专利名称：猪繁殖与呼吸综合征病毒的肽核酸及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的肽核酸及其应用。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的病毒性传染病，该病以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道综合征为主要特征。1987年，在美国中西部地区首次发现，并在全美迅速蔓延，短短几年内迅速遍及全球，给养猪业造成了极大的经济损失。1992年，在国际病毒学会议上正式将其命名为猪繁殖与呼吸综合征病毒。1996年，郭保清等首次在国内疑似PRRSV感染的猪群中分离出PRRSV，从而证明了该病毒在我国的存在。目前，PRRSV也已成为我国重要猪传染病病原之一。国际兽疫局(OIC)已将其列为B类传染病，我国也将其列为二类传染病，其中高致病性猪蓝耳病(high2pat hogenic swine of blue ear disease) 为一类传染病。猪繁殖与呼吸综合征潜伏期一般为3 24 d。当猪群一旦出现PRRSV，则会迅速传播，通常在2 3个月内血清阳性率即可达859^95%。感染后的猪精神不振，食欲减退或废绝，体温升高40. 2 42. 0 °C，咳嗽，呼吸困难。各种年龄的猪发病后大多表现有呼吸困难症状，但具体症状不尽相同。母猪染病后，初期出现厌食、体温升高、呼吸急促、流鼻涕等类似感冒的症状，少部分(2%)感染猪四肢末端、尾、乳头、阴户和耳尖发绀，并以耳尖发绀最为常见，个别母猪拉稀，后期则出现四肢瘫痪等症状，一般持续I 3周，最后可能因为衰竭而死亡。怀孕前期的母猪流产，怀孕中期的母猪出现死胎、木乃伊胎，或者产下弱胎、畸形胎，哺乳母猪产后无乳，乳猪多被饿死。公猪感染后表现咳嗽、打喷嚏、精神沉郁、食欲不振、呼吸急促和运动障碍、性欲减弱、精液质量下降、射精量少。生长肥育猪和断奶仔猪染病后，主要表现为厌食、嗜睡、咳嗽、呼吸困难，有些猪双眼肿胀，出现结膜炎和腹泻，有些断奶仔猪表现下痢、关节炎、耳朵变红、皮肤有斑点。病猪常因继发感染胸膜炎、链球菌病、喘气病而致死。如果不发生继发感染，生长肥育猪可以康复。哺乳期仔猪染病后，多表现为被毛粗乱、精神不振、呼吸困难、气喘或耳朵发绀，有的有出血倾向，皮下有斑块，出现关节炎、败血症等症状，死亡率高达60%。仔猪断奶前死亡率增加，高峰期一般持续8 12周，而胚胎期感染病毒的，多在出生时即死亡或生后数天死亡,死亡率高达100%。PRRSV属于动脉炎病毒属，是一种有囊膜的不分节段的单股正链RNA，病毒呈球形，直径50 65 nm，核衣壳呈二十面体对称，表面有细小纤突起。病毒有2个血清型，即美洲型和欧洲型，我国分离到的毒株为美洲型。基因组全长约15 kb，含8个开放阅读框(ORFs)，其相邻的阅读框均有部分重叠。5'端有长约12 kb的0RF1。ORFl含重叠16个核苷酸的ORFla和ORFlb，占整个基因组的80%，产生非结构蛋白(编码RNA复制酶和聚合酶)。ORFla编码区有一些疏水区，一个推定的丝氨酸蛋白酶区和半胱氨酸富集区。在紧接ORFla起始密码子的前导序列中有两个发夹结构。ORFla编码起始区的核心序列为5' -UAACCAU- 3/，高度保守。ORFlb有4个结构域(I)聚合酶元序列；(2)富含半胱氨酸和组氨酸的锌指区；⑶蜗牛酶基元序列；⑷功能不明的保守区域。在ORFl的上游有长约180 220个核苷酸的5'非编码区(Non- coding Reign，NCR)，高度保守，其作用是作为5'端前导序列引导各个亚基因组mRNAs的翻译。PRRSV的基因表达模式是通过产生6个亚基因组mRNAs表达，这些亚基因组mRNA都具有来自病毒基因组5' NCR的共同前导序列，并且共有一个3'的嵌套式结构。3'端有6个编码框(0RF2 7)，编码病毒结构蛋白，0RF2 0RF5编码的囊膜蛋白分别为GP2、GP3、GP 4、GP5，0RF6编码的膜基质蛋白为M蛋白，0RF7编码的核衣壳蛋白为N蛋白。0RF7终止密码子之后为3'端非编码区，含有一个Poly(A)尾一长约10个核苷酸的保守序列，是病毒复制时酶识别并结合的区域，以启动负链RNA的合成。在PRRSV的结构蛋白中，GP5、M和N为主要结构蛋白，次要结构蛋白GP2a、GP3、GP4和E在病毒粒子中含量少，对其功能的研究也较少。Welch等证明缺失0RF2、0RF4的PRRSV感染性分子克隆能够在提供相应缺失蛋白的细胞系中拯救得到感染性病毒粒子。GP3是否存在病毒粒子中也还有争议，在LDV中，GP3被证明是非结构、可溶性糖蛋白，可以从感染细胞中分泌出去；在EAV中，GP3被证明以结构蛋白形式组装进病毒粒子。对于PRRSV，两种情况都有，欧洲型PRRSV LV分离株的GP3蛋白被证明存在病毒粒子中，而北美分离株的GP3蛋白则被证明以分泌形式存在(sGP3)。E蛋白是新鉴定的小的非糖基化疏水性囊膜蛋白，有一个潜在的N末端N豆蘧酰化位点和一个酪氨酸激酶II磷酸化酶位点、一个中心疏水域和一个富含碱性残基的亲水C末端，存在于所有动脉炎病毒粒子中，突变E蛋白的翻译起始密码子，导致EAV感染性分子克隆的感染性丧失。PRRSV分离株间核苷酸序列存在广泛变异，由于PRRSV会发生核苷酸和氨基酸水平的置换、插入、缺失或基因重组。研究表明猪蓝耳病变异病毒可以引起猪的“高热病”，为区别一般蓝耳病，我国将猪“高热病”命名为“高致病性猪蓝耳病”。与1996年在我国流行的猪蓝耳病病毒相比较，变异毒株的毒力和致病力都显著增强。2006年在我国南方一些省份的猪场爆发了一种猪“高热”综合症，发病猪主要表现为体温高、发病率高和死亡率高等的临床特点，随后经研究证实该病的主要病原为发生缺失变异的PRRSV。童光志等对中国大陆1996 2006年间PRRSV的GP5蛋白的遗传变异进行分析，结果表明中国大陆1996 2006年间PRRSV毒株与VR22332株(北美型病毒代表株)具有较高的氨基酸同源性(85. 5 % 99.0 %)，而与LV (欧洲型病毒代表株)同源性较低(53.5 % 57. 0 %)。这表明我国主要流行的毒株均为北美型，而且分成两个遗传关系相距较大的亚群。亚群I所有毒株在病毒的主要中和抗原表位的抗体结合位点都发生变异，而亚群II则在此处高度保守。尽管猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组存在广泛的遗传变异性，M蛋白和N蛋白在所有的毒株之间相对比较保守。M蛋白基因最为保守，而GP5的基因序列差异最大。ORFl编码病毒的复制酶，ORFla所编码的寡聚蛋白经加工后，形成6个非结构蛋白(Nspl a ,Nspl 3 ,Nsp2 Nsp5),其中Nsp2在美洲型和欧洲型毒株间有很大差异,其氨基酸同源性只有32%。ORFlb所编码的寡聚蛋白长约1463个氨基酸，为ORFla所编码的蛋白酶所切割，并形成4个蛋白即RdRp、CP2、CP3和CP4 ；GP2由0RF2编码的糖蛋白，分子质量为29ku 30ku。两种基因型的PRRSVGP2都包含2个明显的疏水峰和2个推导的N糖基化位点。GP3由0RF3编码的糖蛋白，分子质量为27ku 29ku，是PRRSV各毒株间保守性最差的蛋白之一，在欧、美型毒株间推导氨基酸的同源率为54% 60%,而且多数变异发生在N末端；GP4是由0RF4编码的糖基化囊膜蛋白，分子质量为19ku 20ku，该蛋白包含有4个糖基化位点，其N端和C端区为高度疏水区；GP5是一种糖基化的囊膜蛋白，由ORF5编码，也称E蛋白，分子质量在22. 4ku左右，美洲型和欧洲型分离株的GP5分别由200个和201个氨基酸组成，有6个抗原决定簇，能诱导机体产生特异性中和抗体…蛋白是由ORF6编码的膜基质蛋白，分子质量为18ku 19ku，欧洲型和美洲型毒株间M蛋白推导的氨基酸序列最为保守，分别含有173个和174个氨基酸，同源性为78% 81% ;N蛋白是由ORF7编码的核衣壳蛋白，分子质量为14ku 15ku，是PRRSV中最小的主要结构蛋白，PRRSV美洲型毒株和欧洲型毒株间N蛋白的氨基酸数目分别是123个和128个，且欧洲型毒株N蛋白的N末端和C末端比美洲型毒株多两个氨基酸延伸区，分别为STAPM和SQGAS。反义核酸(antisense nucleic acid)是一段与祀基因(mRNA或DNA)的某段序列 互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列，反义核酸通过碱基配对方式特异性的与病毒靶基因结合形成杂交分子，从而在复制、转录和翻译水平调节靶基因的表达，或诱导RNase H识别并切割mRNA，进而使其功能丧失。反义核酸包括反义RNA (antisense RNA)和反义DNA (antisense DNA),具有合成方便、序列设计简单、容易修饰、选择性高、亲和力强等特点。反义核酸作为一种新的抗病毒、抗肿瘤药物，掀起了一场药理学领域的革命，即新的药物受体mRNA通过新受体结合方式(Watson-Crick杂交)、引发新的药物受体结合后反应(I) RNase H介导的祀RNA的降解；(2)抑制DNA的复制和转录及转录后的加工和翻译等。可以说反义寡核苷酸(ODNs)疗法比传统的药物治疗手段有更高的特异性。从二十世纪70年代末到现在，在这三十年的时间中，反义核酸药物已走出实验室，进入了实际临床应用。特别是第一个反义核酸药物Fomivirsen通过FDA批准上市后,人们对反义疗法尤为关注。反义核酸作用原理基于碱基配对原则，可通过与靶RNA进行碱基配对结合的方式参与对相关基因表达的调控。其作用方式可能有①反义RNA与病毒mRNA结合形成互补双链阻断核糖体与病毒mRNA的结合，从而抑制了病毒mRNA翻译成蛋白质的过程。②反义DNA能与祀基因形成一种三链核酸(triple helix nucleic acid),它通过作用于控制基因转录的转录子、增强子和启动子区，对基因的转录进行调控。③反义核酸与病毒mRNA的结合可阻挡mRNA向细胞质的运输。④反义核酸与病毒mRNA结合后使得mRNA更加易被核酸酶识别降解，从而大大缩短mRNA的半衰期。上述四种作用途径都可表现为对病毒基因表达的抑制或调控，且这种调控是高度特异性的。反义核酸是通过碱基互补配对的原理来识别所打靶的基因，从理论来分析，研究人员以动物细胞为例，其染色体大约有几十亿对碱基，如果4个碱基(A、G、C和T)的数目大致相同，并在整个基因中随机分布，那么按照统计学原理，大于17个碱基的反义核酸与非靶基因杂交的可能性不大，所以长度超过17个碱基的反义核酸分子与靶基因的结合可以说是唯一的，从而使反义核酸具有高度的特异性。研究表明，在细胞内部一个拷贝的基因会产生200-300条mRNA，翻译出10万个具有生物活性的蛋白质分子。传统药物主要作用于有生物功能的蛋白分子的某结构域上的几个作用位点，事实上蛋白的结构是非常复杂的，且在生物体内，活性蛋白的空间结构又是千变万化的，以传统药物有限的几种作用位点来控制靶分子的动态的和整体的功能很难达到理想的效果，因而不难看出传统药物的局限性。由mRNA可翻译出几十到几百个蛋白，反义核酸在mRNA水平对靶基因直接进行调控，这个步骤相当于将传统药物作用放大了数十到数百倍，可见反义核酸的调控是极其经济合理的。毒理学研究表明，反义核酸在体内具有很低的毒性，尽管其在生物体内的存留时间有长有短，但最终都将被降解消除，这避免了如转基因疗法中外源基因整合到宿主染色体上的危险性。与传统药物相比，反义核酸药物具有特异性强，效率高和毒副作用低等优点，在抑制肿瘤生长和抗病毒复制等方面显现出了良好的应用价值。目前已有多个药物进入美国和欧洲市场，另还有30多种反义核酸药物正在进行临床前期的研究或开发后进入了 I、II和III期实验。由于动物体内存在大量的核酸外切酶，反义核酸若不经过化学修饰，很快就被降解，失去活性。目前对反义核酸的化学修饰有很多方法，常见的有硫代修饰反义核酸及 2’-甲氧基修饰反义核酸等。且目前硫代修饰药物的研究最为全面，它可有效抵抗核酸酶的降解，同时可促进核酸酶Rase H的活性，目前这种修饰方法已成功用于临床的反义核酸药物。但这些还只是第一代反义核酸的修饰方法，随着技术的发展与进步，新的修饰途径与方法被开发出来，使得反义核酸的研究进入了第二、三代，其中肽核酸的修饰最为引人关注。肽核酸(peptidenucleic acids, PNAs),是一种以中性酰胺键为骨架的全新的DNA类似物，可序列特异的靶向作用于DNA的大沟槽，其骨架的结构单元为N(2-氨基乙基)-甘氨酸，碱基部分通过亚甲基羰基连接于主骨架的氨基N上。肽核酸为反义核酸的第二代产品。发明目的
PRRSV是目前严重危害世界养猪业的重要病原之一，集约化养殖猪群密集，该病具有高度传染性，主要特征表现为母猪繁殖障碍和生长猪呼吸道症状，给养猪业造成巨大的经济损失。到目前为止，对该病还没有非常有效的防控措施，开发预防和治疗PRRSV感染的新技术路径显得尤为迫切，另PRRSV主要侵害猪的肺泡巨噬细胞为主的巨噬细胞系统，使感染后猪的免疫力低下，从而引发免疫抑制，疫苗研究至今没有根本性突破。本发明将肽核酸技术与反义核酸技术结合起来，并运用于预防和治疗PRRSV病毒感染引起的相关疾病。本发明的目的是提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的肽核酸及其应用。
发明内容
本发明所提供的肽核酸，选自如下任一种或任几种肽核酸
a)其核酸序列为序列表中的序列I 5， - AAUAUGAGAGCUGUUGUUGUU -3，；
b)其核酸序列为序列表中的序列2 5， - UUAA⑶UAUAAAUCAACUGAA-3，；
c)其核酸序列为序列表中的序列3 5， - AAUGGAAAACGCCAAAAGCAC-3，；
d)其核酸序列为序列表中的序列4 5， - UCAGAAAGAUCAAAAGGUGCA-3，。
其中，所述肽核酸可以为经壳聚糖修饰的肽核酸。本发明的肽核酸可以用于制备用于抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的药物。用于抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的药物，即肽核酸制剂，其活性成分为所述的肽核酸。其中，所述制剂可以为结肠溶控释微囊制剂、注射用冻干制剂或口服用水溶性颗粒剂。所述制剂还可以含有可药用载体或赋形剂。本发明的肽核酸制剂的稳定性分析
高温流通蒸汽高温105°C，20分钟灭菌不影响其生物活性。极端温度50°C存放6个月不影响其生物活性。室温存放24个月不影响其生物活性。低温-20°C存放48个月不影响其生物活性。本发明的肽核酸无毒副作用，无耐药性，能特异性直接抑制PRRSV复制，抗病毒效果好，无药残等食品安全问题。
具体实施例方式为此，本发明采用了以下技术方案
PRRSV毒株NS-009株，来自楠森兽医 诊断技术研究中心实验室。细胞株MARC_145细胞，来自楠森兽医诊断技术研究中心实验室。从GenBank数据库检索出PRRSV的基因组，用生物学软件进行序列分析，综合考虑序列的保守性，G+C%含量，碱基分布特点，然后从中挑选出合适的区域设计反义核酸，最后所确定的针对病毒的GP-5和M基因的反义核酸序列如下。GP5:
GP5-1 :5，- AAUAUGAGAGCUGUUGUUGUU -3，
GP5-2 :5， - UUAAGUUAUAAAUCAACUGAA-3，
GP5-3 :5， - AAUGACAAAGCAAAUCAGCGC-3，
M
M-I :5，- UGGAAAACGCCAAAAGCACCU-3’
M-2 :5， - AAUGGAAAACGCCAAAAGCAC-3，
M-3 :5， - UCAGAAAGAUCAAAAGGUGCA-3，
人工合成如下肽核酸，肽核酸的序列如下
GP5:
GP5-1 :5，- AAUAUGAGAGCUGUUGUUGUU -3，
GP5-2 :5， - UUAAGUUAUAAAUCAACUGAA-3，
GP5-3 :5， - AAUGACAAAGCAAAUCAGCGC-3，
M
M-I :5，- UGGAAAACGCCAAAAGCACCU-3’
M-2 :5， - AAUGGAAAACGCCAAAAGCAC-3，
M-3 :5， - UCAGAAAGAUCAAAAGGUGCA-3，。
采用PRRSV特异性定量RT-PCR检测肽核酸对病毒靶基因的抑制程度，同时运用病毒毒价测定实验检测抗病毒的滴度。Day I: 铺板消化前期准备的MARC-145细胞，离心收集，细胞计数，用完全培养基将细胞浓度调到I X IO5个/ml，铺24孔板，于37°C二氧化碳培养箱中进行培养18-24小时。Day 2:
显微镜观察细胞的密度，待细胞长满孔板面积的7(T80%时，且细胞状态良好。吸去培养液，每孔加入300W待筛选药物(即肽核酸)，每个药物10个孔。温育I小时后，加入IOOrtPRRSV (感染比为0. 01)，吸附2小时后，用营养液洗去未吸附的病毒后，再加入含4%FBS的DMEM培养基，在37°C和5%C02环境中继续培养，感染后定时观察细胞病变。感染后48h，将感染细胞进行反复冻融以释放病毒，以此为样本进行病毒检测。实验过程中还设不加病毒和肽核酸的正常细胞对照组，加病毒、不加肽核酸阳性对照组和加肽核酸药物、不加病毒的阴性对照组。Day 3~5:
观察药物对细胞的保护效应，并对结果进行评判。Real-time PCR 定量检测
收集上述各处理组中的上清液，用病毒总RNA提取试剂盒提取病毒RNA。对获得的病毒RNA首先进行反转录成cDNA，然后运用针对的引物分别检测PRRSV处理组中的病毒含量。定量扩增后的结果，运用统计学软件计算出各处理组中病毒滴度，抑制效果以PNA组与空白对照组差异的倍数。本发明参考Huang等提供的引物，采用real-time PCR定量检测PRRSV。PRRSV 0RF7
引物 0RF71: 5’-AAATGGGGCTTCTCCGGGnTT-3，；
弓 I 物 0RF72: 5，-TCAGCTGTGCCAGATGCTGG-3，。TaqMan probe:
5’ FAM-TCCCGGTCCCTTGCCTCTGGA-TARAM3’。
& -actin为内参
Actin-F : 5’ - TGACTGACTACCTCATGAAGATCC-3’ ；
Actin-R 5’- TCTCCTTAATGTCACGCACGATT-3’。Actin-Probe
5’ (FAM)-CGGCTACAGCTTCACCACCACGGC-(TARAM) 3’
反应体系(25iil)
钇剂I用量(Ul)
2XOne-StepRT-PCRBuffer12. 5
ExTaqT MHS0.5
PrimeScript T MRTEnzymeMixII0. 5
_PCR正向引物_0. 5
>CR反向引物_0. 5 总祖 2 无 RNasedH2O 8. 5 总量 |25反应条件
反转录
42 0C 5 min95 0C 10 secPCR扩增
Cycle 4095 0C 5 sec60 °C 30 sec病毒毒价检测
当细胞病变出现时，收集各处理细胞的培养上清，10倍系列稀释，共7个稀释度，接种于预先在96孔板培养的MARC-145细胞中，100 y L/孔，每个样品设3个重复。观察细胞病变，直到没有细胞病变孔出现，按Karber法计算CCID50PmL (50 % cellcultureinfectious dose)。以下述公式来计算不同的肽核酸对PRRSV病毒复制产生的抑制率。
权利要求
1.一种肽核酸，选自如下任一种或任几种肽核酸 a)其核酸序列为序列表中的序列I 5， - AAUAUGAGAGCUGUUGUUGUU -3，； b)其核酸序列为序列表中的序列2 5， - UUAA⑶UAUAAAUCAACUGAA-3，； c)其核酸序列为序列表中的序列3 5， - AAUGGAAAACGCCAAAAGCAC-3，； d)其核酸序列为序列表中的序列4 5， - UCAGAAAGAUCAAAAGGUGCA-3，。
2.根据权利要求I所述的肽核酸，其特征在于，所述肽核酸为经壳聚糖修饰的肽核酸。
3.权利要求I或2所述的肽核酸在制备用于抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的药物中的应用。
4.一种肽核酸制剂，其活性成分为权利要求1-2中任一所述的肽核酸。
5.根据权利要求4所述的肽核酸制剂，其特征在于，所述制剂为结肠溶控释微囊制剂、注射用冻干制剂或口服用水溶性颗粒剂。
6.根据权利要求4或5所述的肽核酸制剂，其特征在于，还含有可药用载体或赋形剂。
全文摘要
本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的肽核酸及其应用。本发明的肽核酸，选自如下任一种或任几种肽核酸a)其核酸序列为序列表中的序列1；b)其核酸序列为序列表中的序列2；c)其核酸序列为序列表中的序列3；d)其核酸序列为序列表中的序列3。本发明的肽核酸无毒副作用，无耐药性，能特异性直接抑制PRRSV复制，抗病毒效果好，无药残等食品安全问题。
文档编号A61P31/14GK102796181SQ201210205068
公开日2012年11月28日 申请日期2012年6月20日 优先权日2012年6月20日
发明者韩健宝 申请人:韩健宝