专利名称：负载抗菌肽的壳聚糖/γ-聚谷氨酸复合纳米粒子的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种长效安全的抗菌纳米材料的制备方法，具体涉及一种负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸复合纳米粒子的制备方法，属于医药工程技术领域。
背景技术：
抗菌肽又称抗微生物肽或肽抗生素，在动植物体内分布广泛，是天然免疫防御系统的一部分。抗菌肽不仅有广谱抗菌能力，而且对真菌、病毒及癌细胞也有作用。近年来，由于药物的滥用，药物残留和细菌耐药性等问题日渐严重，从而引发了人们对食品和环境的关注，越来越多的国家开始呼吁禁止滥用抗生素。而抗菌肽因其独特的生物活性，以及不同于传统抗生素的特殊作用机理，已引起了人们极大的研究兴趣，成为分子生物学和生物医学研究领域的热点之一。天然抗菌肽通常是由30多个氨基酸残基组成的碱性小分子多肽，水溶性好，分子量大约在1. 8^4. OkDa之间。大部分抗菌肽具有热稳定性，在100°C下加热l(Tl5min仍能够保持其活性。多数抗菌肽的等电点大于7，表现出较强的阳离子特征。研究表明，抗菌肽分子通过膜内分子间的位移而相互聚集在一起，从而在膜上形成离子通道，使膜蛋白凝集，使细菌不能保持正常的渗透压而死亡。也有科学家认为是通过影响细胞膜上的能量运转和代谢，从而损伤细胞呼吸链的功能而杀死细菌。总之，抗菌肽的作用机理的关键在于通过物理方式和细胞壁发生作用而产生 的抗菌活性。抗菌肽只对原核生物细胞和真核生物病变细胞有抗菌作用，对正常的真核细胞不起作用。原因在于原核生物和正常真核生物的细胞膜结构不同，正常真核生物细胞膜中含有大量的胆固醇，而胆固醇的存在使膜结构趋于稳定。此夕卜，高等动物存在高度发达的细胞骨架系统，其存在也抵抗了抗菌肽的作用。因此，抗菌肽天然就存在靶向性，其能够靶向抗菌，而不会破坏正常高等动物细胞。但是，抗菌肽被广泛应用的障碍是天然资源有限，而化学合成和基因工程等合成技术还不够成熟，合成抗菌肽成本较高，所以目前在实际应用过程中，就需要一种高效的负载方式，来包埋抗菌肽。高聚物纳米材料作为药物载体已经获得广泛研究。对于亲水性抗菌肽的包埋，可以选择利用壳聚糖和Y -聚谷氨酸(Y -PGA)作为载体材料，通过壳聚糖和Y -聚谷氨酸之间离子交联，制备纳米载体。这种纳米载体的优点是不使用有毒溶剂，制备条件较缓和。这可以避免有机溶剂的存在使抗菌肽不稳定，而发生降解。目前，壳聚糖与Y-聚谷氨酸通过离子交联法制备纳米粒子的研究并不很多，现有的相关研究并没有获得既能够大大降低突释率，又能够获得缓慢药物释放的高效的药物包埋纳米体系。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种负载抗菌肽的壳聚糖/Y-聚谷氨酸复合纳米粒子的制备方法，制得的负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸复合纳米粒子能减少抗菌肽的初期突释，有效延长药物的释放时间，达到高效使用抗菌肽的目的。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案一种负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸复合纳米粒子的制备方法，是以质量比为50 10^50 :f 50的壳聚糖、Y-聚谷氨酸和抗菌肽为原料，首先是通过Y-聚谷氨酸与抗菌肽之间的离子交联作用制备成Y -聚谷氨酸/抗菌肽复合纳米粒子，然后再利用壳聚糖与Y-聚谷氨酸之间存在离子交联作用，对制备的Y-聚谷氨酸/抗菌肽复合纳米粒子进行再包裹，得到负载抗菌肽的壳聚糖/Y-聚谷氨酸复合纳米粒子；具体包括如下步骤(I)将O. 5 5. Omg/mL的Y -聚谷氨酸水溶液与O. ΟΓ Ο. Omg/mL的抗菌肽水溶液混合，不断搅拌至有蓝色荧光出现并稳定存在，即得到Y-聚谷氨酸/抗菌肽复合纳米粒子溶液；(2)取步骤(I)得到的Y -聚谷氨酸/抗菌肽复合纳米粒子溶液滴于壳聚糖醋酸水溶液中，所述壳聚糖醋酸水溶液中壳聚糖浓度为O. 5^5. Omg/ml，醋酸体积浓度为f 3%，不断搅拌至有蓝色荧光出现并稳定存在，不会出现沉淀和絮凝现象，然后离心，取沉淀冷冻干燥，即得负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸复合纳米粒子。本发明中，所述的壳聚糖的脱乙酰度为85% 95%，分子量15 150万。在本发明中，壳聚糖的脱乙酰度和分子量对于纳米粒子的性能影响不大。
本发明中，所述的Y-聚谷氨酸纯度在92. 0%与99%之间，分子量10(Tl45万。本发明中，所述的抗菌肽等电点大于7，可以是各类哺乳动物抗菌肽、两栖动物抗菌肽、昆虫动物抗菌肽、植物抗菌肽、细菌抗菌肽和病毒抗菌肽，本发明中主要以人源抗菌肽LL-37为例进行说明。进一步，原料壳聚糖的浓度范围优选为2. 5^5. Omg/mL、Y -聚谷氨酸浓度优选为2. 5^5. Omg/mL、抗菌肽的浓度优选为O. 4 10. Omg/mL ;壳聚糖、Y -聚谷氨酸和抗菌肽的质量比优选为50 :25 50 :5 50。本发明所使用的壳聚糖和Y-聚谷氨酸是可在体内降解的高分子医用材料，生物相容性好，对人体无害；而抗菌肽被包埋在壳聚糖/ Y -聚谷氨酸复合纳米粒子内，可以得到更好的保护，提高药物稳定性和利用率。本发明所述的负载抗菌肽的壳聚糖/Y-聚谷氨酸复合纳米粒子的载药量为18. 69Γ41. 7%，包封率为30. 29Γ79. 3%, 60小时内的释放量为60. 7% 97. 1%。与现有技术相比，本发明的有益效果在于本发明操作简单，制得的负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸复合纳米粒子，可以调节抗菌肽的释放速度，减少给药次数，增加了抗菌肽治疗的安全性、高效性和可靠性，是比较优良的载药纳米体系。
图1中，A是实施例1负载抗菌肽的壳聚糖/Y-聚谷氨酸纳米粒子的差示扫描量热分析谱图；B是实施例2负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸纳米粒子的差示扫描量热分析谱图；C是实施例3负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸纳米粒子的差示扫描量热分析谱图。图2中，A是实施例1负载抗菌肽的壳聚糖/Y-聚谷氨酸复合纳米粒子的透射电镜照片出是实施例2负载抗菌肽的壳聚糖/γ-聚谷氨酸复合纳米粒子的透射电镜照片；C是实施例3负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸复合纳米粒子的透射电镜照片。图3中，A是实施例1负载抗菌肽的壳聚糖/Y-聚谷氨酸复合纳米粒子的体外释放曲线示意图；B是实施例2负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸复合纳米粒子的体外释放曲线示意图；C是实施例3负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸复合纳米粒子的体外释放曲线示意图。
具体实施例方式下面以具体实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此实施例1 :所要制备的负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸纳米粒子，具体重量百分比为壳聚糖/Y-聚谷氨酸/抗菌肽=50/10/1，制备过程如下①壳聚糖溶液的配置将壳聚糖(脱乙酰度为85%，分子量15万)50. Omg溶于100. OmL的1%的稀醋酸溶液中，室温下搅拌,配成O. 5mg/mL的壳聚糖醋酸溶液。②将O. 5mg/mL的Y -聚谷氨酸(纯度92%，分子量100万)水溶液与O. 01mg/mL的抗菌肽水溶液10 1体积比混合，不断搅拌至有微弱蓝色荧光出现并稳定存在，即得到Y-聚谷氨酸/抗菌肽复合纳米粒子溶液；取适量Y -聚谷氨酸/抗菌肽复合纳米粒子溶液，滴于一定体积的浓度为O. 5mg/mL的壳聚糖稀醋酸溶液中，使得壳聚糖/ Y -聚谷氨酸/抗菌肽(质量比)=50/10/1并不断磁力搅拌，至有蓝色荧光出现，并稳定存在(记为A纳米溶液)；③将A纳米溶液低温高速(4°C，20000g)离心，去掉上清液，沉淀冷冻干燥，得到干燥的负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸复合纳米粒子。图1的A是本发明的负载抗菌肽的壳聚糖/Y-聚谷氨酸复合纳米粒子的差示扫描量热分析谱图。据图1的A是本发明的负载抗菌肽的Y-聚谷氨酸纳米粒子有较高的热稳定性，在220°C才出现分解，并且在150°C表示壳聚糖的玻璃化转变的台阶消失了，这正说明了壳聚糖与抗菌肽和Y-聚谷氨酸之间的作用较充分。图2的A是本发明的负载抗菌肽的壳聚糖/Y-聚谷氨酸复合纳米粒子的透射电镜照片。图3的A是本发明的负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸复合纳米粒子的体外释放曲线。据图3的A所示，本发明的负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸复合纳米粒子药物突释较小，同时出现了明显的缓释特征。表I中对应的是本发明的负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸复合纳米粒子的理化性能，其中载药量和包封率都是三次实验取得的平均值，由表I可以看出实施例1中的样品的载药量和包封率均较低，分别为18. 6%和30. 2%。这种复合纳米粒子的粒径较大，为351. 3nm，但是Zeta电位为+42. 54mV，其纳米溶液非常稳定。实施例2 :所要制备的负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸纳米粒子，具体重量百分比为壳聚糖/Y-聚谷氨酸/抗菌肽=50/25/5，制备过程如下①壳聚糖溶液的配置将壳聚糖(脱乙酰度为90%，分子量88万)250. Omg溶于100. OmL的2%的稀醋酸溶液中，室温下搅拌，配成2. 5mg/mL的壳聚糖醋酸溶液。
②将2. 5mg/mL的Y -聚谷氨酸水溶液(纯度95%，分子量120万)与O. 4mg/mL的抗菌肽水溶液4 :5体积比混合，不断搅拌至有蓝色荧光出现并稳定存在，即得到Y-聚谷氨酸/抗菌肽复合纳米粒子溶液；取适量Y-聚谷氨酸/抗菌肽复合纳米粒子溶液，滴于一定体积的浓度为2. 5mg/mL的壳聚糖醋酸溶液，使得壳聚糖/ Y _聚谷氨酸/抗菌肽(质量比)=50/25/5，并不断磁力搅拌，至有蓝色荧光出现，并稳定存在(记为B纳米溶液)；③将B纳米溶液低温高速(4°C，20000g)离心，去掉上清液，沉淀冷冻干燥，即得到干燥的负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸复合纳米粒子。图1的B是本发明的负载抗菌肽的壳聚糖/Y-聚谷氨酸复合纳米粒子的差示扫描量热分析谱图。图2的B是本发明的负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸复合纳米粒子的透射电镜照片。图2的B显示，所制得的纳米粒子以纳米束的形式出现，并且每个纳米束的尺寸都不大，约为IOOnm左右。图3的B是本发明的负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸复合纳米粒子的体外释放曲线示意图，据图3的B所示，本发明的负载抗菌肽的壳聚糖/Y-聚谷氨酸纳米粒子的突释显著降低，同时抗菌肽的体外缓释效果更加显著。表I中对应的是本发明的负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸复合纳米粒子的理化性能，其中载药量和包封率有了显著增大，分别为41. 7%和61. 0%，平均粒径减小至92. 6nm, Zeta电位为+38. 69，其纳米溶液较稳定。
实施例3 :所要制备的负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸纳米粒子，具体重量百分比为壳聚糖/Y-聚谷氨酸/抗菌肽=50/50/50，制备过程如下①壳聚糖溶液的配置将壳聚糖(脱乙酰度为95%，分子量150万)500. Omg溶于100. OmL的3%的稀醋酸溶液中，室温下搅拌,配成5. Omg/mL的壳聚糖醋酸溶液。②将5. Omg/mL的Y -聚谷氨酸水溶液(纯度99%，分子量145万)与10. Omg/mL的抗菌肽水溶液2 :1体积比混合，不断搅拌至有蓝色荧光出现并稳定存在，即得到Y-聚谷氨酸/抗菌肽复合纳米粒子溶液；取适量Y -聚谷氨酸/抗菌肽复合纳米粒子溶液，滴于一定体积的浓度为5. Omg/mL的壳聚糖醋酸溶液中，使得壳聚糖/ Y _聚谷氨酸/抗菌肽(质量t匕)=50/50/50，并不断磁力搅拌，至有蓝色荧光稳定存在(记为C纳米溶液)；③将C纳米溶液低温高速(4°C，20000g)离心，去掉上清液，沉淀冷冻干燥，得到干燥的负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸复合纳米粒子。图1的C是本发明的负载抗菌肽的壳聚糖/Y-聚谷氨酸复合纳米粒子的差示扫描量热分析谱图。据图1的C所示，本发明的负载抗菌肽的壳聚糖/Y-聚谷氨酸纳米粒子有较高的热稳定性，其分解峰值温度与实施例2中的DSC曲线相比，没有显著的区别。图2的C是本发明的负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸复合纳米粒子的透射电镜照片。据图2的C所示，所制得的纳米粒子以纳米束的形式出现，并且每个纳米束的尺寸都较大，约为IOOOnm左右，每个纳米束中都聚集了很多小的纳米粒子，这应该是壳聚糖对Y-聚谷氨酸/抗菌肽复合纳米粒子进行再包裹导致的。图3的C是本发明的负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸复合纳米粒子的体外释放曲线示意图，据图3的C所示，本发明的负载抗菌肽的壳聚糖/ Y-聚谷氨酸复合纳米粒子的药物突释比实施例2中的要大。表I中对应的是本发明的负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸复合纳米粒子的理化性能，由表I可以看出载药量和包封率分别达到34. 8%和79. 3%，平均粒径为703. 6nm, Zeta电位为+25. 44mV，其纳米溶液也能稳定存在。表I
权利要求
1.一种负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸复合纳米粒子的制备方法，其特征在于所述制备方法是以质量比为50 :1(T50 50的壳聚糖、Y-聚谷氨酸和抗菌肽为原料，具体包括如下步骤 (1)将O.5^5. Omg/mL的Y-聚谷氨酸水溶液与O. ΟΓ Ο. Omg/mL的抗菌肽水溶液混合，不断搅拌至有蓝色荧光出现并稳定存在，即得到Y-聚谷氨酸/抗菌肽复合纳米粒子溶液； (2)取步骤(I)得到的Y-聚谷氨酸/抗菌肽复合纳米粒子溶液滴于壳聚糖醋酸水溶液中，所述壳聚糖醋酸水溶液中壳聚糖浓度为O. 5^5. Omg/mL，醋酸体积浓度为Γ3%，不断搅拌至有蓝色荧光出现并稳定存在，离心，取沉淀冷冻干燥，即得负载抗菌肽的壳聚糖/Y-聚谷氨酸复合纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的负载抗菌肽的壳聚糖/Y -聚谷氨酸复合纳米粒子的制备方法，其特征在于所述的壳聚糖的脱乙酰度为85% 95%，分子量15 150万。
3.根据权利要求1所述的负载抗菌肽的壳聚糖/Y -聚谷氨酸复合纳米粒子的制备方法，其特征在于所述的Y-聚谷氨酸纯度在92. 0%与99. 0%之间，分子量10(Γ145万。
4.根据权利要求1所述的负载抗菌肽的壳聚糖/Y -聚谷氨酸复合纳米粒子的制备方法，其特征在于所述的抗菌肽是人源抗菌肽LL-37。
5.根据权利要求Γ4之一所述的负载抗菌肽的壳聚糖/Y -聚谷氨酸复合纳米粒子的制备方法，其特征在于所述步骤(I)中，Y-聚谷氨酸水溶液的浓度为2. 5^5. 0mg/mL，抗菌肽水溶液的浓度为0. Γ10. Omg/mL。
6.根据权利要求f4之一所述的负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸复合纳米粒子的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中，壳聚糖醋酸水溶液中壳聚糖的浓度为2. 5^5. Omg/mLo
7.根据权利要求f4之一所述的负载抗菌肽的壳聚糖/ Y -聚谷氨酸复合纳米粒子的制备方法，其特征在于控制原料壳聚糖、Y-聚谷氨酸和抗菌肽的质量比为50 25^50 ·5 50。
全文摘要
本发明公开了一种负载抗菌肽的壳聚糖/γ-聚谷氨酸复合纳米粒子的制备方法，其特征在于所述制备方法具体包括如下步骤(1)将0.5~5.0mg/mL的γ-聚谷氨酸水溶液与0.01~10.0mg/mL的抗菌肽水溶液混合，不断搅拌至有蓝色荧光出现并稳定存在，即得到γ-聚谷氨酸/抗菌肽复合纳米粒子溶液；(2)取γ-聚谷氨酸/抗菌肽复合纳米粒子溶液滴于壳聚糖醋酸水溶液中，所述壳聚糖醋酸水溶液中壳聚糖浓度为0.5~5.0mg/mL，醋酸体积浓度为1~3%，不断搅拌至有蓝色荧光出现并稳定存在，离心，取沉淀冷冻干燥，即得负载抗菌肽的壳聚糖/γ-聚谷氨酸复合纳米粒子。本发明制得的负载抗菌肽的壳聚糖/γ-聚谷氨酸复合纳米粒子能减少抗菌肽的初期突释，有效延长药物的释放时间，达到高效使用抗菌肽的目的。
文档编号A61K9/14GK103041400SQ20121035325
公开日2013年4月17日 申请日期2012年9月20日 优先权日2012年9月20日
发明者孙燕, 柳永, 许尧兴, 符思达, 曹勇, 王磊 申请人:杭州师范大学, 浙江省农业科学院