专利名称：一种快速获取树突状细胞疫苗的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种快速获取树突状细胞疫苗的制备方法。本发明涉及的促进人外周血、骨髓和脐血中单个核细胞快速诱导并负载肿瘤特异糖蛋白为树突状细胞疫苗，高表达共刺激分子，具有激活机体效应性T淋巴细胞，可用于各类癌症包括实体瘤和血液肿瘤在内的免疫治疗。
背景技术：
目前，癌症的细胞免疫治疗给患者提供继三大常规治疗的“第四种模式”，没有放
化疗带来的巨大毒副作用，达到了相对安全，提高了患者生活品质，有尊严的治疗方式。树突状细胞在该细胞免疫治疗中起着主要作用，并在临床治疗中应用。人体内每一个糖基转移酶均有一个基因编码，每个糖基转移酶均催化特定的糖苷键的合成。如果合成糖链的糖基转移酶的基因发生部分缺失、增加等突变，则可导致编码异常的糖基转移酶，从而使细胞发生癌变。这种变异的糖链能作为抗原并被相应的抗体识别，故称其为糖链抗原。因其主要且大量的在癌细胞中产生，正常组织或良性病变几乎不产生，故有学者将其称为癌抗原。糖链抗原15-3是从转移性乳腺癌中分离的一种肿瘤相关抗原，CA15-3水平与乳腺癌的复发转移密切相关，当CA15-3 > 100U/ml时，可肯定有转移。CA54-9也是乳腺癌的标志物，可见于50%乳腺癌、卵巢癌、40%前列腺癌、33%肺
癌患者中。CA50是一种唾液酸酯和唾液酸糖蛋白，正常组织中一般不存在，当细胞恶变时，糖基化酶被激活，造成细胞表面糖基结构改变而成为CA50标志物。许多恶性肿瘤患者血中皆可升高，如66. 6%的肺癌、88. 2%的肝癌、68. 9%的胃癌、88. 5%的卵巢或子宫颈癌、94. 4%胰或胆管癌，其他如直肠癌、膀胱癌等皆有70 %以上是升高的。CA125最初认为是卵巢癌特异的，但深入研究，它也是一种广谱的肿瘤标志物。CA19-9为唾液酸化的乳-N-岩藻戊糖II，是一种类粘蛋白的糖蛋白成分。血清内正常值< 37X 103U/L( > 95% )，异常升高也是在多种肿瘤出现，如79%胰腺癌、58%结肠癌、49%肝癌、67%胃癌、67%胆囊癌、肺癌、乳腺癌皆有10%左右是升高的。CA72-4是一种高分子量糖蛋白，正常人血清中含量< 6X103U/L，异常升高在各种消化道肿瘤、卵巢癌均可产生。对于胃癌的检测特异性较高，CA242是一种唾液酸化的鞘糖脂类抗原，几乎总是和CA50 —起表达，但两者受不同的单克隆抗体识别。对胰腺癌的诊断，CA242优于CA19-9，敏感性可达66% 100%，对大肠癌的敏感性也达60% 72%。CA242的敏感性由高至低依次为肝癌、胃癌、大肠癌、胰腺癌。TAG-72是一种分子量大于1，OOOKDa的粘液蛋白，除分泌腺上皮外，其它正常上皮一般不表达，主要用于结肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、内膜癌和肺癌的研究。亦可用于肺癌(TAG-72+)和恶性间皮瘤(TAG-72_)的鉴别诊断。
针对以靶向肿瘤特异表达糖链抗原进行肿瘤临床治疗，发挥特异性的抗肿瘤免疫应答，本发明不需要进行肿瘤抗原表位多肽的筛选以及受HLA-A2阳性的限制，采用了体外GM-CSF和IFN-α诱导并直接负载一个或多个肿瘤特异糖链蛋白，快速、简便获取树突状细胞疫苗，从而促进树突状细胞具有更好的靶向抗肿瘤免疫应答作用。
发明内容
现有技术主要通过两步法外诱导和成熟过程获得树突状细胞疫苗，培养时间为7天，操作复杂。本发明技术一步法获取树突状细胞，不需要进行肿瘤抗原表位多肽的筛选以及受HLA-A2阳性的限制，通过体外直接诱导和负载一个或多个肿瘤特异糖链蛋白，激发树突状细胞更好的靶向抗肿瘤免疫应答作用。本发明涉及一种快速获取树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下工序在人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-a (IFN- α )培养条件下，并直接负载一个或多个肿瘤特异糖链蛋白，获取树突状细胞疫苗。 本发明所述的肿瘤特异糖链抗原优选CA72-4、CA50、CA24-2、CA 15-3, CA24-2、CA19-9、CA12-5、肿瘤相关糖蛋白-72 (Tumor-associated Glycoprotein-72, TAG-72)等。本发明所采用的培养瓶优选6孔培养板、25cm2或75cm2培养瓶，或选用塑料培养皿。优选地，本发明所述方法为单个核细胞用RPMI1640培养基重悬，并加入6孔板中贴壁；在37°C,5% CO2培养箱中孵育90min后，未贴壁细胞洗涤收集下来；贴壁细胞加入培养基诱导培养，该培养基含 1000IU-5000IU/mLGM-CSF、100IU-2000IU/mL IFN-α、1Χ 非必需氨基酸、I X丙酮酸钠，以及体积比5%自体血清；于37°C、5% CO2培养箱中培养；在培养到第三天时细胞半量更换新鲜培养基，该新鲜培养基含1000IU-5000IU/mL GM-CSF,500IU-2000IU/mL IFN-α ;并添加50ng/mL-50ug/mL —个或多个肿瘤特异糖链抗原，负载于树突状细胞，于37°C、5% CO2培养箱中培养过夜；培养到第五天收获树突状细胞疫苗；其高表达共刺激分子⑶80、⑶83和⑶86。其中，⑶80+/⑶Ilc+细胞为98. 0%，CD86+/CDllc 细胞为 85. 2%，CD83+/CDllc+ 细胞为 84. 3% (高表达)。更优选地，单个核细胞用RPMI1640培养基重悬，并加入6孔板中贴壁；在37°〇、5% CO2培养箱中孵育90min后，未贴壁细胞洗涤收集下来；贴壁细胞加入培养基诱导培养，该培养基含有1500IU/mLGM-CSF、500IU/mL IFN-α、1Χ非必需氨基酸、I X丙酮酸钠、5%的自体血清；于37°C、5% CO2培养箱中培养；在培养到第三天时细胞半量更换新鲜培养基该新鲜培养基含1500IU/mLGM-CSF、500IU/mL IFN-α ;并添加200ng/mL—个或多个肿瘤特异糖链抗原，负载于树突状细胞，于37°C、5% CO2培养箱中培养过夜；培养到第五天收获树突状细胞疫苗；其中，优选的细胞活率检测方法为计算培养最后一天的活细胞数。取ImL最后一天培养的培养液，1000rpm、4°C下离心10分钟，细胞用培养基重悬，取20ul细胞液用I XPBS稀释20倍，稀释液加入I倍体积的苔盼兰溶液，混匀后加入到细胞计数板，于倒置显微镜下观察计数，蓝色染色的为死细胞，不染色的为活细胞，细胞活率达到98%以上。优选的细胞表型检测方法为取苔盼兰染色计数后的3X IO6细胞，分三组，第一组分别添加到有20 μ L FITC标记鼠抗人⑶80单抗、20 μ LPE标记鼠抗人HLA-DR单抗和20 μ LPerCP标记鼠抗人⑶I Ic单抗；第二组分别添加20 μ L FITC标记鼠抗人⑶86单抗、20 μ LPE标记鼠抗人⑶83单抗和20 μ LPerCP标记鼠抗人⑶I Ic单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20 μ L FITC标记鼠IgGl、20 μ LPE标记鼠IgGl和20 μ LPerCP标记鼠IgGl。置于4°C冰箱染色30分钟，然后用ImL的I X磷酸盐缓冲液洗涤三次，最后用O. 5mL的I XPBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测。经检测，CDllc+/HLA-DR+ 细胞为 98. O %，CD80+/CD1 Ic+ 细胞为 98. O %，CD86+/CD1 Ic 细胞为 85.2%，CD83+/CDlIc+细胞为84. 3% (高表达)。检测结果表明通过本发明所述方法得到的细胞为成熟树突状细胞疫苗，并高表达各类共刺激分子。
图I表示本发明快速获取的树突状细胞的流式细胞图；图2表示本发明制备树突状细胞疫苗与现有技术对肿瘤细胞的抗肿瘤免疫应答作用。
具体实施例方式本发明发现通过在GM-CSF和IFN- Y的存在下培养骨髓、脐带血或外周血来源的单个核细胞，并直接负载一个或多个肿瘤特异糖链抗原一步法获得树突状细胞，不仅高表达常见共刺激分子CD80、CD83和CD86，能激发有效的抗肿瘤细胞免疫应答尤其是长期抗肿瘤效应，不需筛选获得肿瘤特异糖链抗原的表位多肽以及不受HLA-A2配型限制。对本发明涉及的一种快速获取树突状细胞疫苗的制造方法进行具体说明。本发明涉及在GM-CSF和IFN- Y的诱导存在下并直接负载一个或多个肿瘤特异糖链抗原一步法获得树突状细胞为特征的制造方法。本发明方法的特征在于，包含如下工序，即在人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α (IFN-α)培养条件下，并直接负载一个或多个肿瘤特异糖链蛋白，获取树突状细胞疫苗。本发明采用培养板，培养瓶或塑料培养皿，优选6孔板、25cm2或75cm2培养瓶。本发明涉及树突状细胞的体外培养方法单个核细胞在基础培养基中(含1000IU-5000IU/mL GM-CSF、100IU-2000IU/mL IFN- α ,1 X 非必需氨基酸 IX 丙酮酸钠，以及体积比5%自体血清)，在培养到第三天时细胞半量更换新鲜培养基，该新鲜培养基含1000IU-5000IU/mL GM-CSF、100IU_2000IU/mL IFN-α ;并添加 50ng/mL_50ug/mL —个或多个肿瘤特异糖链抗原，负载于树突状细胞，于37°C、5% CO2培养箱中培养过夜；培养到第五天收获树突状细胞疫苗；高表达共刺激分子⑶40、⑶80、⑶83和⑶86。作为本发明制造方法中使用的含有能诱导得到树突状细胞的单个核细胞，可例举，由外周血、骨髓、脐带血等分离得到的单个核细胞。上述单个核细胞无论是从生物体采集的新鲜单个核细胞或冷冻保存过的单个核细胞，均可用于本发明。本发明的制造方法中对负载树突状细胞的肿瘤特异糖链抗原的浓度和数量没有特殊限制，但优选例如为50ng/mL-50ug/mL、特别是100-500ng/mL ;负载的肿瘤特异糖链抗原数量为1-5个，特别是2-3个。本发明的快速获取树突状细胞疫苗的制备方法中使用的培养基，没有特殊限制，可以使用树突状细胞培养等中能使用的公知的培养基，例如可以适当地选择使用市售培养基。上述培养基除其原有的构成成分外，还可以含有细胞因子类、适当的蛋白质及其他成分。通常，本发明使用含有GM-CSF和IFN-α的培养基。GM-CSF在培养基中的使用浓度为1000IU-5000IU/mL，更优选1500IU-2500IU/mL。IFN-α在培养基中的使用浓度为100IU-2000IU/mL,优选 200IU/mL-1000IU/mL。在培养基中可以添加血清或血浆进行培养。它们在培养基中的添加量不受特殊限制，如大于O容量％至20容量％，且可以根据不同的培养阶段而改变血清或血浆的用量。例如，可以阶段性减少血清或血浆浓度来使用。另外，作为血清或血浆的来源，可以是自己(意味着与所培养的细胞来源相同)或非自己(意味着与所培养的细胞的来源不同)中的任一种，从安全性的观点出发，优选自己来源的血清或血浆。另外，也可以添加如人血清白蛋白之类经分离纯化的血清成分。本发明的快速获取树突状细胞疫苗的制备除了使用肿瘤特异糖链抗原外，使用上述各种成分及培养基来实施。本发明中使用的培养开始时的细胞数没有特殊限制，例如优选 2X 106cell/mL-lX109cells/mL、更优选 5X106cell/mL-5X107cells/mL。另外，培养条件也没有特殊限制，可以使用通常的细胞培养中使用的条件。例如，可在37°C、5%C02等条 件下培养。还可以实施如下等操作间隔适当的时间添加新鲜培养基来稀释细胞培养液，或更换培养基，或更换细胞培养用器材等。本发明的制备方法中可以使用例如细胞培养板、培养皿、培养瓶、袋子等细胞培养用器材(容器)。作为细胞培养用器材，优选细胞培养板和培养瓶。本发明的快速获取树突状细胞疫苗的制备方法中，对培养时间可以实施总天数为
3-6天、优选5天的培养。本发明还提供树突状细胞疫苗在生物体内发挥更强的抗肿瘤免疫应答，达到很好的治疗效果。此外，上述树突状细胞还具有如下优点，即激活记忆性T淋巴细胞，产生长期抗肿瘤免疫效应，因此非常利于在治疗上应用。以下，结合实施例对本发明做更具体的描述，但本发明不限于此。实施例一骨髓来源单个核细胞快速获取树突细胞疫苗的体外培养来自捐献者的20mL骨髓经FicolΙ-Hypaque密度梯度离心，得到单个核细胞。外周血单个核细胞用RPMI1640培养基重悬，并加入6孔板中贴壁。在37°C、5% CO2培养箱中孵育60min后，未贴壁细胞洗涤收集下来。贴壁细胞加入完全培养基RPMI1640诱导培养，含有1500IU/mL GM_CSF、500IU/mLIFN-α、1Χ非必需氨基酸、I X丙酮酸钠和5%的自体血清，放置37°C、5% CO2培养箱中培养。在培养到第三天时细胞半量更换新鲜培养基该新鲜培养基含1500IU/mL GM_CSF、500IU/mL IFN-α ;并添加200ng/mL —个或多个肿瘤特异糖链抗原，负载于树突状细胞，于37°C、5% CO2培养箱中培养过夜；培养到第五天收获树突状细胞疫苗。所述的肿瘤特异糖链抗原选自CA72-4、CA50、CA24-2、CA 15-3, CA24-2、CA 19-9,CA12-5、TAG-72 等。计算培养最后一天的活细胞数。取ImL最后一天培养的培养液，1000rpm、4°C下离心10分钟，细胞用RPMI1640培养基重悬，取20 μ L细胞液用lXPBS(pH7. 4)稀释20倍，稀释液加入I倍体积的苔盼兰溶液，混匀后加入到细胞计数板，于倒置显微镜下观察计数，蓝色染色的为死细胞，不染色的为活细胞，细胞活率达到98%以上。取苔盼兰染色计数后的3 X IO6细胞，分三组，第一组分别添加到有20 μ LFITC标记鼠抗人⑶80单抗、20 μ L PE标记鼠抗人HLA-DR单抗和20 μ L PerCP标记鼠抗人⑶IIc单抗；第二组分别添加20 μ L FITC标记鼠抗人⑶86单抗、20 μ L PE标记鼠抗人⑶83单抗和20 μ L PerCP标记鼠抗人⑶Ilc单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20 μ L FITC标记鼠IgGl、20 μ L PE标记鼠IgGl和20 μ L PerCP标记鼠IgGl (BD公司)。置于4°C冰箱染色30分钟，然后用ImL的IX磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，最后用O. 5mL的IXPBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测。图I结果显示，CDllc+/HLA-DR+ 细胞为 98. 0%，CD80+/CDllc+ 细胞为 98. 0%，CD86+/CDllc 细胞为85.2%,⑶83+/⑶Ilc+细胞为84. 3% (高表达)，表明通过本发明技术得到细胞为成熟树突状细胞疫苗，并高表达共刺激分子。实施二外周血来源单个核细胞快速获取树突细胞疫苗的体外培养 来自捐献者的50mL外周血经Ficoll-Hypaque密度梯度离心，得到单个核细胞。外周血单个核细胞用RPMI1640培养基重悬，并加入6孔板中贴壁。在37°C、5% CO2培养箱中孵育60min后，未贴壁细胞洗涤收集下来。贴壁细胞加入完全培养基RPMI1640诱导培养，含有1500IU/mL GM_CSF、500IU/mLIFN-α、1Χ非必需氨基酸、I X丙酮酸钠和5%的自体血清，放置37°C、5% CO2培养箱中培养。在培养到第三天时细胞半量更换新鲜培养基，该新鲜培养基含1500IU/mL GM_CSF、500IU/mL IFN-α ;并添加200ng/mL —个或多个肿瘤特异糖链抗原，负载树突状细胞，于37°C、5% CO2培养箱中培养过夜；培养到第五天收获树突状细胞疫苗。所述的肿瘤特异糖链抗原选自CA72-4、CA50、CA24-2、CA 15-3, CA24-2、CA 19-9,CA12-5、TAG-72 等。采用实施例一中苔盼兰染色计算培养最后一天的树突状细胞数和细胞活率，以及树突状细胞通过流式抗体染色和流式细胞仪检测，分析细胞表型。表一
患者树突状细胞活率 CDllc+/ CD80+/ CD86+/ CD83+/__^___HLA-DR+ CDllc+ CDllc+ CDllc+
患者一 8.4 X IO6 99.1% 98.5%97.7% 92.4% 90.4%
患者二 9.5 X IO6 99.6% 95.7%94.5% 87.5% 86.7%
患者三 10.6 X IQ6 98.4% 95.5%95.0% 86.8% 85.8%
患者四 9.8 X IO6 98.7% 96.1%__94.2% 89.5% 87.1%实施三本发明获得树突状细胞的抗肿瘤免疫应答(与现有技术比对)应用本发明中实施例一或二，制备获得树突状细胞进行细胞毒性活性实验(CTL)。应用现有技术制备获得树突状细胞主要为两步法，即第一步通过GM-CSF和白介素4体外培养，诱导得到未成熟树突状细胞，第二步将肿瘤抗原负载树突状细胞，并在脂多糖或肿瘤坏死因子α等作用获得成熟树突状细胞，共培养7-10天。在6孔板内，仍以含5%小牛血清的RPMI1640为培养基，按上述抗原负载的成熟树突状细胞T细胞=1 20的比例混合上述抗原负载的成熟树突状细胞和T细胞，同时加入GM-CSF (终浓度为800IU/mL)和IL_4(终浓度为500IU/mL)，共培养7天，其间每隔I天均半量换液(含5%小牛血清、终浓度为800U/mL的GM-CSF和终浓度为50IU/mL的IL-4的RPMI1640培养基)，得到CTL细胞。选择相应的肿瘤细胞(如肝癌MMC-7721和肺癌A549)作为靶细胞，用51Cr标记，即靶细胞(2X 106/mL)通过与300 μ Ci51Cr在RPMI1640培养基中37°C孵育2小时。标记好的靶细胞用IXPBS洗涤三次，并最终用RPMI 1640(含10%小牛血清)重悬到2 X IO5的浓度。以每孔2X IO4个标记的靶细胞(O. ImL)添加到96孔板的孔中。将上述产生的CTL细胞(效应细胞)分别以2.5 1、5 UlO 1、20 I和40 I的效靶比加入对应的孔中，在37°C孵育4小时。孵育后，取上清75 μ L组分用α放 射计数器计数。特异的51Cr释放的百分比根据下述的公式进行计算。
(检测的每分脉冲数自发释放的每分脉冲数)
权利要求
1.ー种快速获取树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，单个核细胞用RPMI1640培养基重悬，并加入6孔板中贴壁；在37°C、5% CO2培养箱中孵育60min后，未贴壁细胞洗涤收集下来；贴壁细胞加入培养基诱导培养，该培养基含有1500IU/mLGM-CSF、500IU/mLIFN-a、1X非必需氨基酸、IX丙酮酸钠和5%的自体血清；于37で、5%0)2培养箱中培养；在培养到第三天时细胞半量更换新鲜培养基，该新鲜培养基含1500IU/mL GM-CSF、500IU/mLIFN- a ;并添加200ng/mL—个或多个肿瘤特异糖链抗原，负载于树突状细胞，于37°C、5% CO2培养箱中培养过夜；培养到第五天收获具有抗肿瘤作用的树突状细胞疫苗； 所述的树突状细胞疫苗高表达共刺激分子⑶80、⑶83和⑶86 ； 将所述的树突状细胞疫苗进行细胞活率和细胞表型检测； 所述细胞活率检测方法为计算培养最后一天的活细胞数；取ImL最后一天培养的培养液，1000rpm、4°C下离心10分钟，细胞用培养基重悬，取20ul细胞液周I XPBS稀释20倍，稀释液加入I倍体积的苔盼兰溶液，混匀后加入到细胞计数板，于倒置显微镜下观察计数，蓝色染色的为死细胞，不染色的为活细胞，细胞活率达到98%以上； 所述细胞表型检测方法为取苔盼兰染色计数后的3X IO6细胞，分三组，第一组分别添加到有20 ii L FITC标记鼠抗人CD80单抗、20 ii LPE标记鼠抗人HLA-DR单抗和20 ii L PerCP标记鼠抗人⑶I Ic单抗；第二组分别添加20 u LFITC标记鼠抗人⑶86单抗、20 u L PE标记鼠抗人⑶83单抗和20 ii L PerCP标记鼠抗人⑶Ilc单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20iiL FITC标记鼠IgGl、20 ii LPE标记鼠IgGl和20 y L PerCP标记鼠IgGl ;置于4°C冰箱染色30分钟，然后用ImL的I X磷酸盐缓冲液洗涤三次，最后用0. 5mL的I XPBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测。
2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在干，所述的肿瘤特异糖链抗原包括CA72-4、CA50、CA24-2、CA 15-3, CA24-2、CA 19-9, CA12-5、肿瘤相关糖蛋白-72 等。
3.根据权利要求1-2所述方法制备的树突状细胞疫苗在基础研究和临床抗肿瘤中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种快速获取树突状细胞疫苗的制备方法，其中包括如下工序在人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和干扰素α培养条件下，并负载一个或多个肿瘤特异糖蛋白，快速、简便获得具有抗肿瘤作用的树突状细胞疫苗。该树突状细胞疫苗高表达共刺激分子CD80、CD83和CD86。其中，CD80+/CD11c+细胞为98.0％，CD86+/CD11c细胞为85.2％，CD83+/CD11c+细胞为84.3％。本发明还提供了一种含通过上述方法而得到的树突状细胞疫苗的基础研究和临床应用中。
文档编号A61P35/00GK102813916SQ20121032470
公开日2012年12月12日 申请日期2012年9月5日 优先权日2012年9月5日
发明者李一民, 李一汉 申请人:北京希普生国际生物医学研究院