专利名称：组织原位高表达ilk蛋白载体的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体而言涉及外源性基因的组织原位表达，及利用外源基因的表达起到治疗慢性心力衰竭疾病的作用，特别涉及组织原位高表达ILK蛋白载体的制备方法及其应用。
背景技术：
慢性心力衰竭主要以心肌细胞丢失，残留心肌细胞的功能恶化、心肌肥厚与血管新生的不协调为特征。而治疗慢性心力衰竭疾病一直是现在医疗中一个比较棘手的问题，它的治疗主要涉及到缓解症状、抑制心脏重构、改善长期预后等方面。然而目前我国有症状心衰病人的生存率很低，预后比大多数进展期恶性肿瘤还差，随着人口老龄化进程的加快和闻血压、冠心病等常见心血管病发病率的上升,其患病率仍在不断上升。整合素连接激酶(ILK)是一有功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它能自我磷酸化， 并磷酸化许多外源底物，如髓鞘碱性蛋白、整合素β I胞浆区、蛋白激酶B(PKB/Akt)和糖原合成酶激酶3 β (GSK-3 β )。心脏中的ILK主要集中在肋状体(costamere)和Z板。肋状体是心肌肌纤维膜和心脏横纹肌Z板相连的区域，它由细胞骨架蛋白和信号激酶的复杂蛋白网络组成，可以连接胞内收缩装置和胞外环境，感受机械牵拉刺激并转导下游信号。研究表明，ILK通过N末端锚蛋白重复序列与PINCH蛋白结合，通过激酶区与β整合素胞浆区以及parvin蛋白结合,从而形成ILK-PINCH-parvin复合体,这一复合体是粘着斑复合体(FAK)的关键成分，在心脏机械感应、机械传导和维持心脏功能方面起着极为重要的作用。在脊椎动物的研究中，Bendig等发现斑马鱼的ILK基因纯合错义突变将导致心脏收缩能力的进行性降低和牵拉一应答基因ANF、VEGF的严重下调，引起斑马鱼在胚胎期即发生心衰。在哺乳动物中，White等证实小鼠ILK对正常心功能是必需的ILK缺失的纯合子小鼠死于围着床期；特异性消除心脏ILK基因将导致小鼠在出生后数周内发生自发性扩张型心肌病，左心室普遍扩大伴纤维化。因此，作为ILK-PINCH-parvin复合体的枢纽，ILK在维持心脏结构和功能方面起着举足轻重的作用。在本发明之前，治疗慢性心力衰竭疾病的药物主要包括有利尿剂、洋地黄等缓解症状的药物以及β受体阻滞剂、ACE抑制剂、醛固酮拮抗剂等改善预后类药物；近些年，植入CRT进行心脏再同步化治疗也在一小部分心力衰竭患者中开始运用。目前，药物治疗疗效有限，很多患者尽管给予了最佳的药物治疗，仍然不可避免地进展到终末期心力衰竭；而CRT治疗极为昂贵，且只对左右心室收缩不同步的患者有效，对大部分心室收缩同步的心力衰竭患者无效。综上所述，尽管已有多类药物被应用来治疗慢性心力衰竭，但总体治疗效果仍然有限，因此，心衰治疗领域迫切需要开发出新的治疗药物和方法。
发明内容
本发明的一个目的就在于克服上述缺陷，提供一种组织原位高表达ILK蛋白载体。本发明的技术方案是组织原位高表达ILK蛋白载体，其主要技术特征在于所述表达载体包含编码人类ILK蛋白的基因。其中所述的编码人类ILK蛋白的基因在人类染色体上具体位置为位于Chromosome 11 ;NC_000011. 9，该基因具体的核苷酸序列在人类基因组数据库(NCBI和Ensebl genomic)中其基因名称为ILK，该基因在NCBI基因库中的ID号为3611 ;在Ensebl 基因库中的 ID 号为ENSG00000166333。其中NCBI基因库ID号为3611的基因序列在本发明中以SEQ ID No. I表不；Ensebl基因库中ID号为ENSG00000166333的基因序列在本发明中以SEQ IDNo. 2表示。该两段基因序列均能表达人类ILK蛋白(含452个氨基酸)，所表达的ILK蛋白其结构和功 能均无差别。本发明的另一技术方案是组织原位高表达ILK蛋白载体的应用，其主要技术特征在于组织原位高表达ILK蛋白载体采用血管内注射制剂、皮下注射制剂以及病灶器官局部组织注射制剂。其中所述的生物病毒(virus)载体系统选自腺病毒、腺相关病毒以及慢病毒载体系统，优选腺病毒载体系统。上述病毒载体系统均可通过商业购买获得。例如本发明中优选的腺病毒载体系统可以选用求必精生物化学公司(Qbiogene. inc)的AdEasy 。本发明还有一技术方案是组织原位高表达ILK蛋白载体制备方法，其主要技术步骤在于(I)通过人cDNA文库扩增野生型ILK cDNA,并在ILK cDNA上下游引物分别引入ScaI和XhoI位点以亚克隆至pShuttle，形成穿梭质粒pShuttle-ILK，PCR产物经DNA测序确认；(2)挑选I. Og阳性重组质粒pShuttle-ILK，经Pme I线性化后转化入含pAdEasy-Ι高效感受态大肠杆菌BJ5183，在含卡那霉素LB琼脂培养基中37°C孵育过夜；(3)经同源重组，BJ5183内产生重组的AdEasy质粒；(4)同源重组质粒pAd-ILK确认挑选部分克隆置于3_5ml含卡那霉素的LB培养基中37°C，225-250rpm振荡培养过夜，小量提取pAd-ILK。pAd-ILK的鉴定采用Pac I酶切法，pAd-ILK经Pac I酶切后0. 8%琼脂糖-TAE胶电泳；(5)将7X106HEK293A细胞铺于IOOmm培养皿，转染时细胞汇合率达80% ；(6)先用OptiMEM培养基冲洗一次细胞，每个培养皿内加入5ml OptiMEM培养基；(7)取15 μ g重组质粒pAd-ILK，经Pac I酶切线性化后转染入HEK293A细胞，转染试剂米用 Lipofectamine2000 (Invitrogen 公司);(8)通过观察转染细胞的细胞病理效应了解感染进程，在转染7-10天后收集细胞，经干冰反复冻融3次获得Ad-ILK病毒保存液；(9)空载腺病毒Ad-null用相似方法，通过空载穿梭质粒pShuttle_CMV与pAdeasy-Ι重组制备,得组织原位高表达ILK蛋白载体。本发明的再一个目的是提供了一种携带编码人类ILK的基因序列的质粒载体系统以及该质粒载体系统在制备治疗心血管疾病药物中的应用。所述的质粒(plasmid)载体系统选自PBR322、PUC、PGEM或Minicycle系列，其中优选minicycle ;上述质粒系统均可通过商业购买获得。例如本发明中优选的Minicycle系列质粒可以购自系统生物科学公司(System Biosciences, Inc)。本发明还提供了一种携带编码人类ILK的基因序列的生物病毒载体系统的制备方法。具体而言该方法包括如下步骤I、通过人类基因组数据库(Ensebl genomic和NCBI)查找ILK基因所在位置(Chromosome 11 ;NC_000011. 9)，基因名称为ILK，该基因在NCBI基因库中的ID号为3611 ;在 Ensebl 基因库中的 ID 号为:ENSG00000166333。2、利用人源性的基因文库克隆出ILK基因的mRNA片段，并经测序鉴定。3、通过本领域熟知的三载体方法制备病毒颗粒。4、经鉴定病毒重组成功后再经扩增和纯化最后得到带有ILK基因的重组病毒载 体系统。本发明所记载的心血管疾病是指各种原因引起的慢性心力衰竭。本发明的优点和效果在于药物在病灶组织内特异性转染，转染效率高，同时对感染的细胞毒性极小，操作较简单，并发症少等。本发明的其他具体优点和效果将在下面继续说明。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例I :携带ILK基因的腺病毒转染体系的制备通过人cDNA文库扩增野生型ILK cDNA,并在ILK cDNA上下游引物分别引入ScaI和XhoI位点以亚克隆至pShuttle，形成穿梭质粒pShuttle-ILK，PCR产物经DNA测序确认(上海英骏生物技术有限公司)。挑选I. Og阳性重组质粒pShuttle-ILK,经PmeI线性化后转化入含pAdEasy-Ι高效感受态大肠杆菌BJ5183，在含卡那霉素LB琼脂培养基中37°C孵育过夜。经同源重组,BJ5183内产生重组的AdEasy质粒(pAd-ILK)。为确认是同源重组质粒pAd-ILK，挑选部分克隆置于3-5ml含卡那霉素的LB培养基中37°C，225_250rpm振荡培养过夜。小量提取pAd-ILK。pAd-ILK的鉴定采用PacI酶切法，pAd-ILK经PacI酶切后0.8%琼脂糖-TAE胶电泳。将大约7X106HEK293A细胞铺于IOOmm培养皿，转染时细胞汇合率达80 %。先用OptiMEM培养基冲洗一次细胞，每个培养皿内加入5ml OptiMEM培养基。取15 μ g重组质粒pAd-ILK，经PacI酶切线性化后转染入HEK293A细胞，转染试剂采用Lipofectamine2000 (Invitrogen公司)。通过观察转染细胞的细胞病理效应了解感染进程。转染7-10天后收集细胞，经干冰反复冻融3次获得Ad-ILK病毒保存液。空载腺病毒Ad-null用相似方法,通过空载穿梭质粒pShuttle-CMV与pAdeasy-Ι重组制备。为了鉴定ILK重组腺病毒是否能表达ILK蛋白，取少量Ad-ILK或Ad-null腺病毒保存液转染293细胞，48小时后采用细胞裂解液裂解细胞、提取细胞蛋白，BCA法检测蛋白浓度，Western blot法检测ILK蛋白表达情况。将4xT-75培养瓶的ΗΕΚ293Α细胞培养至单层90-100 %汇合率，加入足够的Ad-ILK或Ad-null感染细胞，48小时内细胞呈现CPE。当CPE几近完成时，收集感染的细胞，经3次反复冻融使病毒释放入上清液中。收集上清，经ViraBind腺病毒纯化试剂盒提纯Ad-ILK或Ad-null。纯化后腺病毒滴度的测算采用0D260法。0D260法即测定病毒颗粒在260nm处的吸光度，通过DNA量来表示病毒滴度，I个OD值相当于I. I X IO12个病毒颗粒。实施例2:动物实验50只SD大鼠经腹腔注射阿霉素导致心力衰竭后，分别开胸心肌内注射含有ILK基因的腺病毒或空载腺病毒。在25只注射含有ILK基因的腺病毒的大鼠中，有10只在4周内发生死亡，而25只注射含有空载腺病毒的大鼠，有16只发生死亡。四周后，通过超声心动图我们发现，通过超声心动图我们发现，治疗组大鼠的心脏射血分数(EF)、左室短轴缩短率 (FS)均显著优于未治疗大鼠，左室收缩、舒张末期内径明显小于未治疗组，提示左室重构得到明显改善。同时我们检测了左室dp/dt、左室舒张末期压力以及血清BNP，均发现治疗组大鼠显著优于未治疗组大鼠(表I)。进一步的病理学检查发现ILK腺病毒转染组心脏胶原沉积较对照组明显减少；Tunel凋亡检测提示ILK治疗组心脏中凋亡的心肌细胞明显减少；使用Ki_67和H3P染色，可以检测到心梗周围区增殖的心肌细胞显著增多(表2);透射电镜观察发现ILK治疗组中发生自噬的心肌细胞亦明显减少；同时我们观察到ILK治疗组心肌中⑶45阳性细胞明显减少，提示高表达ILK可以抑制炎症细胞向局部组织浸润。另外，我们对ILK腺病毒治疗组大鼠的心、肝、肾、肺、肌肉等组织进行了病理学检测，未发现特异性的损伤及肿瘤形成；孕鼠进行ILK腺病毒治疗后，对其子鼠进行检测，亦未发现畸形存在，进一步证明了我们的治疗是安全的、无毒的。
权利要求
1.组织原位高表达ILK蛋白载体，其特征在于所述表达载体包含编码人类ILK蛋白的基因。
2.根据权利要求I所述的组织原位高表达ILK蛋白载体，其特征在于所述编码人类ILK蛋白的基因序列具有SEQ ID No. I所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求I所述的组织原位高表达ILK蛋白载体，其特征在于所述编码人类ILK蛋白的基因序列具有SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求I所述的组织原位高表达ILK蛋白载体的应用，其特征在于组织原位高表达ILK蛋白载体采用血管内注射制剂、皮下注射制剂以及病灶器官局部组织注射制剂。
5.根据权利要求4所述的组织原位高表达ILK蛋白载体的应用，其特征在于血管注射的制剂最优选是冠状动脉注射制剂。
6.根据权利要求I所述的组织原位高表达ILK蛋白载体，其特征在于作为治疗心力衰竭的药物的应用。
7.根据权利要求I所述的组织原位高表达ILK蛋白载体制备方法，其步骤在于 (1)通过人cDNA文库扩增野生型ILKcDNA,并在ILK cDNA上下游引物分别引入ScaI和XhoI位点以亚克隆至pShuttle，形成穿梭质粒pShuttle_ILK，PCR产物经DNA测序确认； (2)挑选LOg阳性重组质粒pShuttle-ILK,经PmeI线性化后转化入含pAdEasy-Ι高效感受态大肠杆菌BJ5183，在含卡那霉素LB琼脂培养基中37°C孵育过夜； (3)经同源重组，BJ5183内产生重组的AdEasy质粒； (4)同源重组质粒pAd-ILK确认挑选部分克隆置于3-5ml含卡那霉素的LB培养基中37°C，225-250rpm振荡培养过夜，小量提取pAd-ILK。pAd-ILK的鉴定采用PacI酶切法，PAd-ILK经PacI酶切后O. 8%琼脂糖-TAE胶电泳； (5)将7X106HEK293A细胞铺于IOOmm培养皿，转染时细胞汇合率达80%； (6)先用OptiMEM培养基冲洗一次细胞，每个培养皿内加入5mlOptiMEM培养基； (7)取15μ g重组质粒pAd-ILK，经PacI酶切线性化后转染入HEK293A细胞，转染试剂米用 Lipofectamine2000 (Invitrogen 公司)； (8)通过观察转染细胞的细胞病理效应了解感染进程，在转染7-10天后收集细胞，经干冰反复冻融3次获得Ad-ILK病毒保存液； (9)空载腺病毒Ad-null用相似方法,通过空载穿梭质粒pShuttle_CMV与pAdeasy-1重组制备，得组织原位高表达ILK蛋白载体。
全文摘要
本发明涉及组织原位高表达ILK蛋白载体的制备方法及其应用。本发明技术方案是表达载体包含编码人类ILK蛋白的基因，涉及具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。本发明解决了治疗慢性心力衰竭疾病的药物仍然不可避免地进展到终末期心力衰竭，CRT治疗极为昂贵，且只对左右心室收缩不同步的患者有效等缺陷。本发明的药物在病灶组织内特异性转染，转染效率高，同时对感染的细胞毒性极小，操作较简单，并发症少等；ILK治疗组心肌中CD45阳性细胞明显减少，提示高表达ILK可以抑制炎症细胞向局部组织浸润；未发现特异性的损伤及肿瘤形成，亦未发现畸形存在，且无毒的。
文档编号A61K48/00GK102876696SQ20121034894
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月14日 优先权日2012年5月7日
发明者徐标, 白剑, 谢峻 申请人:南京大学医学院附属鼓楼医院