专利名称：一种提高畜禽免疫功能的蜂胶黄酮脂质体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种蜂胶黄酮脂质体的制备方法，及其提高畜禽免疫功能的应用，属于中兽药制备技术及免疫应用领域。
背景技术：
蜂胶黄酮(propolis flavone, PF)是蜂胶中所含的主要有效成分之一,具有抗氧化、抗病原微生物、抗炎、抗感染、抗过敏、抗肿瘤和增强免疫功能等广泛的生物学功能和药理学作用。然而，黄酮类化合物的抗氧化作用主要是通过自身的优先氧化来避免其它成分被氧化的，这就使得黄酮自身并不稳定，而蜂胶黄酮的不稳定性又在很大程度上影响着蜂胶提取物的储藏、使用和其功效的发挥。而且蜂胶黄酮作为一种免疫增强剂直接用于兽医临床，存在着体内代谢较快、作用时间较短、成分复杂、质量控制难、免疫增强作用相对较弱等不足之处，从而限制了蜂胶黄酮的临床应用。为了更好地开发利用蜂胶的药理作用，对蜂胶新剂型的研究逐渐成为热点。脂质体是由类脂质制备的具有复层或单层单位膜结构的小囊，其结构类似生物膜，在体内能生物降解。由于脂质体成份为磷脂和胆固醇，也是生物细胞膜的主要成分，属机体内源性物质，具有良好的生物相容性和可降解性，无毒、无免疫原性。脂质体的结构和生物细胞相似，易被细胞吸附、融合、脂交换、内吞而被细胞摄取；且具有一定的弹性和变形性，比相同粒径的其他类型的纳米粒容易进入病灶组织。因此，脂质体已成为现代药物载体研究的内容之一。同时脂质体还可用作免疫佐剂，早在1974年由Allison等首次报道脂质体能增强机体的体液和细胞介导的免疫应答，对疫苗的增效作用可达数十倍甚至更高。利用脂质体具有靶向释药、缓释、无免疫原性、降低药物毒副作用等优势，将蜂胶黄酮包封于脂质体中，脂质体不仅可以防止 蜂胶黄酮被氧化，而且可以有效维持蜂胶黄酮在机体内的有效浓度，提高了其生物利用度。因而脂质体可以作为蜂胶黄酮的一种优良载体。本发明首次采用乙醇注入法将蜂胶黄酮制备成蜂胶黄酮脂质体(propolisflavone liposome, PFL),并将其和动物疫苗一起应用，建立了蜂胶黄酮脂质体的制备方法，优化了制备条件，发现蜂胶黄酮脂质体能显著提高蜂胶黄酮的免疫增强作用，提高其生物利用度。
发明内容
技术问题本发明针对蜂胶黄酮易氧化、水溶性低、不易被吸收、生物利用度低等问题，提供一种蜂胶黄酮脂质体的制备方法，达到显著提高蜂胶黄酮免疫增强作用目的，并应用于畜禽临床。技术方案用乙醇注入法及响应面法设计蜂胶黄酮脂质体的制备方法。经优化后蜂胶黄酮脂质体最佳制备方法为:按一定比例称取卵磷脂、胆固醇和蜂胶黄酮，溶于IOmL的无水乙醇中使其溶解。匀速注入到40°C缓冲液PBS 20mL(0.01mol/L)中，继续恒温搅拌，除去有机溶剂直至无乙醇味为止，水浴超声20min,依次过0.80 μ m>0.45 μ μ m和0.22 μ m的微孔滤膜各1次，即得到蜂胶黄酮脂质体。按此方法制备的蜂胶黄酮脂质体，平均包封率为91.67%±0.21%。将蜂胶黄酮脂质体和新城疫疫苗一起应用于鸡，能显著提高鸡血清新城疫抗体效价、淋巴细胞增殖和细胞因子含量，具有较好的免疫增强功能，对提高禽免疫功能，防治疾病具有重要应用价值。有益效果动物疫病主要靠疫苗来预防，但是很多疫苗存在免疫原性较弱等缺点，需要免疫增强剂辅助才能产生强大的免疫应答。现有的常用免疫增强剂如油佐剂、铝胶佐剂等常存在刺激性强、有残留等缺点。由于中药具有绿色安全的特点，从中药中开发免疫增强剂已成为热点。蜂胶黄酮是蜂胶中所含的主要有效成分之一,具有抗氧化、抗病原微生物、抗炎、抗感染、抗过敏、抗肿瘤和增强免疫功能等广泛的生物学功能和药理学作用。然而，黄酮类化合物的抗氧化作用主要是通过自身的优先氧化来避免其它成分被氧化的，这就使得黄酮自身并不稳定，而蜂胶黄酮的不稳定性又在很大程度上影响着蜂胶提取物的储藏、使用和其功效的发挥。而且蜂胶黄酮作为一种免疫增强剂直接用于兽医临床，存在着水溶性差、体内代谢较快、作用时间较短、成分复杂，质量控制有一定困难等不足之处，免疫增强作用相对较弱，从而限制了临床应用。利用脂质体包封蜂胶黄酮，不仅可以防止蜂胶黄酮被氧化不稳定，解决水溶性差等问题，而且可以有效维持蜂胶黄酮在机体内的有效浓度，提高其生物利用度。本发明采用乙醇注入法和响应面法将蜂胶黄酮制备成蜂胶黄酮脂质体，所得脂质体包封率高，不仅可以解决蜂胶黄酮成分易氧化、水溶性低，不易制剂等问题，而且便于药物的吸收，可以使药物缓慢地的释放，有效地延长药效，能显著提高动物免疫功能，对抵抗疫病有重要意义。本发明作为一种新型中兽药，没有副作用。与现有技术相比，本发明优点如下:1.蜂胶黄酮脂质体的制备国内外未见报道，本发明提供了一种蜂胶黄酮脂质体的制备方法及其优化的条件，填补了国内外研究的空白。2.蜂胶黄酮脂质体的免疫增强活性未见报道。通过本发明的实施，证明蜂胶黄酮通过制备成蜂胶黄酮脂质体后能够显著提高其免疫增强活性，表现为明显提高抗体效价、淋巴细胞增殖、IgG和IgM含量、细胞因子IL-2、IFN-Y的含量，与蜂胶黄酮比，在免疫中后期效果更好，具有较强的缓释作用，从而增强动物免疫功能。因此，蜂胶黄酮脂质体可以作为研制新型免疫增强剂的材料，为研制新型免疫增强剂提供了材料和示范。
具体实施例方式1.蜂胶黄酮脂质体的制备采用乙醇注入法制备蜂胶黄酮脂质体。按一定比例称取卵磷脂、胆固醇和蜂胶黄酮，溶于IOmL的无水乙醇中使其溶解。匀速注入到40°C缓冲液PBS 20mL(0.0ImoI/L)中，继续恒温搅拌，除去有机溶剂直至无乙醇味为止，水浴超声20min,依次过0.80 μ m、0.45 μ m和0.22 μ m的微孔滤膜各I次，即得到蜂胶黄酮脂质体。在单一因素考察的基础上，确定影响蜂胶黄酮脂质体包封率的3个主要影响因素，即脂药比(A)、膜材比(B)、注入速度(C)3个因素，以此3个因素为自变量，每个因素又选择3个水平，以脂质体包封率为响应值，做3因素3水平共17个试验点(5个中心点)二次回归正交组合试验。试验设计及结果见表I。对表I中试验结果进行响应面分析，经过二次回归拟合后，得到蜂胶黄酮脂质体的包封率对脂药比(A)、膜材比(B)、注入速度(C)的二次多项回归方程为:Y =91.30-0.91A+2.21B-0.029C-0.64AB-2.36AC+0.36BC-7.32A2-4.87B2_7.57C2。表I Box-Behnken试验设计表及结果
权利要求
1.一种蜂胶黄酮脂质体的制备方法，采用乙醇注入法及响应面法设计优化制备蜂胶黄酮脂质体。
(1)采用乙醇注入法制备蜂胶黄酮脂质体。
按一定比例称取卵磷脂、胆固醇和蜂胶黄酮，溶于IOmL的无水乙醇中使其溶解。匀速注入到40°C缓冲液PBS 20mL(0.0ImoI/L)中，继续恒温搅拌，除去有机溶剂直至无乙醇味为止，水浴超声20min，依次过0.80 μ m、0.45 μ m和0.22 μ m的微孔滤膜各I次，即得蜂胶黄酮脂质体。
(2)通过响应面设计优化出按照上述方法制备蜂胶黄酮脂质体的最佳条件为:脂药比9.6: 1、膜材比 8.5: 1、注入速度 0.8mL.mirT1。
(3)在最佳条件下制备的蜂胶黄酮脂质体的包封率高，包封率平均值为91.67%±0.21%。
2.权利要求1所述方法获得的蜂胶黄酮脂质体能够显著提高鸡的抗体效价、淋巴细胞增殖和细胞因子 含量，具有较好的免疫增强功能。
全文摘要
本发明涉及一种提高畜禽免疫功能的蜂胶黄酮脂质体及其制备方法，属于中兽药制备技术及免疫应用领域。用乙醇注入法制备蜂胶黄酮脂质体，以包封率为指标，采用响应面法研究了脂药比、膜材比和注入速度3个因素并对其进行优选，确定最佳制备条件为脂药比9.6∶1、膜材比8.5∶1、注入速度0.8mL·min-1，所得蜂胶黄酮脂质体的包封率高，免疫增强活性强。本发明蜂胶黄酮脂质体显著提高了蜂胶黄酮的免疫增强活性。
文档编号A61K9/127GK103191157SQ201210203668
公开日2013年7月10日 申请日期2012年6月20日 优先权日2012年6月20日
发明者王德云, 袁菊, 胡元亮, 刘家国, 范云鹏, 赵晓娟, 黄叶娥 申请人:南京农业大学