐、酯或糖可以制备成的剂型为片剂、胶囊、溶液、注射液和滴丸等药学上可接受的剂型。
全文摘要
本发明涉及二苯乙烯苷抑制肿瘤血管生成的新作用，及其制备抗癌药物与应用，属于化合物药理及其应用技术领域。我们发现二苯乙烯苷具有显著抑制肿瘤血管生成的新作用；采用二苯乙烯苷及其药学上可接受的盐、酯或糖用于制备预防或治疗肿瘤药物领域中的应用，以及二苯乙烯苷及其药学上可接受的盐、酯或糖可以制备成的剂型为片剂、胶囊、溶液、注射液和滴丸等药学上可接受的剂型。
文档编号A61P35/00GK102657667SQ20121011678
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月19日 优先权日2012年4月19日
发明者曹蔚, 杨倩, 王四旺, 谢艳华 申请人:中国人民解放军第四军医大学