专利名称：一种鸡源性抗鸡新城疫病毒p蛋白的单链抗体zl2、其制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗鸡新城疫病毒的基因工程单链抗体ZL2、表达该单链抗体的表达载体和宿主细胞、该单链抗体的制备方法以及其用途，所述单链抗体能与鸡新城疫病毒P蛋白特异性结合活性。
背景技术：
鸡新城疫是新城疫病毒引起的禽类急性、高度接触性和致死性的传染病，对我国乃至世界养禽业的危害及其严重，被国际兽医局确定为A类传染病，也是我国禽肉出口检 疫的重要疾病之一。对于病毒性传染病，目前尚没有特异性治疗药物。单链抗体等基因工程抗体，以其独特的抗病毒作用及可以大规模工程化制备的优势，显示了巨大的研发抗病毒药物的潜力，受到该领域高度重视。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的基因工程单链抗体，该单链抗体能够与鸡新城疫病毒P蛋白特异性结合，可用于鸡新城疫的预防和/或治疗。一种鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的单链抗体ZL2，其至少具有如SEQ IDNo. I所示氨基酸序列的轻链可变区、如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的重链可变区和位于轻链可变区与重链可变区之间的中间连接肽，所述中间连接肽为(Gly4Ser)3。上述单链抗体具有如SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列。本发明的另一目的是提供一种编码所述鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的单链抗体ZL2的基因，其具有SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。为了方便地对单链抗体进行检测纯化和进一步的操作，可以在上述序列的基础上进一步设计酶切位点和识别序列，优选进一步含有内切酶位点Notl、NcoI和识别序列。其中包括 NcoI =CCATGG NotI :GCGGCCGC。本发明的再一目的是提供一种含有编码上述单链抗体的基因的表达载体。上述表达载体为原核表达载体，优选为P0PE101-XP载体。本发明的再一目的是提供一种制备上述鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的单链抗体(ZL2)的方法，包括以下步骤(I)采用RT-PCR直接从ND GA/VA疫苗免疫的鸡脾脏RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区基因和轻链可变区基因；(2)利用SOE-PCR法将linker与VH基因和VL基因相连构建鸡源性单链抗体编码
基因;(3)将步骤(2)的鸡源性单链抗体编码基因克隆到原核表达载体pOPElOl-XP中，构建重组质粒；(4)将步骤(3)的原核表达载体p0PE101-XP转化入E. coli JM109感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，培养、表达单链抗体；(5)将步骤(4)表达的单链抗体用以原核表达的新城疫病毒P蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA进行筛选，阳性克隆即为抗新城疫病毒P蛋白的单链抗体；(6)分离纯化步骤(5)所得阳性克隆培养产物，即获得所述鸡源性抗鸡新城疫病毒的单链抗体。(按照上海意泓生物科技有限公司纯化柱说明书操作进行)需要说明的是，以上各步骤采用的实验材料均为正规公司获得的标准材料，所用方法均为标准试剂盒产品说明书所述方法(见相应的实施例)，各步骤获得的中间产品及最后的终产品均经过多次试验证明可以重复获得，其生物学性质保持稳定一致。说明本发明各试验步骤所涉及的中间产品和终产品均可以按照本发明所陈述的发法准确获得.本发明的再一目的是提供上述鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的单链抗体在用于制备鸡新城疫的预防、治疗药物中的应用。 本发明的技术原理是采用RT-PCR直接从ND (新城疫)GA/VA疫苗株免疫的鸡脾脏RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因。利用SOE-PCR(重组链延伸反应)法将linker与VH基因和VL基因相连构建鸡源性单链抗体(ScFv)基因，并将其克隆到原核表达载体P0PE101-XP中，构建重组质粒并转入大肠杆菌表达，间接ELISA筛选原核表达的抗NDV单链抗体的阳性克隆，测序后进行Clustalw多序列比较，证明该单链抗体属于鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的单链抗体。本发明的有益效果是抗鸡新城疫病毒的基因工程抗体能与鸡新城疫病毒P蛋白特异性结合，能够用于鸡新城疫的预防和治疗。
图I是实施例I的p0PE101-XP重组载体的结构图。图2是单链抗体ZL2的编码基因及其对应的氨基酸序列。
具体实施例方式实施例I鸡源性抗鸡新城疫病毒的单链抗体的制备I :将鸡新城疫疫苗(Bio ND VG/GA购自梅里亚集团)按使用说明免疫鸡(罗曼母鸡，4月龄、体重I. 5kg，购自上海思甜家禽养殖专业合作社)，用常规(参照F.M.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》)ELISA法检测血清抗体效价大于1:20000时，收获鸡脾脏，经匀浆研磨后，用Trizol法(TRIZOL Reagent购自TaKaRa公司)提取总RNA。以提取的总RNA为模版，采用Oligo primer,根据反转录试剂盒(cDNA第I链合成试剂盒购自TaKaRa公司)的产品说明操作步骤，合成第I链cDNA。2 :根据GenBank已公布的鸡抗体编码基因可变区序列(AJ298107. I)的FR区设计扩增抗体轻、重链的引物(表1)，其中VHlF和VHlR用于扩增VH区；VL1F和VLlR用于扩增VL区；VH2R、VH2F用于VH基因加入酶切位点和Linker序列；VL2R、VL2F用于VL基因加入酶切位点和Linker序列。其中，VH2F、VL2R分别含有Not I和Nco I酶切位点；VH2R、VL2F含互补的Linker序列(酶切位点和Linker序列在表I中用下划线标示出)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。表I扩增抗体可变区的引物及其扩增片段大小
权利要求
1.一种鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的单链抗体ZL2，是与原核表达的新城疫病毒P蛋白结合的单链抗体，其至少具有如SEQ ID No. I所示氨基酸序列的轻链可变区、如SEQ IDNo. 2所示氨基酸序列的重链可变区和位于轻链可变区与重链可变区之间的中间连接肽。
2.如权利要求I所述的单链抗体ZL2，其特征在于其具有如SEQID No. 3所示的氨基酸序列。
3.—种编码如权利要求I所述的基因，其特征在于其具有SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于所述核苷酸序列中进一步包含内切酶位点NotI、NcoI，其中 NcoI 为 CCATGG，NotI 为 GCGGCCGC。
5.含有权利要求3-4任一项所述的基因的表达载体。
6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于所述载体为原核表达载体。
7.如权利要求6所述的表达载体，其特征在于所述载体为pOPElOl-XP载体。
8.一种制备如权利要求I所述的鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的单链抗体的方法，包括以下步骤 (1)采用RT-PCR直接从NDGA/VA疫苗免疫的鸡脾脏RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区基因和轻链可变区基因； (2)利用SOE-PCR法将linker与VH基因和VL基因相连构建鸡源性单链抗体编码基因； (3)将步骤(2)的鸡源性单链抗体编码基因克隆到原核表达载体pOPElOl-XP中，构建重组质粒； (4)将步骤(3)的原核表达载体pOPElOl-XP转化入E.coli JM109感受态细胞，培养、表达单链抗体； (5)将步骤(4)表达的单链抗体用以原核表达的新城疫病毒P蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA进行筛选，阳性克隆即为抗新城疫病毒P蛋白的单链抗体 (6)分离纯化步骤(5)所得阳性克隆培养产物即获得所述鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的单链抗体ZL2。
9.如权利要求I或2所述的鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的单链抗体ZL2在用于制备鸡新城疫的预防和/或治疗药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种利用分子生物学手段制备鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的基因工程单链抗体ZL2，其至少具有如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的轻链可变区、如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的重链可变区和位于轻链可变区与重链可变区之间的中间连接肽。ELISA实验证明，获得的抗鸡新城疫病毒的基因工程单链抗体能与原核表达的鸡新城疫病毒P蛋白特异性结合，显示了该单链抗体具有一定的结合新城疫病毒P蛋白的活性，可以用于鸡新城疫的预防和/或治疗。
文档编号A61K39/42GK102746397SQ20121022843
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月3日 优先权日2012年7月3日
发明者张艳玲, 朱建国, 李本强 申请人:上海交通大学